大鼠视神经夹伤模型中莫尼定的视网膜节细胞保护作用

目的 :研究莫尼定对大鼠视神经夹伤模型视网膜神经节细胞的保护作用。方法 :实验用SD大鼠 2 0只随机分为用药组 8只和对照组 12只。所有大鼠右眼用 40 g微型视神经夹紧贴球后夹持视神经 60秒 ,左眼未做夹持。用药组于夹伤前1小时及夹伤后每日腹腔注射莫尼定 1mg/kg ,阴性对照组于夹伤前 1小时及夹伤后每日腹腔注射生理盐水 5ml/kg ,实验观察2 8天。实验结束前 4天双上丘注射 3 %荧光金逆行标记视网膜神经节细胞。做视网膜铺片 ,距离视乳头中心上下左右各2mm拍摄照片 ,使用CPAS图像分析软件做节细胞定量分析 ,节细胞存活率 =右眼节细胞密度 /左眼节细胞密度× 10 0。结果 :用药组、对照组节细胞存活率分别为 61 0 1%和 53 48% ,两者之间存在显著性差异 (P =0 .0 3 5)。结论 :在大鼠视神经夹伤模型中 ,莫尼定具有明显的视网膜节细胞保护作用     

Cop-1诱导的自体免疫反应对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的建立慢性高眼压大鼠Cop-1免疫模型,从形态学上观察Cop-1诱导的自体免疫对视网膜神经节细胞的影响。方法将动物分为正常组、高眼压组及高眼压免疫组。用巩膜浅层静脉烧烙法建立大鼠慢性高眼压模型。高眼压免疫组在建立高眼压模型后即刻于大鼠后肢皮下注射200μg Cop-1,2周及4周后重复注射200μg Cop-1。8周后,从心脏取血,离心取上清液,用ELISA检测Cop-1抗体效价。组织切片行常规HE染色,光镜下对节细胞层细胞数进行计数。以TUNEL染色检测视网膜神经节细胞凋亡。结果Cop-1免疫大鼠后8周,血清中Cop-1抗体呈阳性,效价高于1∶1000。正常组视网膜神经节细胞计数平均为(22.5±1.18)个,高眼压组视网膜神经节细胞计数平均为(15.5±0.85)个,高眼压免疫组为(20.5±1.43)个。统计学分析显示,高眼压免疫组及正常组视网膜神经节细胞数明显高于高眼压组(P<0.01),而正常组与高眼压免疫组之间视网膜神经节细胞数没有明显差异(P>0.05)。TUNEL染色显示高眼压组视网膜神经节细胞凋亡数明显高于另外两组。结论Cop-1诱导的自体免疫反应可以对高眼压状态下的视网膜神经节细胞起到保护作用,减少视网膜神经节细胞的凋亡。     

乳鼠视网膜细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为视网膜神经节样细胞

目的 探讨乳鼠视网膜细胞对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的诱导分化作用.方法 从出生8 d的大鼠骨髓中分离培养BMSCs,同时培养乳鼠视网膜神经细胞.在Transwell双层培养体系下,利用乳鼠视网膜细胞诱导BMSCs,诱导后细胞经RT-PCR及免疫荧光鉴定.结果 加入乳鼠视网膜细胞共培养第7 d有神经元样细胞形成,经nestin、NF、β-III Tubulin、Thy1.1行免疫组织化学、RT-PCR、免疫荧光鉴定,细胞呈阳性反应.结论 BMSCs在体外培养条件下,经过新生乳鼠视网膜细胞诱导,可以分化为视网膜神经节样细胞.     

视网膜神经节细胞无血清上清培养液诱导大鼠视网膜干细胞的分化

目的　探讨视网膜神经节细胞无血清上清培养液对视网膜干细胞分化的影响。方法　分离大鼠视网膜干细胞和视网膜神经节细胞;采用免疫荧光法鉴定体外培养的大鼠视网膜干细胞与视网膜神经节细胞,视网膜干细胞以Nestin抗体进行鉴定,视网膜神经节细胞以Thy-1抗体进行鉴定;以视网膜神经节细胞无血清上清培养液培养视网膜干细胞,以不加入条件培养液培养的视网膜干细胞为对照组,收集分化细胞,采用qPCR法检测Nestin、Pax6、Thy-1及Brn-3的基因表达。结果　培养的视网膜干细胞Nestin抗体染色阳性,视网膜神经节细胞Thy-1抗体染色阳性。培养视网膜干细胞72 h后,与对照组相比,无血清上清培养液组细胞Nestin和PAX6基因相对表达量降低,差异均有统计学意义（均为P<0.000 1）;Thy-1和Brn-3基因相对表达量升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　视网膜神经节细胞无血清上清培养液能够诱导视网膜干细胞分化为视网膜神经节样细胞。     

姜黄素对急性高眼压家兔的视网膜神经节细胞的保护作用

目的：探讨姜黄素（ Curcumin,Cur）对实验性急性高眼压家兔眼视网膜神经节细胞（ retinal ganglion cells,RGCs）的保护作用。方法：将24只家兔按照随机等分的方法分为3组,即姜黄素干预青光眼模型组（姜黄素组）、未给予姜黄素干预的青光眼模型组（青光眼组）和不经任何干预措施的正常对照组（正常组）。应用前房灌注升高眼压的方法给姜黄素组和青光眼组的家兔建立急性高眼压模型,急性高眼压模型造模成功后,给予姜黄素组家兔玻璃体腔注射比例浓度为0．1mg／0．1mL的姜黄素,青光眼组家兔玻璃体腔注射相同体积的生理盐水,每天注射1次,共7d。正常对照组不做上述任何处理直接取眼球。实验完成后,通过免疫组织化学法检测三组家兔眼球视网膜神经节细胞Thy－1的表达并计数。结果：姜黄素组和正常组的视网膜神经节细胞Thy－1表达之间差异无统计学意义（P＞0．05）;青光眼组和正常组的视网膜神经节细胞Thy－1表达差异有显著统计学意义（P＜0．01）。姜黄素组、正常组和青光眼组的视网膜神经节细胞密度分别为20．3±2．7、21．5±1．8和15．1±2．3个／高倍视野。结论：在姜黄素作用的急性高眼压模型家兔的实验中,姜黄素可以通过提高视网膜神经节细胞的Thy－1的表达,表明其在一定程度上能够降低急性高眼压状态下家兔视网膜神经节细胞的损伤,推测姜黄素可能对视网膜在特定情况下具有一定的保护作用。     

烧灼大鼠表层巩膜静脉法诱导慢性青光眼模型的研究

目的 利用大鼠建立慢性青光眼模型。方法 选用成年Wistar大鼠，左眼为实验眼，右眼为对照眼，找到实验眼的4条表层巩膜静脉，烧灼其中3条。定期测量和记录双眼眼压，观察眼前节情况；测量和比较双眼角膜水平直径大小。分别于烧灼后2、4、6个月时摘除双侧眼球。观察大鼠视网膜及视盘的组织形态学改变、双眼视网膜厚度和视网膜神经节细胞数目变化。结果 (1)一次性实验操作可使眼压持续升高至少6个月。(2)眼前节无明显并发症。(3)实验期间，角膜水平直径大小无改变。(4)视网膜厚度明显变薄，视网膜神经节细胞数明显减少，视盘凹陷逐渐扩大和加深。结论 通过烧灼大鼠表层巩膜静脉可获得长期眼压中度升高的慢性青光眼模型。     

利用荧光金逆行示踪技术评价视神经不完全损伤后视网膜神经节细胞的存活率

目的　利用荧光金逆行示踪技术评价正常及视神经不完全损伤后的视网膜神经节细胞 (retinalganglioncells,RGCs)的数目。 方法　正常成年LongEvans大鼠 2 0只 ,体重(2 70± 2 0 ) g ,雌雄不限。按对照组、损伤后 7d、14d、2 1d分组 ,每组 5只大鼠。在球后视神经钳夹伤前 7d行荧光金逆行标记。 7d后损伤组大鼠用反向血管夹于左眼球后 2mm处夹视神经 10s。对照组大鼠只暴露视神经不行钳夹 ,分别于各时间点将大鼠用 4 %多聚甲醛灌注固定后 ,行全视网膜铺片 ,3h内在荧光显微镜下观察。在每张视网膜的上、下、鼻、颞侧距视盘 1/ 6、1/ 2、5 / 6半径处共拍摄 12张荧光照片。对照片上标记的RGCs进行计数 ,求平均值 ,计算损伤后各时间点剩余的RGCs与正常视网膜中RGCs的百分比。结果　视网膜铺片的RGCs边界清晰 ,并可见明显的细胞突起 ,血管走行区未见节细胞分布。正常组每张铺片的平均节细胞数为 (2 0 31± 2 87)个·mm-2 ,损伤后 7d的RGCs存活率为 71% ,14d存活率为 5 1% ,2 1d存活率为 35 %。结论　荧光金逆行标记是评价视神经损伤后RGCs存活率可靠并且有效的方法。     

视网膜神经节细胞与Müller细胞共培养的方法研究

目的　建立一种简单的体外培养视网膜神经节细胞的方法。方法　采用Thy1 1单克隆抗体免疫吸附得到纯化的视网膜神经节细胞 ,将其接种于纯化培养的视网膜M櫣ｌｌｅｒ细胞上 ,在无血清培养液中共同培养。结果　视网膜神经节细胞在接种后 1d即可生长出短小的突起 ,至第 5d突起不断增长并可长出二级分支。结论　M櫣ｌｌｅｒ细胞在无血清培养液中 ,对体外培养的神经节细胞具有很好的支持营养作用。     

应用流式细胞分选技术高效纯化大鼠视网膜神经节细胞及其鉴定

目的探索一种高效、稳定的纯化视网膜神经节细胞(RGC)方法。方法结合免疫抗体吸附方法,利用流式细胞仪分离新生大鼠RGC,并采用流式细胞及荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测分选RGC的纯度。结果新生SD大鼠视网膜混合细胞为(4.37±0.22)×10~6个/视网膜,通过流式细胞仪分离出Thy1.1阳性的RGC为(5.70±0.21)×10~3个/视网膜;荧光定量PCR及流式细胞分析结果均显示此方法分离的RGC细胞纯度高,可达90.11%,且纯度高低可控。结论通过流式细胞分选技术可获得较高纯度的RGC。该方法分选速度快、稳定,为深入开展RGC的体外研究,提供了一种理想的、基于流式细胞仪的细胞快速分离纯化方法。     

Notch-1调控视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化

目的研究Notch-1对视网膜前体细胞(RPC)向视网膜神经节细胞(RGC)分化的调控作用。方法分离培养胚胎14 d龄Sprague-Dawley大鼠的RPC，实验组和对照组分别用含有Notch-1反义寡核苷酸链和无关序列寡核苷酸链的培养液进行诱导分化14 d，倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况，Thy1.1标记RGC并进行计数。结果实验组和对照组的RPC都能分化为多种视网膜细胞类型，包括Thy1.1阳性的RGC，但两组RPC向RGC分化的百分比不同。实验组和对照组RGC的百分比分别为(16.57±4.31)%和(31.19±6.90)%，两组比较差异有统计学意义（t=9.84,P＜0.001）。结论Notch-1对RPC的分化具有负向调控作用，阻断Notch-1能促进RPC向RGC分化。(中华眼底病杂志, 2007, 23: 101-103)     

GDNF家族成员artemin在大鼠视网膜神经节细胞中的表达及其功能

目的观察胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）家族成员artemin在正常大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）中的分布、表达及其功能。方法体外培养出生1～3d SD乳鼠的视网膜神经上皮细胞,免疫荧光染色检测RGCs中artemin的定位及表达,实时定量聚合酶链反应（real—time PCR）对RGCs中artemin进行定量检测。并用40mmol／L葡萄糖处理细胞12h后,再进行上述检测,观察高糖对于RGCs中artemin表达的影响。结果免疫荧光的结果证实了培养的RGCs出现Thy1．1抗体阳性的红色荧光,且多重荧光标记显示RGCs同时存在显示绿色荧光的artelnin抗体和红色荧光的Thy1．1抗体,表明artemin在RGCs中有分布。正常对照组中Thy1．1抗体阳性的细胞为（442±9）个／高倍视野,而40mmol／L高糖培养组中为（263±7）个／高倍视野,差异有统计学意义（P〈0．05）。Real—time PCR对大鼠RGCs中artemin的mRNA水平进行定量分析,40mmol／L葡萄糖处理视网膜神经细胞12h后,artemin在视网膜神经细胞及RGCs的表达明显下降（P〈0．05）。结论研究发现在原代培养的大鼠视网膜神经细胞及RGCs巾均有artemin的表达,并且在高糖作用下表达下降,为进一步研究artemin对受损RGCs的保护作用提供了思路。     

大鼠视神经挫伤视网膜形态功能变化的动态研究

目的观察视神经夹挫伤后视网膜形态学和视功能动态变化,为视功能评价和视神经保护研究提供依据。方法大鼠视神经夹挫伤后1d、3d、5d7、d、9d、2周4、周8、周1、2周,光镜观察视网膜神经节细胞(RGC)改变,闪光视觉诱发电位(F-VEP)检测视功能状况。结果视神经部分损伤后3d到1周内视网膜神经节细胞快速减少,2周以后缓慢减少,4周几乎无明显变化;视神经损伤1d,F-VEP波形变得低而宽,前2周呈进行性下降期,4周后变化平稳,并显示恢复迹象。结论神经节细胞继发性损伤是视功能进行性下降的重要原因,一定数量存活的视网膜节细胞是视功能恢复的基础;神经损伤变化和视功能变化与时间具有一定的相关性,这些对于正确评价视功能状况和预后有极重要的意义。     

壳聚糖对分层及纯化培养的视网膜神经节细胞生长的促进作用

目的 研究壳聚糖对体外培养的鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)生长的影响.方法 取SD乳鼠视网膜,将视网膜分为内层、外层及全层后,分别制成细胞悬液,各自进行培养.实验组加入含100g· L-1壳聚糖的培养基,对照组不加壳聚糖.每天观察细胞生长状态,用MTT比色法检测细胞存活率(OD值).各层细胞分别用Thy1.1抗体鉴定RGC,计算各层细胞的RGC率.两步法提纯RGC,提纯后分别加入含体积分数10％血清、100g· L-1壳聚糖及鼠神经生长因子的培养基,观察细胞生长状态.结果 分层培养细胞的存活率:各层细胞培养后1d、2d存活率最高,MTT比色法结果显示:培养1d后外层OD值为1.189±0.158,内层为1.084±0.150,全层为1.381±0.089;随着培养时间的延长,细胞存活率逐渐降低(P＜0.05):外层OD值3d为0.835±0.120、4d为0.805±0.116、5d为0.782±0.107;内层OD值:3d为0.388±0.095、4d为0.371±0.084、5d为0.347±0.052;全层OD值:3d为0.523±0.047、4d为0.340±0.084、5d为0.227±0.057;相同时间点实验组(壳聚糖组)比对照组(不含壳聚糖)的存活率高,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).经细胞免疫组化鉴定,内层RGC％最高(19.248±0.999)％,其次为全层(4.986±0.635)％,外层最低(0.748±0.177)％.两步法提纯神经节细胞:提纯率可达95％以上.纯化的神经节细胞培养2d后测量最大轴突长度,壳聚糖组:62.5 μm、NGF组:37.5 μm、空白对照组:12.5μm,壳聚糖组及NGF组轴突均比对照组长.结论 混合培养的各层细胞中,内层细胞的节细胞率最高.在混合培养的各层细胞中加入壳聚糖,能促进其生长并提高存活率.加入壳聚糖或鼠神经营养因子后,能促进纯化的RGC的生长.     

胚胎干细胞源性视网膜前体细胞在rd鼠视网膜下腔移植后的分化

目的 研究绿色荧光蛋白标记的胚胎干细胞(green fluorescent protein-embryonic stem cells,GFP-ESC)源性视网膜前体细胞在rd小鼠视网膜下腔移植后的存活分化情况.方法 将GFP-ESC 源性视网膜前体细胞移植到伴有视网膜感光细胞变性和继发性视网膜神经节细胞变性的rd 小鼠视网膜下腔,移植后1周、4周、8周取材行免疫荧光细胞化学检测,观察移植细胞存活、分化情况.对移植细胞进行核型分析,并接种裸鼠眼内观察是否成瘤,评价其安全性.结果 GFP-ESC 源性视网膜前体细胞移植眼内可存活、整合到宿主变性视网膜层间.1周时 GFP 阳性细胞移行于外层视网膜并呈视杆细胞标志抗原rhodop-sin阳性:4周时整合于内层视网膜,共表达成熟神经元标志抗原神经丝蛋白-200、微管相关蛋白-2,突触标志抗原synaptophysin检测阳性;8周时移至邻近玻璃体腔形成节细胞样结构,表达节细胞标志抗原Thy1.1;移植细胞维持正常二倍体核型,术后8周未见排斥反应及瘤性增殖.结论 GFP-ESC源性视网膜前体细胞在变性视网膜中可存活、整合,并有优先向变性的感光细胞及.神经节细胞类型分化的倾向,有望为青光眼等视神经视网膜病变的细胞移植治疗提供安全有效的种子细胞.     

体外诱导大鼠视网膜Müller细胞向神经节细胞定向分化的研究

目的 研究鼠视网膜Müller细胞经体外条件培养基诱导后去分化为神经干细胞及进一步定向分化成神经节样细胞的特性.方法 实验研究.体外培养出生后7-10 d的Sprague Dawley大鼠视网膜Müller细胞,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法及免疫荧光染色法鉴定Müller细胞纯度.取培养的第3或4代Müller细胞,用含有N2、碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的Delbeccon's modified Eagle's medium(DMEM)-F12干细胞条件培养基培养3～5 d后,再用含5%胎牛血清、脑源性神经营养因子和视黄酸的DMEM培养基诱导分化7～10 d,采用免疫荧光染色法分别鉴定去分化及再诱导分化后的细胞.结果 RT-PCR及免疫荧光染色结果显示,分离培养的视网膜Müller细胞纯度可达(95.17±2.68)%以上.干细胞条件培养基培养3～5 d后,大部分Müller细胞汇集形成细胞球,经免疫荧光染色法鉴定,显示细胞球内(95.26 ±1.35)%以上的细胞Nestin表达阳性,(90.33±4.12)%以上细胞BrdU表达阳性.将这些细胞球进一步诱导分化后,可见细胞球内细胞可向外扩展、铺开,分化出形态各异的细胞,其中约(21.14±1.49)%细胞表达神经节细胞特异性标记物Thy1.1阳性.结论 成年啮齿动物视网膜Müller细胞经体外条件培养基诱导后,可以产生具有增殖能力和分化潜能的神经干细胞,并可进一步定向分化为神经节样细胞,这为干细胞研究和视神经再生治疗等提供了新的方法和手段.     

新生大鼠视网膜神经元及节细胞体外短期培养方法

目的　建立新生大鼠视网膜神经元原代培养体系 ,观察视网膜神经元和神经节细胞 (retinalganglioncells,RGC)在体外短期培养的生长特点。方法　将新生大鼠视网膜细胞悬液接种于预先用鼠尾胶原包被的 96孔细胞培养板中 ,按 4 0 0× 10 3 ·cm-2 (高密度 )及 2 0 0× 10 3 ·cm-2 (低密度 ) 2种密度接种 ,抑制非神经元生长 ,MTT比色法评价细胞活力 ;上述细胞悬液按高密度接种于 2 4孔细胞培养板中 ,进行HE染色和Thy1单克隆抗体的免疫化学染色 ,测量视网膜神经元和RGC轴突的长度。结果　视网膜神经细胞有聚集成簇生长的倾向 ,细胞活力在高密度培养时明显高于低密度培养 ;第 3天细胞活力最高 ;视网膜神经元在体外形态多样 ,最初 2d轴突生长速度最快 ,超过 12 .0 μm·d-1;大多数RGC从第 1天就再生出 2个或 2个以上的突起 ,第 1天的平均轴突长度为 12 .5 μm·d-1,从第 2天起保持在8 0 μm·d-1。第 4天的平均轴突长度为 2 9.4 5 μm。结论　以鼠尾胶原为支持物 ,经过酶消化法得到的新生大鼠视网膜神经元 ,包括RGC ,能够在短期内表现出较高的细胞活力并再生出较长的轴突 ;高密度培养 ( 4 0 0× 10 3 ·cm-2 )更有利于视网膜神经元在体外生长存活。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为视网膜神经节样细胞的实验研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外向视网膜神经节细胞（RGCs）方向分化的可能性。方法取成年大鼠BMSCs原代培养，传代后获得高纯度BMSCs。采用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导法，相差显微镜和荧光黄（LY）细胞内染色观察诱导后细胞形态的变化，并采用免疫细胞化学法检测微丝微管相关蛋白-2（MAP-2）、Thy1．1和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果诱导后BMSCs呈现神经元样外观。LY染色可见细胞的多级突起，部分邻近细胞出现LY染色阳性。诱导后的神经元样细胞MAP-2和Thy1．1表达阳性，GFAP表达阴性。结论大鼠BMSCs经bFGF体外诱导可分化为具有RGCs表型的神经元样细胞，诱导后细胞间存在突触联系。     

川芎嗪促进大鼠视网膜神经节细胞轴突再生的实验研究

目的通过在视网膜组织三维立体培养系统中加入不同浓度的川芎嗪溶液,观察川芎嗪对视网膜神经节细胞轴突再生的作用。方法建立体外培养的大鼠视网膜组织三维立体培养系统,将1～3d新生远交群SD（Sprague Dawley）大鼠视网膜切成0．5mm×0．5mm大小的视网膜组织,加入不同浓度（0．125、0．25、0．5、1．0g／L）川芎嗪溶液后,在相差显微镜下动态观察视网膜神经节细胞轴突的生长情况,于加药后第3、6和9天记录再生轴突的数目及长度。结果与对照组相比,各浓度川芎嗪对视网膜神经节细胞轴突生长均有促进作用,以0．5g／L浓度效果最明显,差异有统计学意义（P〈0．05）。免疫组织化学染色显示视网膜神经节细胞的轴突具有明显再生现象。结论一定剂量范围的川芎嗪可促进视网膜神经节细胞轴突再生和伸长。（中国跟耳鼻喉科杂志,2009,9：86—88）     

大鼠视网膜缺血再灌注损伤后脑源性神经生长因子对细胞凋亡及caspase-2和caspase-3表达的影响

目的:探讨caspase-2和caspase-3在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的表达与细胞凋亡的关系及脑源性神经生长因子对其的影响及对视网膜的保护作用。方法:实验于2007-02/2007-07在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。前房加压法制作大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型,28只大鼠随机分为正常组和手术组,其中手术组大鼠左眼为缺血再灌注组,右眼为治疗组(BDNF玻璃体腔注射),手术组又按照再灌注后不同时间段分为1,6,12,24,48,72h组。光学显微镜观察并计数视网膜神经节细胞的数量。应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法(TUNEL)检测视网膜神经节细胞凋亡、免疫组织化学法(SABC)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测视网膜组织中caspase-2和caspase-3的表达情况。结果:正常视网膜未见凋亡细胞表达,缺血后6～24h可见大量凋亡细胞表达,48h开始下降。凋亡细胞在缺血后24h达到高峰,caspase-2缺血6h后逐渐增加,24h达高峰,然后在48至72h下降。caspase-3表达改变与caspase-2改变基本一致。BDNF治疗组各观察指标表达变化规律与缺血组基本一致,但能明显抑制凋亡细胞的表达,同时使caspase-2和caspase-3的表达降低。结论:视网膜缺血再灌注损伤诱导了神经节细胞的凋亡;BDNF可抑制caspase-2和caspase-3的表达,减少神经节细胞凋亡,对视网膜缺血再灌注损伤有治疗作用。     

GAP-43在新生大鼠视网膜及其诱导的骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞分化过程中的表达

目的 探讨生长相关蛋白43(growth associated protein,GAP-43)在新生大鼠视网膜发育过程中及在以新生大鼠视网膜细胞诱导体外培养的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)向视网膜神经节样细胞定向分化中的作用.方法 体外培养新生3 d大乳鼠视网膜细胞,应用免疫细胞化学方法检测GAP-43的表达;提取新生大鼠视网膜细胞总RNA,应用RT-PCR方法检测GAP-43 mRNA的表达.体外培养大鼠BMSC至第3代,经流式细胞仪检测干细胞表面标志物进行鉴定,应用乳鼠视网膜细胞诱导BMSC分化,观察诱导后细胞的形态学变化,并应用免疫细胞化学方法对诱导后第5天的细胞进行神经元及视网膜神经节细胞标志物NSE、nestin、GAP-43、thyl.1鉴定,并应用RT-PCR的方法检测、分析GAP-43 mRNA的表达情况.结果 体外培养的新生大乳鼠视网膜细胞应用免疫细胞化学方法可检测到GAP43阳性表达;RT-PcR方法检测到新生大鼠的GAP-43 mRNA的表达;第3代BMSC经流式细胞仪检测CD71(+)、C LY29(+)、CD34(-)、CD45(-),经与大乳鼠视网膜细胞共培养的方法可诱导BMSC分化为视网膜神经节样细胞,免疫细胞化学染色表明其表达特异性标志物NSE、nestin、GAP-43、thyl.1,分化后的神经节样细胞内可检测到GAP-43 mRNA阳性表达:结论本研究结果显示CAP-43不仅参与了大鼠视网膜发育过程,且GAP-43在以乳鼠视网膜细胞诱导BMsc定向分化为视网膜神经节样细胞这一过程中具有重要意义.