人外周血细胞因子诱导的自然杀伤细胞的体外高效扩增

使用干细胞生长培养基 (SCGM )和RPMI16 4 0培养基 ,设计不同浓度的抗CD3单抗、IL 2和PHA的培养条件 ,从健康成人外周血单个核细胞 (PBMC )中高效扩增细胞因子诱导的自然杀伤细胞 (CINK ) ,并用MTT法检测其细胞毒活性 ,优化CINK细胞的体外扩增技术。用优化的方法扩增 12例不同类型恶性肿瘤患者CINK细胞。结果显示 ,在以SCGM为基础培养基时 ,PBMC经抗CD3单抗、IL 2作用后获得大量增殖 ,在PHA存在时获得最大增殖 (P <0 0 5 ) ,扩增的CINK细胞以CD3 CD5 6 + NK细胞为主 ,扩增细胞的细胞毒活性显著高于相同来源的CIK细胞和CD3AK细胞 ,为应用CINK细胞进行自体肿瘤过继免疫治疗奠定了基础     

K652重组表达IL-6基因对NK细胞表型和功能的影响

目的:为了研究表达IL-6的重组K562细胞对自然杀伤细胞(NK)细胞的扩增数量、表型和功能的影响。方法:根据人类IL-6 c DNA的5'端序列,设计PCR引物以K562细胞c DNA文库的DNA为模板进行扩增,表达,转染,在K562细胞上表达IL-6基因,构建重组的K562工程细胞作为刺激细胞,以人外周血单个核细胞(PBMC)为扩增培养对象,使NK细胞在体外培养条件下得到大量的扩增。流式细胞仪分析NK细胞表型。将NK细胞作用到K562细胞,对其杀伤性进行功能分析,51Cr释放实验检测NK细胞对K562细胞杀伤水平的影响。结果:成功构建了表达IL-6的重组K562细胞,和PBMC共同孵育后,培养体系经过21 d的刺激后,IL-6重组K562细胞诱导PBMC扩增,CD56+CD16+CD3-细胞数量比诱导前扩增了(760±18)倍,CD56+CD16+CD3-细胞的纯度从培养前占PBMC的6%±0.4%,扩增后第3组结果比未扩增的多了91%±2%。细胞毒实验表明,在NK效应细胞∶K562靶细胞为5∶1时,扩增的NK细胞的杀伤率达到了92%±2%。结论:本方法以重组K562为刺激细胞,能够实现NK细胞体外的大规模制备,建立了优化的NK细胞体外扩增方法,且扩增的细胞杀伤K562细胞的活性较好。对于NK的大量扩增和应用于临床具有重要的指导意义。     

IL-2或IL-15协同结核分枝杆菌抗原诱导人外周血单个核细胞体外扩增细胞的特性比较北大核心CSCD

目的分析白细胞介素2(IL-2)或IL-15协同结核分枝杆菌抗原(MTB-Ag)诱导人外周血单个核细胞(PBMC)扩增细胞的生物学特性。方法采用MTB-Ag联合IL-2或MTB-Ag联合IL-15体外分别刺激正常人PBMC,培养至第12天时,经流式细胞术检测扩增细胞中γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞和CD4+T细胞所占的比例,以及分析3种淋巴细胞扩增的绝对数量。同时用MTT法检测两组扩增细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞中γδT细胞所占比例明显高于前者,NK细胞所占比例明显低于前者;而两组扩增细胞中CD4^+T细胞所占比例并无显著性差异。与2个刺激组中3种淋巴细胞数量的分析结果一致。并且MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞对不同肿瘤细胞均具有显著的杀伤活性,但与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,并无显著性差异。结论 IL-15协同MTB-Ag可高效诱导人PBMC产生以γδT细胞增殖为主的效应细胞,该扩增细胞在体外对肿瘤细胞具有显著的杀伤活性。     

树突状细胞对脐血来源细胞因子诱导杀伤、自然杀伤细胞杀伤活性及CD45RO表达的影响

目的:探索同一来源脐血树突状细胞(DCs)对细胞因子诱导杀伤(CIK)、自然杀伤(NK)细胞杀伤活性和CIK细胞上CD45RO表达的影响。方法:通过细胞因子组合诱导、扩增脐血来源的DCs、CIK和NK细胞,杀伤效应细胞分为两组:A组为接受DCs共孵育6d刺激的CIK、NK细胞,B组为未接受任何刺激的CIK、NK细胞,了解DCs对相应效靶比下CIK、NK细胞杀伤K562、HL-60细胞株细胞毒活性的影响;通过流式细胞术检测两组CIK细胞上CD45RO、CD45RA的表达率。结果:随着效靶比的升高,脐血CIK、NK细胞对肿瘤细胞株的杀伤力增加。在20∶1、10∶1效靶比下,A组CIK、NK细胞对HL-60的杀伤率分别为76.77％±5.76％、55.87％±2.09％,B组为61.14％±3.72％、49.96％±1.51％,A组对HL-60的杀伤明显高于B组;在20∶1效靶比下,A组对K562的杀伤明显高于B组;而在10∶1效靶比下两组之间的杀伤活性未见显著差异;A组CIK细胞上CD45RO表达率显著高于B组。结论:DCs与CIK、NK细胞共孵育可提高CIK、NK细胞的细胞毒活性及增加CIK细胞上CD45RO的表达。     

体外扩增人外周血来源免疫细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤作用

目的探讨人外周血来源的细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞、树突状细胞-细胞因子诱导杀伤(DC-CIK)细胞和自然杀伤(NK)细胞对人MDA-MB-231乳腺癌细胞的体外杀伤作用。方法采用含红色荧光蛋白标签(RFP)和萤光素酶报告基因(Luc)的慢病毒感染MDA-MB-231细胞,通过荧光显微镜检测MDA-MB-231细胞感染率。分离人外周血单个核细胞(PBMC),诱导获得CIK细胞、 DC-CIK细胞、 NK细胞,体外扩增培养。采用流式细胞术检测免疫细胞的扩增效果及表型,并检测体外扩增的人外周血来源免疫细胞在不同效靶比下对MDA-MB-231肿瘤细胞的抑制作用。结果 DC-CIK细胞、 NK细胞及CIK细胞对MDA-MB-231肿瘤细胞的杀伤作用随效靶比的增加以及作用时间的延长而增强。共培养72 h后,免疫细胞对靶细胞的杀伤率均达到90%以上。结论体外扩增的CIK细胞、 DC-CIK细胞、 NK细胞对乳腺癌细胞具有杀伤作用。     

IL-2或IL-15协同结核分枝杆菌抗原诱导人外周血单个核细胞体外扩增细胞的特性比较

目的 分析白细胞介素2(IL-2)或IL-15协同结核分枝杆菌抗原(MTB-Ag)诱导人外周血单个核细胞(PBMC)扩增细胞的生物学特性。方法 采用MTB-Ag联合IL-2或MTB-Ag联合IL-15体外分别刺激正常人PBMC,培养至第12天时,经流式细胞术检测扩增细胞中γδT细胞、自然杀伤(NK)细胞和CD4+T细胞所占的比例,以及分析3种淋巴细胞扩增的绝对数量。同时用MTT法检测两组扩增细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。结果 与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞中γδT细胞所占比例明显高于前者,NK细胞所占比例明显低于前者;而两组扩增细胞中CD4~+T细胞所占比例并无显著性差异。与2个刺激组中3种淋巴细胞数量的分析结果一致。并且MTB-Ag联合IL-15刺激组扩增细胞对不同肿瘤细胞均具有显著的杀伤活性,但与MTB-Ag联合IL-2刺激组相比,并无显著性差异。结论 IL-15协同MTB-Ag可高效诱导人PBMC产生以γδT细胞增殖为主的效应细胞,该扩增细胞在体外对肿瘤细胞具有显著的杀伤活性。     

人NK细胞体外高效扩增的实验研究

目的:建立人NK细胞体外大量扩增的方法。方法:采用基因工程方法,在K562细胞上同时表达IL-15、IL-18、4-1BBL3种基因,构建特定的K562工程细胞作为刺激细胞。IL-15、IL-18基因分别与一段特殊的跨膜蛋白基因融合,4-1BBL直接跨膜表达,使这3种蛋白在K562细胞中表达后锚定于细胞膜表面。其次,以照射致死的该K562工程细胞作为刺激细胞,以人外周血单个核细胞(PBMC)为扩增培养对象,通过与IL-2的共刺激作用,使NK细胞在体外培养条件下得到大量的扩增。结果:经过21d的刺激培养后,CD56 CD3-细胞数量扩增了(520±75)倍。CD56 CD3-细胞的纯度从培养前占PBMC的7%±4%到扩增后占总细胞比例的93%±3%。PBMC中的T细胞基本上没有得到扩增,扩增后的细胞中CD3 细胞只占2%±1.2%。扩增的细胞具备了NK细胞的基本特征和生物学特性,除了CD56 CD3-外,还对扩增的NK细胞上NKG2D、NKp46、NKp44、NKp30、CD94、CD158b、CD158a、NKB1、NKAT2等标记进行了验证。细胞毒实验表明,在效应细胞∶靶细胞为5∶1时,扩增的NK细胞的杀伤率达到了95%±4%。结论:建立的NK细胞体外扩增方法,达到了较高的扩增水平,且扩增的细胞活性较好。本方法以PBMC为原始材料,能够实现NK细胞体外的大规模制备,这将为抗病毒与抗肿瘤的NK细胞免疫治疗奠定基础。     

抗原特异性T细胞的体外扩增及其表型和效应功能检测

目的 探索一种HLA非依赖性的抗原特异性CD+和CD8+T细胞混合型扩增方法.方法 以巨细胞病毒(CMV)IE-1抗原为例,IE-1多肽库体外刺激外周血单个核细胞(PBMC)6 h后,磁珠筛选IFN-γ阳性细胞,加入放射灭活的PBMC于含IL-2的培养基中培养4周.结果 得到1.5×109个细胞,扩增效率达2500倍,其中CD8+T细胞占92.99%,CD4+T细胞6.88%,受阳性靶细胞刺激时,49.2%的T细胞分泌IFN-γ细胞杀伤率达58%(20:1).结论 该方法可在体外有效扩增T细胞,并从细胞因子的分泌及细胞毒杀伤活性分析,初步认为扩增的T细胞保持其表型和抗原特异性效应功能.     

IL-2、IL-15对NK细胞亚群表型和功能的调节作用

目的 探讨IL-2和IL-15对NK细胞亚群表型和功能的调节作用。方法 采用双色免疫荧光染色和流式细胞仪分析，比较IL-2和IL-15对新鲜分离外周血单个核细胞（PBMC)中NK细胞及经混合淋巴细胞培养(MLC)活化的NK细胞表型的调节作用；用4h ^51Cr释放实验检测IL-2和IL-15对NK细胞杀伤水平的影响。结果 在PBMC培养中，当IL-2或IL-15最终为50U／mL时，能明显上调PBMC中CD56^ NK细胞的比例，且IL-15对CD56^bright亚群增殖的促进作用强于IL-2；在MLC中，当IL-2或IL-15为50U／mL时，能够促进MLC活化的NK细胞比率的增加，NK细胞亚群由CD56^dim为主转变成CD56^bright为主，此诱导作用IL-2强于IL-15。IL-2和IL-15都能上调PBMC和MLC中NK细胞杀伤水平，并呈剂量依赖关系，在PBMC中，当IL-15为50U／mL时，IL-15对NK细胞杀伤水平的促进作用强于IL-2；而在MLC中当IL-2为50U／mL时，对NK细胞杀伤水平的促进作用高于IL-15。在PBMC中，同时加入50U／mL的IL-15和IL-2，NK细胞杀伤率高于单独加入IL-15或IL-2。结论 IL-15促进PBMC中NK细胞向CD56^bright亚群分化和杀伤水平强于IL-2，而IL-2促进同种异体抗原诱导的活化NK细胞向CD56^bright亚群分化和杀伤水平则高于IL-15。这种反应格局的差别，可能与不同条件下NK细胞IL-2或/和IL-15细胞因子受体表达不同以及同时有其他细胞因子的协同作用有关。     

IFN-α磷酸化STAT1和STAT4诱导人NK细胞产生IFN-γ并增强其杀伤活性

目的研究IFN-α对CD56+NK细胞的细胞因子分泌、杀伤功能和细胞内信号传导的作用。方法分离健康人PBMC分别与培养液、IFN-α和IL-12培养,利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清中IFN-γ的水平。同时采用流式细胞仪在单个细胞水平上分析IFN-α诱导IFN-γ产生的细胞亚群以及该细胞亚群对肿瘤细胞的杀伤作用和信号传导机制。结果经IFN-α刺激后,PBMC能产生低剂量的IFN-γ。细胞亚群分析的结果表明,IFN-α诱导CD56+NK细胞产生IFN-γ,但对CD4+T和CD8+T细胞无明显作用。IFN-α促进NK细胞的杀伤功能。促进STAT1和STAT4磷酸化。结论 IFN-α通过磷酸化STAT1和STAT4,增加NK细胞IFN-γ分泌和增强杀伤功能。     

一种简单快速的γδT细胞扩增方法

建立一种特异快速地诱导扩增人外周血γδT细胞的方法。用 5～ 10ml外周血通过CD3细胞的富集、γδ单抗的诱导以及肿瘤细胞刺激的培养体系进行γδT细胞的体外扩增。结果显示 ,γδT细胞能在短时间内快速大量扩增到 10 9～ 10 10 的数量级 ;诱导 4周的CD8、γδ阳性的细胞百分率分别为 42 6 9%和 5 8 6 7% ,明显高于诱导前的 2 3 97%和 6 6 2 % ;γδT细胞对NK敏感的K5 6 2细胞和NK抵抗的Daudi细胞均有较高的杀伤活性 ;γδT细胞对经抗HSP单抗封闭后的Daudi细胞的杀伤率明显下降。该培养体系是一种用血量少、特异、经济、快速的人外周血γδT细胞体外扩增方法。     

超抗原对NK细胞CD226分子表达与功能的调节

目的研究超抗原对NK细胞CD226分子表达与功能的调节。方法以超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A/B(SEA/B)活化PBMC为模型,应用双重免疫荧光染色和流式细胞术分析,观察CD226分子在NK细胞上的变化;采用51Cr释放实验,观察NK细胞在超抗原作用下杀伤功能的改变;利用激光共聚焦显微镜,观察CD226分子在NK细胞杀伤相的分布。结果在静止PBMC中,CD56 NK细胞的百分率为12.3%,CD56 CD226 细胞仅为1.4%。当效靶比为5∶1时,NK细胞对K562细胞的杀伤率为(3.2±0.2)%。当0.1mg/LSEA或SEB刺激PBMC1d后,CD56 NK细胞的百分率分别为13.5%和14.1%,CD226在NK细胞上的表达水平明显升高,且主要表达在CD56dim细胞上。在刺激第2天,SEA组CD56 CD226 占CD56 细胞69.1%,SEB组CD56 CD226 占CD56 细胞64.3%。刺激第3天,CD226在NK细胞上的表达水平均较第2天明显下降。在超抗原0.1mg/L作用3d中,SEA组和SEB组NK细胞杀伤率均明显高于同期未刺激组NK细胞的杀伤率及新鲜分离NK细胞的杀伤率(P<0.05),在作用的第2天,SEA组和SEB组杀伤率均达到峰值分别为(82.3±6.9)%和(80.6±7.5)%。激光共聚焦结果显示,CD226分子与LFA-1分子共定位于NK细胞与K562细胞的接触部位。结论超抗原SEA和SEB可提高NK细胞杀伤活性,可能与其促进CD226分子在NK细胞上的表达相关,CD226分子可能参与NK细胞免疫突触的形成。     

慢性粒细胞白血病患者DC对细胞因子诱导的杀伤细胞细胞毒作用的影响

目的 观察慢性粒细胞白血病（CGL）患者树突状细胞（DC）对自身细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）细胞毒的影响。方法 从CGL患者和正常人末梢血中分离单个核细胞（PBMC），用细胞因子（rhGM-CSF,rhIL-4和rHTNF-α)联合定向诱导培养DC。用CGL细胞抗原致敏DC，再将致敏的DC与CIK共同培养后，检测CIK对不同靶细胞的杀伤作用。结果 CGL患者和正常人的PBMC经细胞因子联合诱导培养后，DC占20．78％－56．0％。CGL患者的CIK和经CGL细胞抗原致敏的DC作用后的CIK，对自身白血病细胞的杀伤活性分别为56．0％和83．4％；正常人对照组则分别为30％和62％。经CGL患者CGL细胞抗原致敏的DC作用后的CIK, K562和SGC－7901的杀伤活性较未致敏的CIK活性低，而正常人对照组则无此现象。结论 从CGL患者的PBMC中能定向诱导扩增出DC。经CGL细胞抗原致敏的DC，能明显增强CIK对自身CGL细胞的杀伤活性。     

卡介苗(BCG)通过诱导IL-12产生和受体表达促进人NK细胞功能

目的:研究卡介苗(BCG)对人自然杀伤细胞(NK)功能的作用及其机制.方法:分离抗结核抗体阴性志愿者外周血PBMC、纯化NK细胞, 分别与BCG、 IL-12、 BCG+IL-12、 BCG+抗IL-12Rβ1 mAb(2B10)培养.利用ELISA方法检测培养上清液IFN-γ、 IL-12p40含量;利用ELISpot方法检测IFN-γ、颗粒酶B产生细胞的频率;利用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定杀伤功能.利用流式细胞术检测NK细胞IL-12Rβ1的表达.结果:BCG呈剂量依赖的方式诱导PBMC产生IFN-γ.在BCG刺激条件下, PBMC颗粒酶B分泌细胞数明显高于不加任何刺激剂组(P<0.05).BCG增强PBMC杀伤活性.BCG不能诱导纯化NK细胞产生IFN-γ, 但与IL-12同时刺激则表现出协同作用.纯化NK细胞经BCG刺激后杀伤活性与未刺激相比差异无统计学意义.BCG呈剂量依赖方式诱导PBMC产生IL-12、并促进NK细胞不同亚群表达IL-12Rβ1.2B10抗体抑制BCG对PBMC产生IFN-γ和分泌颗粒酶B的诱导作用.结论:BCG间接地促进NK细胞的生物学活性, 其部分机制是通过诱导单核细胞产生内源性IL-12、并上调NK细胞表达IL-12R.     

急性髓细胞白血病患者外周血淋巴细胞亚群的特征及临床意义

目的通过检测急性髓细胞白血病患者外周血各淋巴细胞亚群的分布,探讨该类患者免疫功能状况。方法通过流式细胞术检测健康对照组(n=20)、急性髓细胞白血病初发患者(n=31)及完全缓解期患者(n=31)外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞、TCRγδ+T细胞、CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)、CD16+CD56+NK细胞比例;通过细胞杀伤实验分析NK细胞和γδT细胞的杀伤活性以及与Treg的关系。结果与对照组相比,初发白血病患者和完全缓解患者外周血中CD4+T细胞、CD8+T细胞比例无明显差异,但CD4+CD25+Treg比例明显增高,TCRγδ+T细胞和CD16+CD56+NK细胞比例明显下降。初发病患者NK细胞和γδT细胞具有杀伤活性,但Treg能明显抑制其杀伤活性。结论急性髓细胞白血病患者外周血γδT和NK细胞虽具有杀伤功能,但比例明显下降,Treg对其杀伤功能具有抑制作用。     

HIV-1感染对NK细胞及其活化性受体CD226表达的影响

目的　评价HIV 1感染对NK细胞以及CD2 2 6 /PTA1表达的影响。方法　采用流式细胞术分析了 2 7例HIV 1感染者以及 16例健康献血员NK细胞相关膜抗原 ,用HIV 1SF3 3 株体外感染外周血单个核细胞 (PBMC) ,进行NK细胞活化表达CD2 2 6的动态观察。结果　 2 7例HIV 1感染者均处于无症状感染期 ,CD16 + CD3-、CD8+ CD3-细胞亚群百分率和绝对数均低于健康对照 (P <0 .0 5 ) ,CD16 + CD3-和CD8+ CD3-细胞中表达CD2 2 6的细胞比例显著高于对照 (P <0 .0 5 )。HIV 1和PHA均可体外诱导CD2 2 6在CD16 + NK细胞表面高水平表达。结论　CD2 2 6分子可能参与HIV 1感染诱导的NK细胞活化机制。     

结肠癌患者单核或树突状细胞MICA的表达及其与NK细胞活性的关联

目的:观察结肠癌患者单核或树突状细胞是否表达MHCⅠ类相关抗原A(MICA),并分析MICA+单核细胞的频率是否与患者体内NK细胞的活性相关联。方法:首先利用流式细胞仪检测MICA在外周血单核细胞和由单核细胞诱导而来树突状细胞(DCs)上的表达;并用IL-15和IFNα-刺激树突状细胞,观察MICA表达的变化;然后检测患者外周血NKG2D+、CD16+、CD69+NK细胞的频率及NK细胞的杀伤活性;最后分析MICA+单核细胞的频率是否与NK细胞表达NKG2D及其杀伤活性关联。结果:与健康个体相比,结肠癌患者MICA+单核细胞的频率无显著变化。未成熟DCs表达MICA,但受IL-15和IFNα-刺激后,结肠癌来源的DCs表面MICA的表达无显著上调。结肠癌患者外周血NKG2D+、CD69+NK细胞的频率显著降低,NK细胞的杀伤活性显著降低,而CD16+NK细胞的频率无明显变化。结肠癌患者MICA+单核细胞的频率与NK细胞表达NKG2D无明显关联,但与NK细胞杀伤靶细胞时CD107a的表达正相关。结论:结肠癌患者体内单核细胞表达MICA与NK细胞表达NKG2D无关,但高频率MICA阳性的单核细胞与NK细胞的抗肿瘤活性正相关。     

不同刺激因子组合诱导NK细胞体外扩增及其功能的研究

目的探讨不同刺激因子组合对人自然杀伤细胞(NK细胞)体外扩增及其功能的影响。方法 VarioMACS分选健康成人外周血单个核细胞(PBMC)中的NK细胞,依据添加刺激因子的不同分为A组(IL-2)、B组(IL-2+IL-15)、C组(IL-2+IL-15+饲养细胞),饲养细胞为30 Gyγ射线照射后的同种异体外周血单个核细胞(allogeneic PB-MNCs,AlloMNCs),未添加任何刺激因子的细胞的作为对照组,在干细胞生长培养基(SCGM)中进行培养扩增14 d,第1天添加PHA及OKT3,第5天离心洗去;台盼蓝拒染法进行活细胞计数;流式细胞术检测分选及扩增前后CD56+CD3-NK细胞纯度;改良的MTT法检测NK细胞对K562、HO8910及PBMC的杀伤活性。结果经VarioMACS免疫磁珠阴性分选后NK细胞纯度由分选前的(9.2±2.9)%提高到(93.5±3.2)%,培养14 d后,除对照组NK细胞纯度降低外,其余组与扩增前无明显差异(P>0.05)。细胞扩增倍数分别为17.2±1.7、51.3±6.6和82.4±9.8倍,均显著高于对照组(5.7±1.2)(P<0.01)。实验组组间比较,C组明显高于A组和B组(P<0.01)。细胞杀伤实验表明,当效靶比为10∶1时,各组的杀伤活性显示为C组>B组>A组>对照组,C组扩增的NK细胞对K562及HO8910的杀伤率可分别达到(70.1±8.9)%和(64.6±6.2)%,显著高于对照组、A组(P<0.01)和B组(P<0.05),对PBMC的杀伤率仅为(4.2±1.2)%。结论经VarioMACS分选获得的NK细胞,在体外使用SCGM培养基培养,添加IL-2、IL-15和照射后AlloMNCs作为刺激因子,可获得高效扩增和有效活化的NK细胞,为NK细胞的肿瘤过继免疫治疗提供了一种简单有效的扩增高纯度NK细胞的方法。     

人脐血树突状细胞分泌外来体的特性及其增强CTL杀伤活性的研究

目的探讨脐血树突状细胞(UBDC)及其分泌的亚细胞结构外来体(exosomes)的特性,以及他们对细胞毒性T细胞(CTL)杀伤活性的增强作用。方法分离脐血单个核细胞(UBMC),用rhSCF、rhGM-CSF及rhIL-4诱导12d,加入经反复冻融提取的肿瘤细胞膜抗原,继续培养2d。收集DC并从其培养上清中通过离心(1×105g)分离外来体。用流式细胞术、SDS-PAGE、透射电子显微镜(TEM)和MTT比色法,对DC和外来体的特性及其对CTL杀伤活性的增强作用进行分析。结果用3种细胞因子体外诱导UBMC12d,可使其扩增10倍,并出现DC典型的形态特征。负载肿瘤抗原后,细胞表面可高表达MHC-I、MHC-II、CD40、CD80、CD86、CD11c和CD54。利用超速离心法能从DC培养上清中分离出外来体。混合淋巴细胞反应(MLR)和CTL杀伤活性的分析表明,脐血DC分泌的外来体能有效地刺激T细胞增殖并增强CTL的杀伤活性。结论由UBMC可诱导出大量的DC并分泌外来体。后者可有效地向CTL细胞递呈肿瘤抗原使之活化并增强其杀伤活性。     

IL-23单独或联合IL-2对人PBMC增殖及抗白血病活性影响的研究

目的比较单独应用IL-23或联合应用IL-23和IL-2对人外周血单个核细胞(PBMC)增殖及抗白血病活性的影响。方法密度梯度离心法分离人PBMC,以不同的细胞因子培养液培养,MTT比色法测定PBMC的增殖情况及PBMC对白血病K562细胞株的杀伤活性,流式细胞术分析诱导前后PBMC的细胞表型变化。结果细胞因子各组培养PBMC 1 d、3 d、5 d后,PBMC的增殖以及对K562细胞的杀伤活性均增强(P<0.05),IL-23与IL-2联合后PBMC的增殖以及杀伤活性进一步增强(P<0.05);IL-23(50 ng/ml)与IL-23+IL-2(50 ng/ml+100 IU/ml)组作用于PBMC 5 d后,检测CD3+细胞为(80.7±4.37)%和(83.2±4.04)%,CD16+CD56+细胞为(8.4±0.28)%和(12.7±0.9)%,CD4+细胞为(45.2±1.4)%和(47.0±1.72)%,CD8+细胞为(34.5±2.53)%和(35.4±2.11)%;与对照组相比,两组对PBMC细胞表型的增加有显著性差异(P<0.05);两组间比较CD16+CD56+细胞的表达上有显著性差异(P<0.05),对CD3+、CD4+、CD8+细胞的表达以及CD4+/CD8+比值的变化无显著性差异(P>0.05)。结论 IL-23对PBMC的增殖,以及PBMC对K562细胞的杀伤均有促进作用,与IL-2联合有协同作用。IL-23单独或联合IL-2诱导后PBMC中CD3、CD16/56、CD4、CD8抗原的表达均增加,二者联合后可以进一步增加CD16/56抗原的表达。