RNA干扰survivin基因在EC109细胞中作用的体内实验研究

目的研究RNA干扰survivin基因对EC109细胞体内增殖的影响。方法构建siRNA-survivin真核表达载体，转染EC109细胞，筛选得到稳定细胞克隆。同时设非特异siRNA载体转染为对照；通过裸鼠移植瘤模型的成瘤时间、瘤结节重量，比较各组细胞在体内的增殖速度；免疫组织化学染色检测移植瘤的细胞凋亡。结果siRNA-survivin转染的EC109细胞组在裸鼠体内成瘤时间为（8．86±1．069）d，高于其它各组；平均瘤重为（0．32±0．12）g，低于其它组，均有显著差异（P〈0．05）；TUNEL法细胞凋亡检测，siRNA-survivin转染的EC109细胞组的凋亡指数为（10．52±4．35），高于其它组，具有显著性差异（P〈0．05）；结论RNA干扰survivin基因具有抑制人食管癌EC109细胞体内增殖的作用，诱导细胞的凋亡是其重要作用机制。     

RNA干扰survivin基因在EC109细胞中作用的体内实验研究

目的研究RNA干扰survivin基因对EC109细胞体内增殖的影响。方法构建siRNA-survivin真核表达载体,转染EC109细胞,筛选得到稳定细胞克隆。同时设非特异siRNA载体转染为对照;通过裸鼠移植瘤模型的成瘤时间、瘤结节重量,比较各组细胞在体内的增殖速度;免疫组织化学染色检测移植瘤的细胞凋亡。结果siRNA-survivin转染的EC109细胞组在裸鼠体内成瘤时间为(8.86±1.069)d,高于其它各组;平均瘤重为(0.32±0.12)g,低于其它组,均有显著差异(P<0.05);TUNEL法细胞凋亡检测,siRNA-survivin转染的EC109细胞组的凋亡指数为(10.52±4.35),高于其它组,具有显著性差异(P<0.05);结论RNA干扰survivin基因具有抑制人食管癌EC109细胞体内增殖的作用,诱导细胞的凋亡是其重要作用机制。     

基因沉默的新技术:RNA干扰

RNA干扰(RNAi)是广泛存在于多种生物体内的一种自我保护现象,是由双链RNA(dsRNA)介导的、序列特异的转录后基因沉默,是在mRNA水平抑制相应序列基因表达的过程。RNAi作为一种新的基因治疗的工具,有着诱人的广阔前景。     

RNA干扰ERCC1基因对肺癌细胞药物敏感性的影响

目的 探讨RNA干扰切除修复交叉互补基因1(ERCC1)对肺癌细胞药物敏感性的影响.方法 将肺癌A549/DDP细胞分为阴性组、空白组、ERCC1-shRNA1组及ERCC1-shRNA2组,通过不同方法检测分析ERCC1的mRNA和蛋白表达水平,及不同顺铂(DDP)浓度下肺癌细胞的凋亡程度.结果 阴性组、空白组的ER...     

小干扰RNA抑制PTTG基因对人胰腺癌细胞PANC-1侵袭能力的影响

目的研究P1TG基因沉默对胰腺癌细胞侵袭力的影响,探讨其与胰腺癌细胞侵袭性的关系及调控机制。方法阳离子脂质体转染PITG siRNA对PANC-1中的PITG基因进行干扰;利用RT-PCR和Western blot技术检测其基因沉默效应;通过Transwell小室法测定PANC-1细胞侵袭能力的改变。结果转染PTTG siRNA后,PANC-1细胞中PTTG的mRNA转录和蛋白表达受抑,显著低于未经处理的PANC-1细胞（P〈0．01）。利用PITGsiRNA对PITG进行RNA干扰后,PANC-1细胞的侵袭能力下降。结论设计的PITGsiRNA能有效抑制体外培养PANC-1细胞中PTIG的mRNA转录和蛋白表达水平,实现其基因沉默效应。P1TG与人胰腺癌的侵袭能力密切相关,其表达水平下降导致细胞侵袭能力降低。     

X线照射对外周血淋巴细胞Ku70表达与染色体易位的影响

目的分析X线照射引起的染色体易位与DNA双链断裂修复蛋白Ku70表达的关系。方法收集12例健康人外周血标本进行X线照射(0.5 Gy、1 Gy和2 Gy剂量),并进行淋巴细胞分离培养。用荧光原位杂交(FISH)检测其染色体易位率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和western blot分别检测Ku70 mRNA和蛋白质的表达水平。分析X线照射剂量对染色体易位率和Ku70表达水平影响,以及染色体易位率与Ku70表达水平的相关性。结果 FISH检测结果表明,淋巴细胞经1 Gy和2 Gy剂量X线照射后,染色体易位率均高于对照组(P均0.05);Ku70 mRNA表达量随照射剂量增加而增加(P0.05);并且染色体易位率与Ku70在mRNA和蛋白质水平的表达存在弱相关(r分别为0.473、0.386,P均0.05)。结论染色体易位率和Ku70的表达都与X线照射剂量关系密切,且染色体易位率与Ku70表达间也存在相关性。     

RNA干扰HDAC1提高人宫颈癌HeLa细胞化疗敏感性研究

目的探讨体外应用RNA干扰技术抑制组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)表达,提高人宫颈癌HeLa细胞对顺铂敏感性的作用及机制。方法体外合成针对HDAC1的小干扰RNA(siRNA),脂质体法转染HeLa细胞,将其分为正常对照组(无干预措施)、阴性对照组(转染阴性对照siRNA)及siRNA干扰组(转染HDAC1基因siRNA)。采用Western blot法检测各组细胞HDAC1蛋白和乙酰化组蛋白H4(Ac-H4)的表达,采用聚合酶链反应(PCR)法检测HDAC1基因和NF-κB基因mRNA表达。HeLa细胞经不同浓度顺铂作用后,采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测对顺铂的敏感性,以及采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果与正常对照组及阴性对照组比较,siRNA干扰组HeLa细胞HDAC1基因mRNA和蛋白表达均降低(P0.05或P0.01),细胞内Ac-H4表达增加(P0.05),同时NF-κB基因mRNA表达降低(P0.05)。经不同浓度顺铂作用后,与正常对照组及阴性对照组比较,siRNA干扰组HeLa细胞对顺铂的50%抑制浓度降低(P0.05或P=0.01),细胞凋亡率增加(P0.01)。结论 HDAC1基因siRNA能够提高宫颈癌HeLa细胞对顺铂的敏感性,增加组蛋白乙酰化水平、抑制HDAC1基因及NF-κB基因表达可能是其作用机制。     

RNA干扰靶基因的体内研究进展

RNA干扰技术是本世纪肿瘤治疗中的研究焦点之一。肿瘤发病机制复杂,涉及多个异常表达的基因,这些异常基因在肿瘤发生、发展过程中互相影响,但其因果关系目前尚不清楚,因此在肿瘤的RNA干扰治疗中,学者针对不同的靶基因进行了研究,并得到不同的结果。本文就目前用于肿瘤RNA干扰靶基因的体内研究现状和进展进行综述。     

小分子干扰RNA抑制293T细胞中外源基因OX40的表达

目的研究小分子干扰RNA（siRNA）抑制293T细胞中OX40基因表达的可行性。方法根据大鼠OX40 cDNA已知序列，设计并化学合成一条含19个核苷酸siRNA。将此siRNA包装入质粒载体后，转化质粒到大肠杆菌中，经克隆，扩增，纯化。应用Lipofectamine 2000将OX40基因表达载体与其相应siRNA（OX40-siRNA）质粒共转染293T细胞，观察siRNA载体对OX40基因的抑制效应。在转染后48h用实时定量PCR从基因转录水平检测OX40基因的表达率，并以western blot在蛋白水平检查293T细胞中OX40蛋白的表达水平。结果siRNA转染293T细胞28h后，OX40靶mRNA及OX40蛋白的表达水平明显下降；且siRNA所介导的抑制效应与干扰载体剂量大小有关。结论siRNA能抑制293T细胞中OX40基因表达，从而为siRNA作为一种可能的治疗手段提供了理论依据。     

Ku70蛋白在前列腺癌中表达的临床研究

目的探讨Ku70蛋白表达与前列腺癌Gleason评分及前列腺特异抗原（prostate specific antigen,PSA）的关系。方法采用HE染色观察组织学形态,免疫组化SP法检测前列腺癌组织中Ku70蛋白表达,按前列腺癌Gleason评分和血清PSA值分组,比较各组间Ku70蛋白表达水平。结果 58例前列腺癌标本中Ku70蛋白均呈阳性表达,其表达强度与前列腺癌Gleason评分和血清PSA呈明显负相关。结论 Ku70蛋白表达水平能帮助判断前列腺癌预后及评价治疗效果,可用于临床指导个体化治疗。     

Ku protein targeting by Ku70 small interfering RNA enhances human cancer cell response to topoisomerase II inhibitor and gamma radiation

Ku protein is a heterodimer (Ku70 and Ku86) known to play an important role in V(D)J recombination, apoptosis, telomere fusion, and double-strand break repair. Its role in double-strand breaks is relevant to cancer therapy because lack of Ku86 causes one of the most radiation-responsive phenotypes (hamster cells, XRS5). Although it is known that the heterodimer is necessary for the various functions of this protein, the impact of targeting Ku in human cancer cells has not been shown due to lack of appropriate approaches. It is also not known whether complete knock-out of Ku protein is required to enhance the sensitivity of human cells to gamma radiation as Ku protein is much more abundant in human cells than in hamster cells. In the current article, we have investigated the direct effect of Ku70 depletion in human cervical epithelioid (HeLa) and colon carcinoma (HCT116) cells. We specifically targeted Ku70 mRNA by use of small interfering RNA (siRNA). Of the five Ku70 siRNA synthesized, three inhibited the expression of Ku70 by up to 70% in HeLa cells. We have tested the effect of chemically synthesized siRNAs for target sequence 5 (CS #5) on the response of HeLa cells 72 hours after transfection to gamma radiation and etoposide, as this showed the maximum inhibition of Ku70 expression. Ku70 siRNA induced a decrease in the surviving fraction of irradiated HeLa cells by severalfold. Similar sensitizing effects were observed for etoposide, a topoisomerase II inhibitor. Studies with HCT116 cells using the same Ku70 siRNA (CS #5) showed a direct correlation between expression of Ku70 and sensitization to radiation and etoposide treatments.     

Ku80表达抑制联合热疗对前列腺癌细胞放射敏感性影响的研究

目的探讨抑制PC3细胞中Ku80表达水平并结合热疗对前列腺癌细胞的辐射敏感性的影响。方法构建调节Ku80表达的siRNA载体,筛选转染后的PC3-Ku80（Ku80组）、PC3-p-actin（Vector组）、PC3-Ku80-siRNA（RNAi组）、PC3-pactin-siRNA（Scramble组）等4种稳定细胞株。在不同的条件下分别用7射线照射后行AnnexinV-FIC双染色及DAPI、TUNNEL染色检测细胞周期与凋亡情况,另取一组PC3一Ku80一siRNA细胞经42℃水浴30min,转37℃细胞培养12h再行射线照射,通过细胞周期与凋亡检测等了解不同组问放射效果的差异。结果Westernblot和RT-PCR分析表明转染后可明显调节PC3细胞中Ku80的表达,稳定转染的对数生长期细胞经7射线照射,细胞周期与凋亡检测结果显示随着Ku80表达的降低,细胞对放射治疗更趋敏感,5组细胞随7射线照射剂量的增加,细胞存活率下降,其中RNAi组的细胞存活率均低于对照组和Ku8q组,5组比较差异有统计学意义（F-0．953,P％0．001）。PC3-Ku80-siRNA细胞经热休克处理后再行射线照射,其存活率明显低于未经热休克处理的细胞株。结论抑制前列腺癌细胞中Ku80蛋白表达水平,结合热休克,可明显提高肿瘤组织对放射治疗的敏感性,这可能是一个较为理想的综合治疗前列腺癌的方法。     

HLA-A2小干扰RNA的设计及沉默效果检测

背景：人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）是人的主要组织相容性复合物,在移植排斥反应中起关键作用。降低HLA的表达,可以延长移植物的存活时间。目的：设计HLA-A2小干扰RNA,检测其对HLA-A2表达沉默的作用。方法：设计4种HLA-A2 siRNA靶点序列构建其慢病毒表达体系,体外感染HLA-A过表达的293T细胞,观察4种靶点的敲减效率并筛选出有效靶点序列。体外培养人胚肺成纤维细胞,并用携带目的干扰序列的慢病毒感染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察感染效率,应用Western blot检测在人胚肺成纤维细胞中对HLA-A2表达沉默的作用。结果与结论：根据Genbank中HLA-A2的mRNA序列,设计合成了3个小干扰RNA,在体外能有效的沉默HLA-A2在293细胞中的表达,将基因序列亚克隆入干扰载体后感染人胚肺成纤维细胞,也能有效的沉默HLA-A2的表达,效率达80%左右。     

体外合成特异siRNA及其对Hela细胞端粒酶基因表达抑制的研究

目的 针对端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因不同片断合成2条siRNA,比较其对Hela细胞端粒酶基因表达干扰作用的强弱,从而选择出更好的干扰靶位点.方法 用T7RNA聚合酶在体外转录合成siRNA,将合成的2段siRNA转染Hela细胞,对其干扰作用进行分析、鉴定.结果 用2段合成的特异siRNA转染Hela细胞...     

Oncolytic-adenovirus-expressed RNA interference for cancer therapy

Importance of the field: RNA interference (RNAi) has generated considerable excitement for its potential cancer therapeutic applications. Because of the difficulties in delivering a large amount of siRNA to cancer cells and the short half-life of siRNA, it is important to choose an efficient delivery system for transduction of siRNA into target cells. Oncolytic adenovirus offers a better platform by virtue of its high transfection efficiency and selective replication in cancer cells.

Areas covered in this review: This review focuses on the synergism between oncolytic adenovirus and siRNA antitumor responses, and discusses recent progresses in oncolytic-adenovirus-expressed siRNA.

What the reader will gain: siRNA-expressing oncolytic adenovirus can generate a significantly enhanced antitumor effect through gene knockdown and viral oncolysis.

Take home message: Due to its potency and target specificity, using siRNA delivery by oncolytic adenovirus has generated much excitement and will open new avenues for treatment of human cancer.