RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子表达

目的：应用RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子（VEGF）表达。方法：将VEGF基因作为RNA干扰的靶区，通过E—RNAi网上提供的服务，设计两个特异的RNA干扰序列，将其装入含U6启动子的载体上，构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA（shRNA）表达载体，再转染人胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2，通过RT—PCR、Northern杂交和免疫荧光观察VEGF表达受抑的程度。结果：成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体，RT—PCR发现其在HEK293和HT29细胞系中，能明显抑制VEGF基因的表达，抑制率分别为72％和42％。但在Hela和HepG2细胞中的抑制率仅为28％和13％；Northern杂交显示，在HEK293细胞和HT29细胞中，VEGF mRNA明显受抑，抑制率达88％和89％；免疫荧光显示，在HT29细胞中，VEGF蛋白表达的受抑制率为73％。结论：针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制VEGF基因的表达，但在不同细胞系中的作用强度存在差别。     

靶向Survivin的siRNA对胰腺癌细胞PC-2的放射增敏作用

目的采用RNA干扰技术阻断Survivin基因的表达,观察其诱导胰腺癌细胞凋亡及对放射的增敏作用。方法构建靶向Survivin的siRNA真核表达载体,采用lipofectamineTM2000转染胰腺癌细胞PC-2,采用半定量RT-PCR、免疫组化技术检测转染前后PC-2细胞Survivin基因表达的变化;采用流式细胞术检测其诱导PC-2细胞凋亡及对放射的增敏作用。结果靶向Survivin的序列特异性的siRNA可以有效地抑制PC-2细胞Survivin基因的表达,在mRNA水平其表达抑制率为81.25%;在蛋白质水平其表达抑制率为74.24%;转染靶向Survivin的siRNA真核表达载体48h后可以诱导7.03%的细胞凋亡;阻断Survivin基因的表达,可以显著提高PC-2细胞对放射的敏感性,靶向Survivin的siRNA联合放射可以诱导14.58%的细胞凋亡。结论本研究所构建的靶向Survivin的siRNA真核表达载体可以有效、特异地阻断Survivin基因的表达,阻断Survivin基因的表达可以诱导一定程度的PC-2细胞的自发凋亡,并显著增强其对放射的敏感性。靶向Survivin的RNA干扰技术在胰腺癌的基因治疗中具有重要的潜在价值。     

人甲胎蛋白基因启动子siRNA表达载体的构建及效应鉴定

目的：探索基于人甲胎蛋白基因启动子构建的siRNA表达载体介导目的基因RNA干扰的可行性，为实现肝癌细胞靶向RNAi治疗作一初步研究。方法：PCR法扩增获得人甲胎蛋白基因启动子并插入pSilencer1．0-U6中以置换其U6启动子；依据hLRH-1基因RNAi靶位点设计出siRNA模板DNA，体外合成相应寡核苷酸片段后经退火形成短双链，再克隆构建成靶向人hLRH-1基因siRNA表达载体；脂质体转染法将上述重组质粒转入HepG2细胞中，实时定量PCR法初步分析所建系统在AFP表达细胞中触发靶基因hLRH-1的RNAi效应，以及hLRH-1调控下游靶基因的表达改变。结果：获得人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体pSiAFP。所建的RNAi载体系统可在表达AFP的HepG2细胞中有效诱导靶基因hLRH-1表达下调，抑制率约达85％；同时调控hLRH-1下游靶基因CyclinE 1与Oct4的表达相应下调。结论：人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体可在表达AFP的HepG2细胞中有效介导靶基因的RNAi效应。     

VEGF特异性核酶对Hela细胞VEGF表达的调节

目的：构建VEGF特异性发夹状核酶基因真核表达载体，观察其对Lela细胞VEGF表达的调节。方法：将核酶基因克隆入pcDNA3中，构建了抗VEGF发夹状核酶真核表达载体pcDNA3-RZ,并进行了核酶的体外切割活性检测。将真核表达载体转染人宫颈癌Hela细胞，采用RNA斑点杂交、流式细胞仪免疫荧光及免疫细胞化学方法，检测Hela细胞中VEGFmRNA和VEGF蛋白的表达水平。结果：所构建的重组表达载体pcDNA3-RZ正确，体外切割检测该核酶具有较高的切割活性。转染了pcDNA-RZ的Hela细胞中VEGFmRNA和VEGF蛋白的表达水平明显下降。结论：成功地构建了抗VEGF发夹状核酶基因真核表达载体，该载体能明显抑制Hela细胞VEGF的表达。     

Survivin shRNA重组慢病毒构建及对A549细胞增殖的影响

背景与目的 Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的成员,在多种肿瘤组织中高度表达而在终末分化细胞中极少表达,因此可以作为癌症治疗的理想靶点.本研究旨在通过构建Survivin基因shRNA的慢病毒质粒并干扰肺癌细胞A549中Survivin的表达,分析其对细胞增殖的影响.方法 设计Survivin干扰靶序列,构建重组质粒;将pLL3.7-Survivin转染293T细胞后利用Hela细胞检测病毒的滴度并感染A549细胞,应用RTPCR和Western blot检测干扰效果;MTT与流式细胞术分析其对细胞增殖的影响.结果 本研究成功构建了重组质粒;重组质粒可抑制A549细胞中Survivin基因的表达;细胞受阻于G2/M期.结论 本研究构建的重组质粒可抑制Survivin基因的表达并影响细胞的增殖,其为研究RNAi介导的肺癌基因治疗打下基础.     

RNAi沉默喉鳞癌Hep-2细胞株VEGF-C mRNA基因表达的实验研究

目的构建针对喉鳞癌细胞株Hep-2中血管内皮生长因子C（vascular endothelial growthfactor C,VEGF—C）的siRNA表达载体,研究载体介导的RNAi技术对喉鳞癌细胞株Hep-2中VEGF—CmRNA表达的抑制作用。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以VEGF-C为靶基因,同时随机组合出一条对照序列,分别合成2对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成互补DNA双链,克隆入siRNA表达载体pSuper—neo中,转化鉴定后进行PCR和DNA序列测定。用脂质体介导转染入喉鳞癌Hep-2细胞株,采用RT—PCR方法检测细胞VEGF—C基因mRNA水平的变化。结果成功构建发卡样VEGF—CsiRNA真核表达载体;转染VEGF—C靶向siRNA（pSuper—neo—siV1）的Hep-2细胞,VEGF—C基因的表达水平较无关对照组pSuper—neo—siV2和转染空载体pSuper—neo的对照组显著下降。结论成功构建载体介导的VEGF—C靶向RNA干扰重组体,并能有效抑制Hep-2细胞中VEGF—CmRNA表达。     

人类Survivin基因真核表达载体的构建及其在K562细胞中的表达

 目的　构建带有绿色荧光蛋白的Survivin基因真核表达载体pIRES2-EGFP／Survivin,并转染K562细胞。方法　以 pDNR／Survivin质粒为模板,PCR扩增Survivin基因,T-A 克隆,亚克隆至pIRES2-EGFP上,并对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用Superfect转染试剂转染K562细胞。提取细胞RNA,RT-PCR检测Survivin基因mRNA表达。结果　经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP／Survivin载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的K562细胞有绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR证实转染细胞中存在Survivin基因mRNA的表达。结论　pIRES2-EGFP／Survivin表达载体构建成功,并在K562细胞内成功表达。     

人bax基因逆转录病毒表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

[目的] 构建带有报告基因EGFP的bax基因逆转录病毒表达载体，建立高表达bax基因的Hela细胞。[方法] 通过RT-PCR方法从Hela细胞克隆bax基因，根据基因工程原理，经PCR、酶切等方法构建bax基因和报告基因EGFP双基因逆转录病毒表达载体pLBax SN-IRES2-EGFP．转染Hela细胞后，荧光显微镜和Western Blotting检测bax基因的表达情况。[结果] 成功构建了带有EGFP的bax基因的逆转录病毒表达载体，并将其转入Hela细胞。[结论] 成功建立的高表达bax基因的Hela细胞株，为探讨bax基因与放射敏感件之间的关系奠定了基础。     

慢病毒介导的shRNA靶向干扰I2PP2A胃癌稳定细胞株的建立

背景与目的：蛋白磷酸酶2A抑制剂-2(inhibitor 2 of protein phosphatase 2A,I2PP2A)在包括胃癌的多种肿瘤中过度表达,提示其可能在胃癌的发生中发挥重要作用。为进一步探讨I2PP2A的功能及其在胃癌发生中的作用,建立稳定抑制I2PP2A基因表达的人胃癌BGC823细胞株。方法：筛选出I2PP2A基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA并构建pGLV2_shRNA_I2PP2A慢病毒载体,酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染BGC823细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,通过实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和蛋白［质］印迹法(Western blot)鉴定I2PP2A的表达。结果：重组慢病毒质粒经测序鉴定正确;RT-PCR和Western blot证实干扰I2PP2A后,BGC823细胞株中I2PP2A表达水平明显降低,抑制率约为90%。结论：成功构建了I2PP2A shRNA慢病毒表达载体,建立了稳定抑制I2PP2A基因表达的人胃癌BGC823细胞株,为进一步研究I2PP2A在胃癌发生中的作用提供了可靠的细胞模型。     

DHFR基因RNA干扰质粒载体的构建及鉴定

目的:构建二氢叶酸还原酶(dyhidrofolate reductase,DHFR)基因RNA干扰质粒载体,为探讨抑制DHFR基因表达在卵巢癌铂类耐药治疗中的意义奠定基础。方法:设计DHFR基因靶向的发夹状siRNA,筛选出最佳siRNA沉默片段,退火后连接入pGPU6/GFP/Neo载体,转化后进行序列鉴定,脂质体转染SKOV3细胞株,并进行荧光摄像。结果:将退火后的双链寡核苷酸片段连接到pGPU6/GFP/Neo载体,测序结果正确。转染SKOV3细胞后,PCR鉴定干扰效果,C418筛选稳定细胞株。结论:成功构建针对DHFR基因的siRNA载体,找到了有效的干扰靶序列,转染SKOV3细胞后,DHFR基因的表达明显减弱。