骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞诱导成骨的实验研究

目的 通过基因转染方法，使成纤维细胞NIH－3T3细胞具有合成及分泌骨形态发生蛋白（BMP）、体内诱导新骨生成的能力。方法 定向克隆法将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，Northern印迹法检测转染细胞有无BMP3基因表达，免疫组织化学检测转染细胞内的BMP3蛋白合成，钙钴法染色不同时相的转染细胞碱性磷酸酶并作图像分析。将转染细胞注入裸鼠肌袋，观察注射后第4周诱导新骨生成情况。结果 转染细胞体外培养6周Northern印迹法检测到有明显的BMP3基因表达，免疫组织化学染色见转染细胞培养筛选5－8周后细胞浆内有染成黄色的BMP3蛋白质颗粒出现，图像分析蛋白质生成在转染后第6周达高峰。钙钴法碱性磷酸酶染色及图像分析示转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。被转染NIH－3T3细胞裸鼠肌袋诱导成骨实验见注射后4周注射部位有大量软骨细胞出现，并伴有骨小梁生成。结论 通过基因转染方法可以使NIH－3T3细胞具有合成及分泌内源性BMP的能力，合成及分泌的BMP具有良好的生物活性，肌袋实验具有诱导成骨作用。但是，由于基因治疗的某些不可控性因素，其安全性仍有待于进一步研究。     

表达人骨形成蛋白2的成纤维细胞系的建立与鉴定

目的:建立能稳定表达BMP2的成纤维细胞系.方法:运用阳离子聚合物转染试剂,将含有人BMP2基因的真核表达载体pcDNA3.1-B2导入NIH3T3细胞,通过G418筛选获得阳性细胞克隆,RT-PCR、免疫组化和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BMP2基因的稳定转染和蛋白表达.结果:转染细胞内有BMP2mRNA的转录,胞内及胞外有BMP2蛋白的表达.结论:采用阳离子聚合物转染法可成功地将外源性hBMP2基因导入NIH3T3细胞,为进一步研究诱导牙周膜细胞骨化分化建立基础.     

稳定表达人骨形成蛋白2成纤维细胞的建立与鉴定

目的 探讨ＢＭＰ对细胞分化的调节作用,为ＢＭＰ基因疗法的建立提供依据。方法 构建了含有人ＢＭＰ２开放阅读框（１．２ｋｂ）的真核表达载体ｐＢＫ－Ｂ２利用脂质本转染方法将其导入ＮＩＨ３Ｔ３细胞,通过Ｇ－４１８筛选获得了性细胞克隆,细胞原位杂交和免疫组化检测ＢＭＰ２基因的稳定转染及表达情况。结果 转染细胞内有ＢＭＰ２ｍＲＮＡ的转录及其蛋白的表达,结论：人ＢＭＰ２基因ＮＩＨ３Ｔ３细胞中得到稳定有效的方法。     

分泌性hrCEMP1在NIH3T3细胞中的表达

目的:通过转基因技术建立稳定表达hrCEMP1的成纤维细胞株.方法:利用高效率的阳离子聚合物,将含有hrCEMP1编码序列的真核表达质粒pcDNA3.1-hrCEMP1转染入NIH3T3细胞中,用G418筛选获得稳定转染细胞株,以RT-PCR检测hrCEMP1基因转录,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测hrCEMP1...     

骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞后细胞形态及生物学变化

目的 通过基因转染方法，用骨形态发生蛋白3（BMP3）基因转染成纤维细胞（NIH－3T3细胞），观察转染不同时期被转染细胞的形态学改变及细胞内碱性磷酸酶含量的变化，初步探讨骨组织工程种子细胞来源的另一途径。方法 定向克地将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，观察不同时期被转染细胞的形态学变化，钙钴法染色转染细胞时相的碱性磷酸酶并作图像分析。结果 转染细胞培养筛选6周提取的总RNA用Dot blot可以检出有明显的BMP3 mRNA表达。转染细胞第1周细胞形态由长梭形变为杆状，转染后2周细胞由长梭形变为多角形，转染后4周细胞变为多边形，类似成骨细胞，钙钴法碱性磷酸酶染色示转染组细胞胞浆内有大量染色黑色的碱性磷酸酶颗粒，及图像分析及转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。结论 通过向NIH－3T3细胞内转染BMP3基因，可以使NIH－3T3细胞形态向成骨细胞形态发生转化，被转染细胞内碱性碱性磷酸酶水平明显增高，已具有成骨细胞某些特性。     

稳定表达肝癌相关抗原HAb18G/CD147成纤维细胞株的建立及其意义

目的:探讨将HAb18G全长cDNA转染成纤维细胞NIH/3T3的可行性及其意义.方法:将含有肝癌相关抗原HAb18G全长cDNA的真核表达载体pcDNA3.0/HAb18G利用脂质体介导法转染小鼠成纤维细胞NIH/3T3,G418筛选建立稳定表达阳性克隆细胞株t3T3;利用流式细胞仪、间接免疫荧光染色方法鉴定目的蛋白转染情况;RT-PCR琼脂糖电泳、明胶酶谱分别从mRNA和蛋白水平检测转染前后HAb18G刺激3T3细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的情况.结果:利用脂质体介导法将HAb18G全长cDNA转染入成纤维细胞NIH/3T3,G418筛选,流式细胞仪分析、间接免疫荧光染色证实成功建立了稳定表达HAb18G的阳性克隆株;RT-PCR琼脂糖电泳证实t3T3细胞MMP-2、MMP-9 mRNA转录水平较未转染前增多;明胶酶谱表明t3T3分泌MMPs能力较未转染前增强.结论:HAb18G全长cDNA可以稳定转染成纤维细胞,并能从核酸和蛋白水平诱导基质金属蛋白酶高表达,具有其独特的生物学意义.     

骨形成蛋白2基因转染的人牙周膜成纤维细胞的生物学特性

目的建立表达骨形成蛋白2(BMPS)的人牙周膜成纤维细胞(HPDLFS)并观察其生物学特性。方法利用脂质体将BMP2噬菌粒表达载体pBK-B2转染至HPDLFs,免疫组化ABC法检测BMP2基因的表达,并检测转染细胞的碱性磷酸酶(ALP)活力、骨钙素(OC)含量和矿化能力。结果转染BMP2基因后,HPDLFs内有BMP2蛋白的表达,ALP活力、OC含量和矿化结节数量均显著增加。结论BMP2基因在HPDLFs中得到表达并促进其向成骨样细胞分化。     

Smurf1拮抗BMP-2对C2C12细胞的诱导成骨作用

目的研究Smad泛素化调节因子1（Smurf1）对基因重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）诱导成骨作用的影响。方法通过将质粒pcDEF3-Smurf1临时转染C2C12细胞并应用实时PCR和Western免疫印迹法鉴定其表达Smurf1，空载体pcDNA3．1作为阴性对照；然后用比色法测定细胞碱性磷酸酶活性和实时PCR分析细胞碱性磷酸酶、骨钙素、成骨转录因子Osterix基因表达，观察Smurf1对rhBMP-2诱导C2C12细胞向成骨细胞分化的影响。同时在相差显微镜下观察细胞形态的变化。结果Smurf1在C2C12细胞可以通过临时转染获得很好的表达。尽管在细胞形态上没有明显的差别，但Smurf1转染的C2C12细胞在rhBMP-2作用48h后，细胞碱性磷酸酶活性以及细胞碱性磷酸酶、骨钙素、成骨转录因子Osterix基因表达均较对照组明显下降。结论Smurf1在BMP诱导成骨过程中发挥着负性调节作用。     

IGF-Ⅰ联合BMP-2促MC 3T3-E1和NIH 3T3细胞的增殖和分化及钙化效应

目的：探讨重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ（rhIGF—Ⅰ）和重组人骨形成蛋白-2（rhBMP-2）单独或联合应用对MC3T3-E1和NIH 3T3细胞增殖、分化和钙化的影响。方法：单独或联合应用不同浓度rhIGF—Ⅰ和rhBMP-2作用于小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1和小鼠成纤维细胞株NIH 3T3，采用四唑盐比色法（MTT）和流式细胞技术检测细胞增殖，碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测细胞分化，放射免疫法检测细胞分泌的骨钙素水平（OC），以及Von kossa钙化染色法观察细胞的钙化。结果：1～50ng／ml rhIGF—Ⅰ作用于MC 3T3-E1细胞或5～75ng／ml rhIGF—Ⅰ作用于NIH 3T3细胞后，均能显示明显的促细胞增殖作用（P〈0．01），使S期细胞百分率升高、G1期细胞百分率减少，以及使胞内ALP活性、钙化面积百分比增高（P〈0．05）。10～100ng／ml rhBMP-2也可促进MC 3T3-E1和NIH 3T3细胞的增殖作用（P〈0．01），使S期细胞百分率升高、G1期细胞百分率减少，并使2种细胞ALP活性、钙化面积百分比升高（P〈0．05）。各浓度rhIGF—Ⅰ或rhBMP-2对MC 3T3-E1及NIH 3T3细胞作用8h、24h和48h的MTT检测结果相似。rhIGF—Ⅰ和rhBMP-2联合作用后，对2种细胞的促增殖、增强ALP活性、促钙化的作用均较各自单独作用更为明显（P〈0．05）。单独或联合应用不同浓度rhIGF—Ⅰ和rhBMP-2对细胞分泌的OC水平均无显著性差异（P〉0．05）。结论：rhIGF—Ⅰ和rhBMP-2具有明显的促进细胞增殖、早期分化及钙化的协同作用，但对成骨末期细胞分化影响不大，而其活性主要与使用剂量有关。     

木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3 T3-E1增殖、分化、矿化和Wnt通路的影响

目的:探讨木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化及Wnt通路的影响.方法:在体外培养的MC3T3-E1s培养基中加入木犀草素0.25~8.00μmol/L培养12、24和48 h,以洛伐他汀0.04μmol/L作为阳性对照,采用细胞计数试剂盒法检测细胞增殖情况;用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测细胞内ALP的活性;茜素红S染色法检测细胞矿化能力;采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞Ⅰ型胶原、骨钙素、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Lrp5)、β-连环素、护骨素/细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA表达水平.结果:木犀草素可以剂量依赖性和时间依赖性地促进成骨细胞MC3T3-E1增殖(P<0.05~P<0.01);木犀草素(2.00、4.00和8.00μmol/L)可以剂量依赖性地促进MC3T3-E1成骨细胞ALP活性,增强MC3T3-E1成骨细胞矿化能力并上调MC3T3-E1成骨细胞中Ⅰ型胶原、骨钙素、Lrp5、β-连环素和护骨素/细胞核因子κB受体活化因子配体mRNA表达.结论:木犀草素2.00、4.00和8.00μmol/L可以促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化与矿化及Wnt通路中Lrp5和β-连环素mRNA的表达.     

兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究

目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。     

Hypoxia-induced MTA1 promotes MC3T3 osteoblast growth but suppresses MC3T3 osteoblast differentiation

Background

Bone fracture is one of the most common physical injuries in which gene expression and the microenvironment are reprogramed to facilitate the recovery process.

Methods

By specific siRNA transfection and MTT assay, we evaluated the effects of metastasis-associated gene 1 (MTA1) in osteoblast growth. To show the role of MTA1 in osteoblast under hypoxia conditions, by overexpressing and silencing MTA1 expression, we performed mineral deposition and alkaline phosphatase activity assay to observe the differentiation status of osteoblast cells. Real-time PCR and Western blot assays were adopted to detect the expression of certain target genes.

Results

Here, we reported that hypoxia-induced MTA1 expression through hypoxia-induced factor 1 alpha (HIF-1α) and stimulated the growth of osteoblast MC3T3 cells. Silencing of MTA1 through specific siRNA suppressed MC3T3 cell growth and elicited cell differentiation and induced alkaline phosphatase activation and the upregulation of bone morphogenetic protein-2 and osteocalcin.

Conclusions

We found that MTA1 was regulated by HIF-1α in hypoxia circumstance to suppress osteoblast differentiation. These findings provide new insights for bone fracture healing and new strategies to develop potential targets to promote fracture healing.

Electronic supplementary material

The online version of this article (doi:10.1186/s40001-015-0084-x) contains supplementary material, which is available to authorized users.     

骨形态发生蛋白2基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：评价携带骨形态发生蛋白2基因的重组腺病毒（Ad-BMP-2）转染人骨髓间充质干细胞（MSC）对其成骨分化的影响。方法：由健康青年男性髂骨抽取骨髓培养MSC，BMP-2基因转染后，用RT-PCR及免疫组化染色证实转基因MSC的BMP-2基因表达，原位杂交及免疫组化染色检测转染后细胞成骨活性，并进行透射电镜观察。结果：转染后细胞稳定表达BMP-2基因，核心结合因子a1、骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶呈阳性表达，透射电镜显示细胞外有胶原分泌和钙盐沉积。结论：Ad—BMP-2基因转染可以提高MSC的体外成骨能力。     

健腰密骨片对成骨细胞增殖分化和BMP信号通路报导基因活性的影响

目的:探讨健腰密骨片对成骨细胞的影响及作用机制。方法:常规培养转染12×SBE-OC-Luc报导基因的成骨细胞株OCT-1细胞(以下简称12×SBE-OC-Luc-OCT1细胞),采用健腰密骨片含药血清进行干预48 h,并以骨形态发生蛋白(BMP)2纯化蛋白(50 ng/ml)为阳性对照。用MTT法检测成骨细胞增殖率,实时荧光定量RT-PCR法检测成骨细胞中Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen)、骨钙素(osteocalcin)和BMP2mRNA的表达以及荧光素酶活性检测法检测成骨细胞12×SBE-OC-Luc的活性。结果:与正常对照组比较,健腰密骨片能明显促进成骨细胞的增殖(P0.05);显著增加成骨细胞中typeⅠcollagen、osteocalcin和BMP2的mRNA表达量(P0.05);能明显促进成骨细胞中BMP报导基因12×SBE-OC-Luc的荧光素酶活性(P0.05)。结论:健腰密骨片可通过促进BMP2、typeⅠcollagen和osteocalcin的表达及BMP信号通路报导基因12×SBE-OC-Luc的活性,从而促进成骨细胞的增殖与分化。     

mTOR基因转染对NIH3T3成纤维细胞增生的影响

目的 探讨mTOR基因转染对NIH3T3成纤维细胞增生的影响.方法 运用电穿孔法将pcDNA3-mTOR质粒转染NIH3T3成纤维细胞,经G418筛选抗性克隆,RT-PCR和Western印迹分析检测转染组和对照组细胞mTOR mRNA与蛋白的表达,MTT方法检测细胞增生.结果 转染组细胞mTOR mRNA和蛋白质的表达显著增强(P＜0.01);MTT法检测转染组光吸收值显著大于对照组(P＜0.01);结论 mTOR基因转染成纤维细胞可获稳定表达,并明显促进成纤维细胞增生.     

双表达骨形态发生蛋白9、7重组腺病毒载体的构建及其对间充质干细胞C3H10的成骨作用

目的 构建双表达骨形态发生蛋白(BMP)9、7腺病毒重组体并进行初步成骨鉴定.方法 自单一表达的BMP9或BMP7 AdEasy质粒上扩增BMP9和BMP7基因序列,先后定向亚克隆至同一穿梭质粒pASG2,获得双表达穿梭质pASG2-BMP9、7.酶切、PCR鉴定及测序正确后与骨架质粒pAdEasy-1同源重组获得双表达BMP9、BMP7腺病毒质粒,转染至HEK293细胞中包装和扩增得到高滴度双表达BMP9、BMP7腺病毒,体外转染C3H10细胞,碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色检测其早晚期成骨作用.结果 成功构建双表达BMP9、BMP7的腺病毒,RT-PCR证实双表达腺病毒在C3H10细胞中表达,其转染的C3H10细胞早期碱性磷酸酶染色及晚期钙茜素红染色活性较单一表达的BMP7或BMP9腺病毒组增强.结论 成功构建双表达BMP9、BMP7的重组腺病毒载体,其重组体具有定向诱导C3H10细胞成骨分化的能力.     

RUNX2/LAPTM5在小鼠颅骨前成骨细胞矿化诱导中的表达

目的 探讨RUNX2/LAPTM5在矿化诱导过程中的表达与成骨及溶酶体的相关性。方法 矿化诱导MC3T3-E1,对照组不做处理,茜素红染色检测矿化情况,碱性磷酸酶染色检测成骨分化情况。RT-qPCR及Western blot检测分化0-5 d RUNX2及LAPTM5的基因及蛋白表达。过表达与干扰RUNX2/LAPTM5的表达后,Western blot检测RUNX2、LAPTM5的表达。过表达与干扰LAPTM5的表达后,Western blot检测成骨相关基因碱性磷酸酶、骨钙素 的表达。结果 倒置显微镜下观察,茜素红染色矿化结节计数随时间变化逐渐增多,矿化结节的大小也逐渐变大;碱性磷酸酶染色蓝紫色颗粒计数随时间逐渐增加。RT-qPCR及Western blot结果显示RUNX2及LAPTM5的表达,其在成骨矿化过程中呈上升趋势（P<0.001）。过表达与干扰RUNX2影响LAPTM5表达（P<0.05）;过表达与干扰LAPTM5对RUNX2的影响不显著。过表达与干扰LAPTM5影响了成骨的表达（P< 0.01）。结论 RUNX2/LAPTM5可能参与了成骨细胞分化调节,RUNX2可能参与LAPTM5的表达调控。RUNX2/LAPTM5可能在溶酶体参与成骨矿化的过程中起到桥梁作用。     

hIGF-1基因转染对成纤维细胞增殖的影响

目的：探讨人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因转染对成纤维细胞增殖的影响。方法：用脂质体转染法将pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染鼠成纤维细胞NIH3T3,经G418筛选抗性NIH3T3细胞并继续培养4周,进行原位杂交和免疫细胞化学检测hIGF-1的表达,MTT方法和流式细胞仪检测NIH3T3细胞增殖能力。结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1后的NIH3T3细胞内有大量hIGF-1 mRNA和蛋白质的表达;MTT检测显示转染pcDNA3.1-hIGF-1的NIH3T3细胞光吸收值增大,与未转染的NIH3T3细胞组比较,差异具有显著性(P<0.01);流式细胞仪检测显示转染组细胞,S期比例增加（59.3%）,G₁期比例减少（27.2%）。结论：pcDNA3.1-hIGF-1质粒转染成纤维细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进成纤维细胞的增殖。