肝星状细胞的免疫学功能研究进展

HSC定位于肝索与肝窦壁之间的Disse间隙内,与内皮细胞相对。在正常肝组织中,HSC与肝细胞数量之比为1：20,其约占肝内细胞总数的5％～15％。分静止和活化两种表型。静止状态下的HSC主要参与维持维生素A的动态平衡,合成细胞外基质及其降解酶基质金属蛋白酶,维持肝脏的三维结构。肝脏受损时,HSC发生活化并增殖,分泌大量细胞外基质,参与肝纤维化过程。近年来研究发现HSC具有重要的免疫抑制功能。     

肝星状细胞在肝癌发生发展中的研究进展

1876年kupffer从肝脏中鉴定出一种非实质性细胞,称其为肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC),后来的文献中又将其称之为Ito细胞、脂细胞、窦周细胞等.此后的一百多年时间里,随着生命科学技术的飞速发展,HSC被进一步验明正身并分离提纯.分离纯化人肝脏星状细胞的技术,为研究其生物学特性奠定了实验基础.HSC是一种具有多向分化潜能的基质细胞,体积介于窦内皮细胞和kupffer细胞之间,其激活和增殖导致肝纤维化的发生在学术界已是不争的事实[1-2].近年来研究发现,HSC能通过多种机制参与肝癌的发生发展,在肝癌的演变过程中扮演重要角色.     

转化生长因子-β/CTGF在肝纤维化发生机制中的作用

正肝纤维化是大多数慢性肝病向肝硬化发展的共同病理过程~([1])。肝纤维化被认为是肝脏对各种慢性损伤因子的一种修复反应,它的主要特点是细胞外基质(ECM)的过量沉积。肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)是肝纤维化发生发展的中心环节,为正常肝脏或纤维化肝脏细胞外基质的主要产生细胞~([2])。在肝纤维化形成过程当中,活化的HSC     

圆盘受体2与肝纤维化

肝纤维化是机体针对各种慢性肝损伤所引发的修复反应。它主要是由肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）激活并转化为肌成纤维样细胞后分泌大量的细胞外基质（extracellular matrix，ECM），大量沉积的ECM又促进HSC不断活化，从而导致肝纤维化的不断进展。     

瘦素在肝纤维化中的作用

近年来大量研究显示,瘦素与肝纤维化有着密切联系。瘦素可以放大炎症反应,其炎症放大作用可独立诱发肝纤维化的发生。当患者发生肝纤维化或肝硬化时,瘦素水平随纤维化的程度而逐渐升高,且两者之间呈正相关。肝脏星状细胞(HSC)的增生、活化是肝纤维化发生发展的关键环节。瘦素的作用机制可能是通过上调TGFβ1,激活HSC并抑制其凋亡,从而促进以胶原为主的细胞外基质合成增多,加速肝维化的发生发展。     

血小板衍生生长因子促进肝星状细胞活化在肝癌肿瘤微环境中的作用

肝星状细胞(HSC)在肝纤维化中的作用已被公认,近年来HSC在肝脏肿瘤微环境中的作用也逐渐引起人们重视.血小板衍生生长因子(PDGF)是HSC最重要的有丝分裂原,其在HSC的活化中具有极为重要的作用.HSC既是PDGF的作用靶细胞,同时也可分泌PDGF,从而形成PDGF激活HSC的双向循环模式.PDGF可通过MAPK、PI-3K、Ca2+、JAK等信号通路激活HSC.研究PDGF激活HSC在肝脏肿瘤微环境中的作用机制,寻找靶向抑制PDGF及肝星状细胞的相应方法,有望为肝脏肿瘤的治疗提供新的方向.     

瘦素在肝纤维化中的作用

近年来大量研究显示，瘦素与肝纤维化有着密切联系。瘦素可以放大炎症反应，其炎症放大作用可独立诱发肝纤维化的发生。当患者发生肝纤维化或肝硬化时，瘦素水平随纤维化的程度而逐渐升高，且两者之间呈正相关。肝脏星状细胞(HSC)的增生、活化是肝纤维化发生发展的关键环节。瘦素的作用机制可能是通过上调TGF-β1，激活HSC并抑制其凋亡，从而促进以胶原为主的细胞外基质合成增多，加速肝维化的发生发展。     

抗氧化剂治疗肝纤维化的研究进展

肝纤维化是肝内弥漫性纤维组织沉积,是多种慢性肝损伤的共同后果,持续发展则成为肝硬化甚至肝癌。肝星状细胞（HSC）的活化使细胞外基质（ECM）的产生与降解不平衡,是导致肝纤维化发生发展的重要环节。氧化应激反应与肝脏的纤维化密切相关,作为一种重要的机制参与到HSC的活化和ECM的沉积,因此,抗氧化剂作为一种重要的治疗肝纤维化药物成为研究热点。笔者就近几年抗氧化剂治疗肝纤维化的研究进展进行综述。     

联合应用SSH和cDNA表达谱芯片筛选肝星状细胞早期活化的相关基因

目的利用抑制消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)和cDNA表达谱芯片筛选早期活化的肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)和大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化组织、重度肝纤维化组织中差异表达的基因。方法从SSH构建的大鼠轻度肝纤维化、重度肝纤维化2个差异cDNA文库中挑选1000条上调显著的基因,与正常大鼠4136条基因克隆制作成一张芯片,筛选早期活化的肝星状细胞相关基因。结果获得与HSC早期活化相关的上调基因有202条,下调基因有80条,其中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(serumandglucocorticoidsensitivekinase,SGK)在正常大鼠基因克隆和2周及8周SSH上调差异基因中均呈上调信号。结论联合应用SSH和cDNA表达谱芯片是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速、经济和有效的方法;SGK可能作为多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点,参与了肝星状细胞的早期活化和信号传导。     

联合应用SSH和cDNA表达谱芯片筛选肝星状细胞早期活化的相关基因

目的 利用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）和cDNA表达谱芯片筛选早期活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）和大鼠正常肝脏组织、轻度肝纤维化组织、重度肝纤维化组织中差异表达的基因。方法 从SSH构建的大鼠轻度肝纤维化、重度肝纤维化2个差异cDNA文库中挑选1000条上调显著的基因，与正常大鼠4136条基因克隆制作成一张芯片，筛选早期活化的肝星状细胞相关基因。结果 获得与HSC早期活化相关的上调基因有202条，下调基因有80条，其中血清和糖皮质激素调节蛋白激酶（serum and glucocorticoid sensitive kinase，SGK）在正常大鼠基因克隆和2周及8周SSH上调差异基因中均呈上调信号。结论 联合应用SSH和cDNA表达谱芯片是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速、经济和有效的方法；SGK可能作为多种细胞信号传导通路和细胞磷酸化级联反应的一个功能性交汇点，参与了肝星状细胞的早期活化和信号传导。     

造血干细胞标志物CD74在大鼠肝干细胞中的表达

目的检测与分析大鼠肝干细胞（HSC）标志物,为分离和鉴定HSC提供可能的新方法。方法采用胶原酶灌流法与密度梯度离心法分离正常SD大鼠HSC,利用倒置相差显微镜、逆转录PCR和免疫组织化学法等技术,观察HSC标志物白蛋白、CK19、Oval-6、CD90和成熟肝细胞标志物酪氨酸氨基转移酶（TAT）及造血干细胞标志物CD45和CD74在HSC中的表达情况。结果正常SD大鼠分离培养的HSC在倒置相差显微镜下呈卵圆形,具有较高的核浆比率。逆转录PCR分析显示,该细胞表达白蛋白、CK19、CD90和CD74基因,不表达TAT和CD45。细胞免疫组织化学法检测结果证实HSC表达Oval-6和CD74。结论 CD74有可能成为分离和鉴定HSC的新标志物之一。     

结缔组织生长因子通过ERK1/2和PI3K信号通路促进大鼠肝星状细胞迁移和基质金属蛋白酶2表达

目的：研究结缔组织生长因子（CTGF）对大鼠肝星状细胞（HSC）迁移及基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达及活化的影响。方法分别应用RT-PCR和Western blotting法检测MMP-2表达,明胶酶谱法检测MMP-2的活性;运用Western blotting法检测ERK1/2和Akt的磷酸化水平。运用Transwell小室检测肝星状细胞迁移能力。结果 CTGF呈剂量依赖性促进大鼠HSC中MMP-2 mRNA和蛋白表达;同时CTGF能够促进HSC迁移,MMP-2特异性抑制剂能够抑制CTGF的促迁移作用。ERK1/2和PI3K抑制剂能够显著抑制CTGF诱导的MMP-2表达以及CTGF促进HSC的迁移作用。结论 MMP-2表达和活性的增强在CTGF促进HSC迁移过程中发挥着重要作用,ERK1/2和PI3K信号通路在CTGF促进MMP-2表达发挥关键作用。     

视黄醇类核内受体-α基因慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞的影响

目的:通过视黄醇类核内受体-α(retinoid X receptor-alpha,RXR-α)基因慢病毒表达载体的构建,及其对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)活化、增殖影响的研究,探讨RXR-α基因在肝纤维化中的作用。方法:①构建RXR-α基因慢病毒表达载体;②分离和体外培养大鼠HSC;③将自发活化的HSC分成3组,即正常对照组、阴性对照组和RXR-α载体组;分别将空白慢病毒载体和RXR-α慢病毒载体转染自体活化的HSC,采用Western印迹法检测各组细胞中RXR-α、α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达变化,用MTT法检测各组HSC培养24、48、72及96 h后的增殖情况。结果:正常对照组及阴性对照组HSC中几乎没有RXR-α蛋白的表达,而RXR-α载体转染组的HSC中出现RXR-α蛋白的明显表达。与正常对照组及阴性对照组相比,RXR-α载体组转染的HSC中α-SMA蛋白表达量显著下降(t=3.767,P0.01和t=8.491,P0.05),Ⅰ型胶原蛋白表达也显著降低(t分别为10.449和10.756,P值均0.01),同时HSC的增殖能力也显著下降(t分别为4.381和1.778,P值均0.05)。而阴性对照组与正常对照组相比,α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达量和HSC增殖能力无明显变化(P0.05)。结论:RXR-α基因在HSC内的增强表达能显著抑制HSC的活化和增殖,具有潜在的抑制肝纤维化的作用。     

小鼠肝星状细胞的分离、培养及鉴定方法

目的：探索BALB／c小鼠肝星状细胞（HSCs）分离、纯化的可行方案．并评价依该法分离所得HSCs的生物学特性。方法：经肝门静脉先用不含钙镁离子的Hank液充分灌洗,再以浓度为1mg／mL的Ⅳ型胶原酶灌注BALB／c小鼠肝脏。取肝后．完整分离后碾碎,37℃水浴振荡30min,Percoll连续密度梯度（60％）离心法分离、纯化HSCs．苔盼蓝染色检测HSCs活性,结蛋白免疫细胞化学鉴定HSCs,光镜观察体外培养HSCs的形态学变化。结果：纯化后每只小鼠HSCs收获量约为（5．5±0．4）×10^5个．HSCs纯度〉90％．HSCs细胞活率〉90％。结论：本实验建立的的分离纯化方案可获得高纯度高活率的小鼠HSCs。     

5-羟色胺受体在肝星状细胞上的表达及5-羟色胺对肝星状细胞生物学活性的影响

目的　探讨 5 羟色胺 ( 5 HT)受体在肝星状细胞 (HSC)的表达及 5 HT通过其受体的介导对HSC生物学活性的影响。　方法　采用肝脏离体胶原酶灌注消化及密度梯度离心的方法来分离培养HSC ;RT PCR方法检测HSC中 5 HT受体 1B、2A、2B、3等亚型的表达 ;Westernblot方法检测 5 HT及其 2A受体阻断剂酮色林、3型受体阻断剂恩丹西隆对HSC表达TGF β1和Smad4的影响。建立聚硅酮膜培养法 ,将HSC培养在聚硅酮膜上 ,研究 5 HT及酮色林、恩丹西隆对HSC收缩的影响。结果　HSC表达 5 HT的 1B、2A、2B等受体亚型 ,不表达 3亚型。5 HT明显促进HSC表达TGF β1和Smad4(P <0 0 5 ) ,酮色林能抑制TGF β1和Smad4的表达。恩丹西隆的作用不明显。 5 HT能促进HSC的收缩 ,并成量效依赖关系 ,这种收缩作用能被酮色林所阻断 ,不被恩丹西隆阻断。　结论　HSC表达 5 HT的多种受体亚型 ,5 HT通过其受体的介导对HSC的生物学活性发生影响 ,在肝硬化、门静脉高压症的发生发展中起了一定的作用。     

Cellular and molecular functions of hepatic stellate cells in inflammatory responses and liver immunology

The liver is a central immunological organ. Liver resident macrophages, Kupffer cells (KC), but also sinusoidal endothelial cells, dendritic cells (DC) and other immune cells are involved in balancing immunity and tolerance against pathogens, commensals or food antigens. Hepatic stellate cells (HSCs) have been primarily characterized as the main effector cells in liver fibrosis, due to their capacity to transdifferentiate into collagen-producing myofibroblasts (MFB). More recent studies elucidated the fundamental role of HSC in liver immunology. HSC are not only the major storage site for dietary vitamin A (Vit A) (retinol, retinoic acid), which is essential for proper function of the immune system. This pericyte further represents a versatile source of many soluble immunological active factors including cytokines [e.g., interleukin 17 (IL-17)] and chemokines [C-C motif chemokine (ligand) 2 (CCL2)], may act as an antigen presenting cell (APC), and has autophagy activity. Additionally, it responds to many immunological triggers via toll-like receptors (TLR) (e.g., TLR4, TLR9) and transduces signals through pathways and mediators traditionally found in immune cells, including the Hedgehog (Hh) pathway or inflammasome activation. Overall, HSC promote rather immune-suppressive responses in homeostasis, like induction of regulatory T cells (Treg), T cell apoptosis (via B7-H1, PDL-1) or inhibition of cytotoxic CD8 T cells. In conditions of liver injury, HSC are important sensors of altered tissue integrity and initiators of innate immune cell activation. Vice versa, several immune cell subtypes interact directly or via soluble mediators with HSC. Such interactions include the mutual activation of HSC (towards MFB) and macrophages or pro-apoptotic signals from natural killer (NK), natural killer T (NKT) and gamma-delta T cells (γδ T-cells) on activated HSC. Current directions of research investigate the immune-modulating functions of HSC in the environment of liver tumors, cellular heterogeneity or interactions promoting HSC deactivation during resolution of liver fibrosis. Understanding the role of HSC as central regulators of liver immunology may lead to novel therapeutic strategies for chronic liver diseases.     

Oridonin inhibits hepatic stellate cell proliferation and fibrogenesis

Background

Liver fibrosis is a common response to liver injury and, in severe cases, leads to cirrhosis. The hepatic stellate cells (HSCs) become activated after liver injury and play a significant role in fibrogenesis. The activated HSC is characterized by increased proliferation, overexpression of α smooth muscle actin, and excessive production of extracellular matrix (ECM) proteins. Oridonin, a naturally occurring diterpenoid, has been shown to induce apoptosis in liver and gastric cancer cells. However, its effects on the HSC are unknown.

Methods

We tested the effects of oridonin on the activated human and rat HSC lines LX-2 and HSC-T6, and the human hepatocyte cell line C3A. Transforming growth factor β1 (TGF-β1) was used to stimulate LX-2 cells.

Results

Oridonin significantly inhibited LX-2 and HSC-T6 proliferation. In contrast, oridonin had no antiproliferative effect on C3A cells at our tested range. Oridonin induced apoptosis and S-phase arrest in LX-2 cells. These findings were associated with an increase in p53, p21, p16, and cleaved Poly (ADP-ribose) Polymerase (PARP), and with a decrease in Cyclin-dependent kinase 4 (Cdk4). Oridonin markedly decreased expression of α smooth muscle actin and ECM protein type I collagen and fibronectin, blocked TGF-β1-induced Smad2/3 phosphorylation and type I collagen expression.

Conclusions

Oridonin induces apoptosis and cell cycle arrest involving the p53-p21 pathway in HSC and appears to be nontoxic to hepatocytes. In addition, oridonin suppressed endogenous and TGF-β1-induced ECM proteins. Thus, oridonin may act as a novel agent to prevent hepatic fibrosis.     

HNF4α在胎肝干细胞促肝组织损伤修复中的作用

目的探讨肝细胞核因子(HNF)4α在胎肝干细胞促大鼠肝组织损伤修复中的作用。方法胶原酶结合机械消化法制备14 d胎龄大鼠胎肝干细胞悬液并进行体外长期培养。采用四氯化碳制作SD大鼠急性化学性肝损伤模型,造模成功后将肝损伤大鼠随机分为移植组(20只)和对照组(20只),移植组将胎肝干细胞经门静脉移植至大鼠肝脏,对照组注射等容计量的生理盐水,分别于注射前6 h,注射后1,3,5周检测大鼠血清谷氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST),并检查肝组织病理学变化,观察肝脏修复情况。采用免疫组化及Western-blot方法检测肝脏治疗前后HNF4α表达情况。结果对照组大鼠肝功能改善缓慢,ALT,AST明显高于移植组(P0.05),移植组大鼠损伤的肝组织逐渐修复,肝功能恢复正常。第5周移植组大鼠术后存活率显著高于对照组(P=0.002)。肝组织损伤后,HNF4α在肝组织的表达明显升高;随着肝组织的逐渐修复,HNF4α表达逐渐下降。western-blot及免疫组化检测亦证实此结果。结论HNF4α在肝脏损伤初期起保护作用。可能系通过促进胎肝干细胞向正常肝细胞分化增殖,并迁移至损坏的肝小叶从而替代损伤的肝实质,从而提高肝损伤后的恢复能力。     

肝星状细胞对大鼠肝部分切除术后肝再生修复的影响

目的 探讨肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）在大鼠肝部分切除术后对肝损伤修复的影响.方法 体外实验部分：将大鼠肝星状细胞（HSCs）与大鼠肝细胞系（BRL-3A）共培养,CCK-8比色法检测细胞增殖情况;ELISA法检测培养肝星状细胞上清液中细胞因子,即肝细胞生长因子（hepatic growth factor,HGF）、胰岛素样生长因子（insulin growth factor,IGF）、表皮细胞生长因子（epidermal growth factor,EGF）、转化生长因子-α（transfactor growth factor-α,TGF-α）含量.体内实验部分;将45只260 ～330 g健康雄性SD大鼠随机分为三组：正常组（生理盐水组）、对照组（肝星状细胞培养液组）、实验组（肝星状细胞培养上清液组）.各组分别于肝大部切除术后第3、7、12天取血清检测肝功能情况并计算肝再生指数;HE染色切片显微镜下观察肝脏病理结构改变情况;免疫组织化学染色法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nucleus antigen,PCNA）、平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、甲胎蛋白（a1pha feta1 protein,AFP）及白蛋白（albumin,ALB）的表达情况.结果 ①CCK-8法检测肝星状细胞能促进肝细胞增殖（P＜0.05）;②上清液较培养液中细胞因子HGF、TGF-α含量多,差别有统计学意义（P＜ 0.05）;③实验组肝再生指数比对照组大,差别具有统计学意义（P＜0.05）;④实验组大鼠AST随着时间的推移,较对照组下降明显,差别有统计学意义（P＜0.05）;⑤实验组PCNA表达量较正常组、对照组增多,差别有统计学意义（P＜ 0.05）;⑥平滑肌肌动蛋白、白蛋白、甲胎蛋白三组间差别不显著（P＞ 0.05）.结论 ①体外肝星状细胞能促进肝细胞增殖;②肝星状细胞培养上清液能促进大鼠肝部分切除术后肝再生,其分泌的多种细胞因子在肝损伤再生修复中起了重要作用.     

Synchronized expressions of hepatic stellate cells and their transactivation and liver regeneration during liver injury in an animal model of cholestasis

Background

There is much known about hepatic stellate cells (HSCs) during liver injury. However, some aspects remain unclear, such as the natural expression levels of HSCs during the days to weeks after liver injury. Does liver regeneration start the same time as the injury process?

Methods

Fifty-four male Wistar rats aged 7 to 8 weeks, weighing 200 to 320 g each were subjected to bile duct ligation (BDL). After surgery, they were killed at different times post-BDL. Collagen deposition was analyzed, and immunohistochemical staining of α-smooth muscle actin (α-SMA), vimentin, matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), tissue inhibitor matrix metalloproteinase-1, and proliferating cell nuclear antigen antibody (PCNA) was performed to evaluate HSCs and liver regeneration.

Results

The expression of α-SMA was seen as early as day 3 post-BDL, which started from peribiliary to perisinusoidal, and was seen throughout the whole liver sections on day 28 post-BDL. Similar expression patterns were seen in MMP-2 staining. The PCNA expression was strongest around the perisinusoidal area. These expression patterns were not observed in the sham-operated rats.

Conclusions

The activation of HSCs showed a synchronized fibrogenic process and liver regeneration from days to weeks after liver injury. Matrix degradation was thus found to increase in accordance with chronic liver injury, which thus led to an excessive collagen deposition.