鼠抗CD71单抗轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析

目的 获得鼠抗人CD71分子单抗的轻链及重链可变区基因。方法 用一步法提取总RNA,逆转录形成cDNA,设计并合成一套扩增小鼠重、轻链可变区的通用引物,通过PCR扩增基因．分别克隆人pMD18－T载体中,作核苷酸序列分析。结果用重链引物扩增获得长约350bp的片段,用轻链引物扩增获得长约330bp的片段,序列测定获得它们的DNA序列。结论克隆的重链可变区基因长度为348bp,属于小鼠H链可变区IA亚组;克隆的轻链可变区基因长度为336bp,属于小鼠K轻链可变区Ⅱ亚组。     

鼠抗CD71单抗轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析

目的：获得鼠抗人CD71分子单抗的轻链及重链可变区基因，方法：用一步法提取总RNA，逆转录形成cDNA，设计并合成一套扩增小鼠重，轻链可变区的通用引物，通过PCR扩增基因，分别克隆入pMD18-T载体中，作核苷酸序列分析。结果：用重链引物扩增获得长约350bp的片段，用轻链引物扩增获得长约330bp的片段，序列测定获得它们的DNA序列，结论：克隆的重链可变区基因长度为348bp，属于小鼠H链可变区IA亚组；克隆的轻链可变区基因长度为336bp ，属于小鼠K轻链可变区Ⅱ亚组。     

鼠抗CD4抗体轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析

为获得鼠抗人T细胞分化抗原4分子单抗的轻链及重链可变区基因。采用RT－PCR技术，从WuT4细胞总RNA中扩增出轻链和重链可变区基因，进行克隆并作核苷酸序列分析，发现RT－PCR扩增出来的两条轻链和一条重链可变区基因分别为400bp左右，构建的pMD18T-VL和pMD18T-VH重组克隆载体，酶切与预期结果相符。测序得到它们的DNA序列。结果表明，克隆的两条轻链可变区基因序列一致，长度均为324bp，属于鼠轻链Ⅳ亚类。克隆的重链可变区基因长度为375bp，属于鼠重链Ⅱ(C)亚类。     

重症肌无力单链抗体基因的制备

[目的 ]构建抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体 .[方法 ]应用多聚酶链反应从抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区抗原结合片段扩增重链和轻链可变区基因 ,并克隆到载体噬粒 pHEN2 .将含有单链抗体基因的重组噬粒转化大肠杆菌DH5α ,分离提纯重组噬粒后再经酶切、琼脂糖凝胶电泳检查以确认单链抗体基因的正确性 .[结果 ]电泳检查发现了大小分别为 3 78bp ,3 3 9bp和 762bp的重链可变区、轻链可变区和单链抗体基因 ,且位置正确 .[结论 ]已成功地构建了抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体基因     

利用RLM-RACE克隆抗DR5单克隆抗体重链可变区基因

目的:克隆抗DR5单抗重链可变区基因。方法:使用Trizol从杂交瘤366EC提取总RNA,采用RLM-RACE进行抗体重链可变区基因的扩增。结果:扩增出一个800 bp的基因片段,与小鼠抗体重链可变区基因高度同源。结论:RLM-RACE是一种非常有效的扩增抗体重链可变区基因的方法。     

聚合酶链反应扩增人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因

目的利用二次聚合酶链反应(PCR)扩增人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因,并将其克隆到T载体进行测序验证。方法收集50例动脉粥样硬化患者外周动脉血标本,密度梯度离心法分离淋巴细胞,TR Izol法提取总RNA,用逆转录-PCR扩增轻链可变区基因(包括VK和Vλ)和重链可变区基因(VH),分别酶切后克隆到T载体上,随机挑取2个克隆进行测序验证。结果总RNA的纯度和完整性都较好,经过2次PCR成功扩增出了抗体全套轻、重链可变区基因。测序结果与已有的人抗体基因的序列高度同源。结论该方法成功扩增出了人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因,为下一步噬菌体单链抗体库的构建和筛选奠定了基础。     

RT-PCR扩增人抗HBsAg抗体Fab段基因

目的:采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)的方法从少量外周血中扩增抗HBsAg抗体重链Fd和κ轻链基因。方法：用RNAex试剂提取细胞总RNA，以Olig(dT)引导合成cDNA第一链．再经PCR扩增的方法，以重链Fd和κ轻链基因简并引物．直接从人外周血混合淋巴细胞中扩增出抗HBsAg抗体重链Fd和κ轻链基因。结果：扩增出分子量为700bp的抗HBsAg抗体重链Fd和κ轻链基因。结论：得到的抗体基因为下一步构建含人抗HBsAg抗体Fab段基因的腺相关病毒载体奠定了基础。     

聚合酶链反应扩增人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因

目的 利用二次聚合酶链反应(PCR)扩增人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因,并将其克隆到T载体进行测序验证.方法 收集50例动脉粥样硬化患者外周动脉血标本,密度梯度离心法分离淋巴细胞,TRIzol法提取总RNA,用逆转录-PCR扩增轻链可变区基因(包括VK和Vλ)和重链可变区基因(VH),分别酶切后克隆到T载体上,随机挑取2个克隆进行测序验证.结果 总RNA的纯度和完整性都较好,经过2次PCR成功扩增出了抗体全套轻、重链可变区基因.测序结果与已有的人抗体基因的序列高度同源.结论 该方法成功扩增出了人动脉粥样硬化抗体全套可变区基因,为下一步噬菌体单链抗体库的构建和筛选奠定了基础.     

抗血管内皮生长因子165抗体轻重链可变区基因的克隆与序列分析

目的　 获得抗血管内皮生长因子 1 6 5 ( VEGF1 65)抗体的轻重链可变区基因。 方法　 从分泌具有中和抗血管内皮生长因子 1 6 5活性的单抗杂交瘤细胞株Vm D1 1中提取总 RNA,经 RT- PCR扩增并克隆该单抗的轻、重链可变区基因并进行序列分析。结果　 抗体的轻链可变区基因 32 1 bp,属于小鼠第 亚群 ;重链可变区基因 35 4bp,属于小鼠第 ( B)亚群。结论　 所克隆的基因经核苷酸序列分析分别为抗体的轻、重链可变区基因。     

人抗HBs轻链基因的序列测定及序列分析

目的:获得人源性乙型肝炎病毒抗HBs轻链基因.方法:从已构建的人源性噬菌体抗体库中,用固相化HBs/Ag对构建的人源性噬菌体抗体库进行三轮淘筛,经ELISA实验,筛选到抗HBs噬菌体抗体(P/N:2.415)的阳性克隆,根据已知序列合成一对轻链引物,进行PCR扩增,扩增出轻链目的基因片段,将目的基因片段定向克隆入质粒pUC18,进行序列测定及分析.结果:筛选出的克隆具有HBsAg特异性亲和力,构建了pUCl8-抗HBsk链重组质粒,序列分析其为κ链,为643bp包括了可变区和恒定区.结论:利用抗原抗体特异性反应从噬菌体抗体库中筛选到抗HBs轻链基因.     

抗血管内皮生长因子165抗体轻重链可变区基因的克隆与？…

获得抗血管内皮生长因子１６５抗体的轻重链可变区基因。方法从分泌具有中和抗血管皮生长因子１６５活性的单抗杂交瘤细胞株Ｖｍｄ１１中提取总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆该单抗的轻，重链可变区基因并进行序列分析。     

Cloning and sequencing of the variable region genes of anti-human melanoma monoclonal antibody

EngineeringantibodyhasalreadyshoweditsgoodprospectsintumortherapyI'2-.AsmelanomaIsahighlymalignanttumor,itissignificantforthestudyofthetumortoacquirethevariableregiongenesandcorrespondingantibodyfragmentsofvariousanti--melanomamAbs.Itisknowntoallthattheessenceofpreparingengineeringantibodyistoobtainvariableregiongene:"':.Inthisstudy,RT--PCRmethodwasappliedtoamplifythevariableregiongenesoftheheavyandlightchainsofthemAbfromamurinehybrldonlacelllinewhichsecretsspecificantihumanmelanomamAbsa.T…     

抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4人/鼠嵌合Fab抗体片段的制备及功能鉴定

目的:构建日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的人/鼠嵌合Fab(cFab)抗体片段,并对cFab抗体片段结合活性进行鉴定.方法:用抗体框架区的通用引物PCR扩增抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的VH及VL基因,测序分析其核苷酸序列.将测序正确的鼠源VH、VL分别与人IgG1的CH1、CL通过Overlap PCR扩增Fd及全长L,再利用Overlap PCR以Fd和全长L基因为模板扩增cFab基因.将cFab基因片段克隆至载体pComb3XSS中构建表达载体pComb3XSS-Fab,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导进行蛋白可溶性表达.通过Western blot和ELISA方法对cFab抗体片段进行检测.结果:构建出抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4 cFab表达载体,Western blot结果证实在大肠杆菌Top10F'中表达出cFab可溶性抗体片段,ELISA结果显示cFab抗体片段与可溶性虫卵抗原(SEA)有较好的结合活性.结论:表达、纯化了抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4 cFab抗体片段,cFab抗体片段具有与亲本抗体相同的抗原结合能力,为制备抗日本血吸虫人源化免疫毒素提供了技术贮备.     

抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9单抗轻重链可变区基因克隆与序列分析

目的:获取抗人CD14单克隆抗体(单抗)ZCH-7-2F9(简称2F9)轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,为2F9单链抗体(ScFv2F9)的构建奠定基础。方法:复苏2F9和NS-1细胞株,并亚克隆2F9细胞株,从其最佳克隆93A10提取总RNA,RQ1 RNase-Free DNase处理污染的DNA,与NS-1细胞进行同步对照,通过RT-PCR,扩增获得2F9单抗VL基因和VH基因,分别克隆入pGEM○R-T Easy载体,然后转化DH5α细菌,酶切鉴定并纯化阳性重组子,测序后进行在线核苷酸序列分析。结果:2F9单抗VL基因全长321 bp,编码107个氨基酸,归属于小鼠Ig的Vκ基因,氨基酸序列分析结果显示,VL含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR),在第23位和第88位为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两种特征性氨基酸;其VH基因全长360 bp,编码120个氨基酸,归属于小鼠Ig的VH基因,氨基酸序列分析结果显示,VH含有明确的4个框架区和3个抗原决定簇互补区,在第22位和第96位为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两种特征性氨基酸。结论:经核苷酸序列分析证明所克隆的基因分别是2F9单抗的VL和VH基因,为2F9基因工程抗体研究奠定了坚实的基础。     

重症肌无力抗乙酰胆碱受体单链抗体基因的构建

[目的 ]构建重症肌无力抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因 .[方法 ]应用PCR技术及基因克隆技术分两步完成重链和轻链可变区基因的克隆 ,再对构建的单链抗体A 7基因进行序列测定检测其核苷酸序列 .[结果 ]构建的重组质粒经序列分析 ,重链可变区基因长度为 36 9bp ,轻链可变区基因长度为 32 1bp ,单链抗体基因长度为 735bp ;单链抗体A 7基因正确地插入在载体质粒pHEN 2开放读码框架内 .[结论 ]成功地构建重症肌无力抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因 ,为进一步制备基因工程抗体奠定了基础 .     

人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。     

抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ单链抗体库的构建及筛选

目的构建抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ(Histidine-rich protein Ⅱ,HRP-Ⅱ）单链抗体库,并筛选出阳性克隆。方 法用噬菌体抗体库技术构建抗恶性疟原虫ＨＲＰ－Ⅱ单链抗体库,并以ＨＲＰ－Ⅱ为靶抗原对该库进行了三轮“亲和吸附 一援救一感染扩增”的富集,挑取单菌落筛选并鉴定阳性克隆。结果获得目的基因并成功构建抗恶性疟原虫 ＨＲＰ－Ⅱ的 单链抗体库,库容为 １０６,并从中筛选出８株阳性克隆。结论 噬菌体抗体库技术具有高效的筛选性能,抗 ＨＲＰ－Ⅱ单链 抗体的制备为其在恶性疟的免疫快速诊断方法中的应用奠定了基础。     

Expression of Anti-CD4 Human/Murine Chimeric Antibody and Their Killer Tumor Activity

MonoclonalantibodiesagainstCD4molecule(anti-CD4McAb)ofhumanTlymphocyteshavebeensuccessfullyusedforthetreatmentofautoimmunediseasesandpreventionoforgantransplantationrejectioninhuman[1'Zj.However,murinemonoclonalantibodies(Ahs)haveimmunogenicityonhumanandproduceneutralizinghumananti-mouseantibodies(HAMA).ToreducetheimmunogenicityofmurineMcAbinhuman,chimericAhshavebeenproduced,inwhichtheVregionsofthemouseantibodywiththedesiredspecificityarecombinedwithhumanCregions["4j.Inthisstudy,anti-C…     

Construction of Human ScFv Phage Display Library against Ovarian Tumor

In order to construct a single chain fragment variable (ScFv) phage display library against ovarian tumor, by using RT-PCR, the human heavy chain variable region genes (VH) and light chain variable region genes (VL) were amplified from lymphocytes of ovarian tumor patients and subsequently assembled into ScFv genes by SOE. The resulting ScFv genes were electrotransformed into E. coli TG1 and amplified with the co-infection of helper phage M13KO7 to obtain phage display library. The capacity and titer of the resulting library were detected. The phage antibody library with a capacity of approximately 3×109cfu/μg was obtained. After amplification with helper phage, the titer of antibody library reached 5×1012cfu/mL. Human ScFv library against ovarian tumor was constructed successfully, which laid a foundation for the screening of ovarian tumor specific ScFv for the radioimmunoimaging diagnosis of ovarian tumor.     

用EBV转化的肝癌患者B细胞构建噬菌体单链抗体库

目的 构建抗肝癌人源噬菌体单链抗体库.方法 体外致敏并用EBV转化肝癌患者的PBMC.用PCR分别扩增VH和VL基因并组成ScFv基因.将ScFv基因与载体连接后,转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型ScFv库.结果 经EBV转化的4例肝癌患者PBMC,ELISA检测均有抗肝癌抗体产生,经多次PCK,扩增出6种vH(γ、μ)和9种VL(κ、λ)基因,经连接组成54种ScFv基因.将ScFv基因与载体连接后.导入大肠杆菌MC1 061.经四环素抗性筛选,得到库容为1.0×108的初级噬菌体抗独特型抗体库,噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为80%.结论 用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术,制备全人源抗肿瘤单链抗体(ScFv),这一策略是完全可行的.