rhBMP-2对骨骼肌卫星细胞增殖与粘附的影响

目的探讨人重组骨形态发生蛋白(rhBMP)-2对骨骼肌卫星细胞增殖与粘附的影响.方法体外分离与培养骨骼肌卫星细胞,分别用0、50、100、500、1000 ng/ml的rhBMP-2诱导培养基培养48h.利用MTT法测定细胞增殖能力的变化,通过荧光法测定接种后1h的粘附细胞率.结果rhBMP-2可促进骨骼肌卫星细胞的增殖,这种作用从BMP浓度为500ng/ml即可表现出来,并随着浓度的增加而越发明显.在rhBMP-2作用下骨骼肌卫星细胞的粘附率增高,在500ng/ml的浓度时达最高,但当BMP浓度进一步增大时,细胞粘附率却不再增加.结论rhBMP-2可促进骨骼肌卫星细胞的增殖,增强其粘附特性.     

rhBMP－2对骨骼肌卫星细胞增殖与粘附的影响

目的：探讨人重组骨形态发生蛋白（rhBMP）－2对骨骼肌卫星细胞增殖与粘附的影响。方法：体外分离与培养骨骼肌卫星细胞,分别用0、50、100、500、1000ng/ml的rhBMP-2诱导培养基培养48h。利用MTT法测定细胞增殖能力的变化,通过荧光法测定接种后1h的粘附细胞率。结果：rhBMP-2可促进骨骼肌卫星细胞的增殖,这种作用从BMP浓度为500ng/ml即可表现出来,并随着浓度的增加而越发明显。在rhBMP-2作用下骨骼肌卫星细胞的粘附率增高,在500ng/ml的浓度时达到最高,但当BMP浓度进一步增大时,细胞粘附率却不再增加。结论：rhBMP-2可促进骨骼肌卫星细胞的增殖,增强其粘附特性。     

骨形态发生蛋白对骨骼肌卫星细胞粘附特性的影响及其机制

目的：探讨骨形态发生蛋白（BMP）对骨骼肌卫星细胞粘附特性的影响。方法：体外获取与培养骨骼肌卫星细胞，分别用0、50、100、500、1000μg/L的BMP诱导培养基诱导培养48h。通过荧光法测定接种后1h的粘附细胞率，利用放射免疫法测定细胞层粘连蛋白的含量。结果：BMP可促进骨骼肌卫星细胞的粘附，在500μg/L的浓度时粘附率最高，当BMP浓度进一步增加时，细胞粘附率不再增加；BMP诱导后可促进骨骼肌卫星细胞层粘连蛋白的表达，当BMP浓度为500μg/L时这种作用最强。结论：BMP可增强骨骼肌卫星细胞的粘附特性，其机制与层粘连蛋白的表达增高有关。     

重组人骨形成蛋白2与骨诱导剂对大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的观察重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein2,rhBMP-2)与骨诱导剂对SD大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的增殖与成骨作用。方法体外培养大鼠MSCs,分为实验组与对照组。对照组:不加rhBMP-2与骨诱导剂。实验组:骨诱导剂单独作用于SD大鼠MSCs(A组);rhBMP-2分别以浓度为10(B组)、50(C组)、100(D组)、200μg/L(E组)单独作用于SD大鼠MSCs;rhBMP-2分别以浓度为10(F组)、50(G组)、100(H组)、200μg/L(I组)联合骨诱导剂作用于SD大鼠MSCs。测定第3、6、9、12天的增殖状况(MTT法)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和骨钙素(osteocalcin,OC)水平。结果倒置相差显微镜观察SD大鼠MSCs原代培养时,细胞接种12h后即可贴壁;48h细胞成梭形,形似成纤维细胞;4d时细胞为多角形、纺锤形;6d时,成纤维细胞散在分布,少量呈集落样生长,为漩涡状、放射状排列;10d左右,细胞基本铺满瓶底,融合成片。传代细胞5~7d即可长满瓶底。各时间点A~I组均能显著促进MSCs成骨活性(ALP和OC)的表达。B~E组同时具有促进MSCs增殖作用,并呈浓度依赖性;F~I组增殖及ALP、OC含量均高于A~E组,比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论rhBMP-2与骨诱导剂联合作用可在促进MSCs增殖的同时提高其成骨活性。     

骨骼肌卫星细胞移植对心肌梗死区残存心肌细胞体积的影响

目的 研究自体骨骼肌卫星细胞移植对梗死心肌残存心肌细胞体积的影响。方法 自犬臂部取骨骼肌,体外提取、培养、扩增骨骼肌卫星细胞,4‘,6-diamidino-2-phenylindone(DAPI)荧光标记,经结扎的左冠状动脉前降支远端灌注移植入自体急性心肌梗死区域。2、4、8周后处死动物,取心肌标本行组织形态学及心肌细胞体积检测。结果 梗死区部位观察到带荧光的卫星细胞及肌纤维,部分己分化成横纹肌并以闰盘相连。正常心肌细胞随梗死时间增长,可见细胞切面积及体积增加,呈现肥大趋势。骨骼肌卫星细胞移植治疗组梗死残存心肌细胞肥大明显,细胞切面积、面积、体积与对照组比较差异有显著意义。细胞肥大以细胞宽度及厚度为主,细胞长度未见明显变化。结论 骨骼卫星细胞移植入硬死心肌肌,可促使梗死残存心肌细胞肥大,从而利于心肌收缩力的恢复。     

bFGF植入失神经骨骼肌对肌卫星细胞增殖与肌萎缩影响的实验研究

目的探讨bFGF植入失神经腓肠肌后填补神经营养因子丢失、促进肌卫星细胞增殖、延缓肌萎缩的作用。方法将28只健康雄性Wistar大鼠随机分成实验组和对照组,每组14只。切断大鼠左下肢坐骨神经,制备失神经支配动物模型。实验组于同侧腓肠肌内植入盛有0.1gbFGF的硅胶管,对照组植入盛有生理盐水的硅胶管。术后14d和30d取材行大体观察,电生理检测纤颤电位波幅变化,腓肠肌湿重测量,组织学观察,图像分析仪检测及透射电镜观察。结果术后14d和30d对照组腓肠肌萎缩程度及与周围结缔组织粘连程度均较实验组明显加重。术后14、30d,实验组腓肠肌纤颤电位波幅为(0.2206±0.3010)μm,对照组为(0.1552±0.0503)μm;实验组肌湿重为(2.4757±0.2546)g,对照组为(1.4591±0.6425)g;两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。术后14、30d实验组HE染色示腓肠肌内肌卫星细胞核较对照组增多;Mallory三色染色示对照组蓝色结缔组织略多于实验组;PCNA染色示实验组呈阳性反应,棕黄色细胞核略多于对照组;维生素C银染示实验组肌纤维间维生素C浓度和结缔组织增生均低于对照组。透射电镜观察术后30d,对照组肌丝排列紊乱或模糊不清等萎缩改变的肌纤维及肌纤维间的胶原纤维多于实验组。术后30d,实验组肌纤维直径和截面积分别为(66.3686±12.6727)μm和(2096.1129±311.5639)μm2,对照组分别为(55.5040±4.9450)μm和(1418.0680±264.9537)μm2;实验组PCNA阳性肌细胞核数量为(116.200±5.357)个,对照组为(53.000±3.937)个;两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论bFGF具有促进失神经腓肠肌的肌卫星细胞增殖、延缓肌纤维萎缩和抑制肌纤维向结缔组织增生的作用。     

梗死心肌骨骼肌卫星细胞移植后心肌细胞结蛋白变化

目的 观察骨骼肌卫星细胞梗死心肌移植后心肌细胞结蛋白的变化。方法 自犬臀部取骨骼肌体外提取、培养、扩增骨骼肌卫星细胞,４’,６－二脒基－２－苯吲哚（ＤＡＰＩ）荧光标记,经结扎的左冠状动脉前降支远端灌注移植入自体急性心肌梗死区域,２周、４周和８周后将犬处死,取病理标本行免疫组织化学检测心肌细胞结蛋白表达、组织切片染色观察组织结构。结果 在梗死区部位观察到带荧光的细胞核及纤维,部分已分化成横纹肌并以闰盘相连。正常区域心肌细胞结蛋白排列位于心肌细胞Ｚ线处,可见清晰显示的肌小节;梗死区心肌细胞结蛋白表达明显高于正常区域心肌细胞,但排列紊乱,整个心肌细胞均见阳性表达的结蛋白,未见肌小节;４周、８周时治疗部分梗死心肌细胞已恢复排列并重见肌小节,但梗死区心肌细胞结蛋白表达仍明显高于正常区域心肌细胞（Ｐ〈０．０１）。结论 骨赂     

高能震波对骨痂中骨形成蛋白表达的影响

目的 观察高能震波（ＨＥＳＷ）对骨痂中骨形成蛋白（ＢＭＰ）表达的影响，探讨其促进骨折愈合的机理。方法 手术造成家兔双侧胫骨中段标准骨折模型，对一侧胫骨骨折部施以ＨＥＳＷ，另一侧为对照组，术后每周进行Ｘ线及组织学检查，并取骨痂组织切片用ＢＭＰ抗体进行免疫组化染色（ＳＡＢＣ法（）。结果 实验组骨痂中ＢＭＰ表达强度在第２－４周时明在于对照组（Ｐ〈０．０１），且Ｘ线摄片及组织学观察均显示实验组骨折愈合时间     

骨形成蛋白与骨疾患关系的研究进展

目的：了解骨形成蛋白（ＢＭＰ）与机体骨疾患者发生发展的关系。方法：综述了近五年来ＢＭ与骨疾患关系的研究进展。结果：Ｂ屿骨发育异常、遗传性骨疾病、某些骨 异位骨化等有着直接或间接的关系。结论：搞清ＢＭＰ与机体骨疾患的关系。有助于进一步了解疾病的发病机制、病程进展和预后,为选择合适的治疗方法提供指导。     

纤维蛋白胶复合骨形成蛋白的注射型骨修复材料对兔骨髓基质细胞增殖和分化的影响

目的观察以纤维蛋白胶（fibrin sealant，FS）为载体复合骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的注射型骨修复材料对体外培养的兔骨髓基质细胞（marrow stromal cells，MSCs）增殖和分化的影响，为其临床应用提供实验依据。方法取3日龄新西兰兔骨髓进行培养传代，采用第3代细胞进行研究。实验分为3组，实验组：以含1μg／ml rhBMP-2注射型FS培养细胞；FS对照组：以单纯FS培养细胞；空白对照组：不作任何处理。采用细胞培养、组织化学及电镜等方法对各组兔MSCs的增殖、贴壁率、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性及染色、Ⅰ型胶原表达、超微结构及细胞在材料中的生长情况进行观察。结果各组细胞促增殖作用由强到弱依次是：FS对照组→实验组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）；对细胞贴壁率的影响总体由强到弱依次是：FS对照组→实验组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）。各组ALP活性由强到弱依次是：实验组→FS对照组→空白对照组，各组间差异均有统计学意义（P〈0.05）；各组细胞的Ⅰ型胶原表达水平由高到低依次是：实验组→FS对照组→空白对照组，差异均有统计学意义（P〈0.05）。扫描电镜观察，材料表面粗糙，有微孔存在，FS对照组、实验组细胞与材料融合生长。透射电镜观察：实验组细胞向成骨细胞分化程度高，但细胞增殖活性较FS对照组稍差；FS对照组细胞向成骨细胞分化的程度较实验组低，细胞增殖活性较好；空白对照组的细胞增殖活性较差，胞外基质少。结论以FS为载体复合BMP的注射型骨修复材料可显著提高MSCs向成骨细胞方向的分化水平，但对MSCs促增殖作用不明显。     

骨髓基质干细胞在骨形成蛋白诱导下异位成骨及应用于人造骨的实验研究

目的 研究经分离培养的骨髓基质干细胞（MSC）在骨形成蛋白（BMP）诱导下在体内外的异位成骨效应,为研制一种本身具有成骨能力的人造骨材料提供实验依据。方法 分离、培养Wistar大鼠MSC,体外实验将MSC＋BMP分别在培养板和弥散小室内培养,体内实验将MSC＋BMP与人工珊瑚骨（CHA）制成复合移植体,种植在大鼠背肌内,用形态学、组织化学和免疫组化方法观察其成骨效应。结果 MSC在体外（培养板和弥散小室）只形成软骨基质,在体内复合移植体（CHA＋BMP＋MSC）形成骨质,其成骨效应比对照组A（CHA＋MSC）和对照组B（CHA）强。结论 复合移植体（CHA＋BMP＋MSC）有可能被研制成本身具有成骨能力的人造骨材料。除BMP外,移植体植入的机体和局部还存在其它诱导成骨的因子,进一步探讨这些因子的作用,将对研制这种理想的人造骨材料具有重要意义。     

组织工程骨修复兔颅骨缺损中骨形态发生蛋白的表达

目的 探讨组织工程骨修复骨缺损,内源性骨形态发生蛋白（BMP）在组织工程骨再生过程中的分布及作用,方法 将自体成骨样细胞即刻种植在胶原包埋的聚羟基乙酸（PGA）基质材料上, 然后将该复合体或单纯基质材料移植到兔颅骨的一侧全层骨缺损区,作为实验侧Ⅰ或实验侧Ⅱ。对凤对照,不作任何植入。18只新西兰兔分别于术后3、8及14天处死,标本行组织学及BMP免疫组织化学检查,切片上,确定骨缺损区中央,距骨断端2mm、5mm为A、B、C三区,利用真彩色计算机图像分析系统在各区间测量BMP值。结果 术后3天,实验侧Ⅰ基质间存在BMP阳性细胞,8天时,实验侧Ⅰ新骨形成明显优于实验侧Ⅱ及对照侧。14天时,实验侧Ⅰ可见骨小梁形成,对照侧为纤维组织修复。BMP定量分析中,实验侧（Ⅰ、Ⅱ）三区的BMP值高于对照侧,但实验侧的浓度梯度差值小于对照侧。结论 即刻种植于PGA基质材料上的成骨样细胞在体内可合成和分泌BMP,利用组织工程技术将内源性BMP局限于骨缺损区,提高内源性BMP浓度并改善其分布,可能是组织工程骨诱导骨再生机制之一。     

骨骼肌失神经和再神经化时肌卫星细胞的变化

目的探讨骨骼肌失神经和再神经化时肌卫星细胞的变化规律，了解肌肉相应形态功能变化的细胞学机制。方法取1月龄Wistar大鼠27只制成失神经肌萎缩模型，于术后1～6个月，逐月取3只大鼠双侧小腿三头肌行组织学、组织化学等形态学检测；同时于术后1、2、3周和1～6个月逐月各取1只大鼠双侧小腿三头肌行细胞生物学检查。取1月龄Wistar大鼠35只制成神经再生模型，分别于失神经即时、术后1～6个月逐月取5只大鼠行神经植入手术，动态观察电生理指标变化至植入术后8周，然后进行形态学指标检测。结果骨骼肌失神经组显示肌湿重、肌细胞截面积迅速减少，胶原纤维含量逐渐增加，失神经后3～4个月DNA增殖期核所占百分比最高，后迅速减少，肌卫星细胞失神经3周数量开始明显增加，但2个月后急剧下降，至4个月时含量已极低。神经再生组神经植入后4～5周可引出肌诱发动作电位，以萎缩2～3个月后神经植入再生效果好，此时肌卫星细胞的分化能力较强。结论骨骼肌失神经支配4个月后卫星细胞数量极少导致肌肉进入萎缩的不可逆期；当失神经2～3个月时再神经化，增殖能力活跃的肌卫星细胞促使此时的萎缩肌功能恢复较好。     

重组人骨形成蛋白-2与胶原复合物的表面植骨成骨作用研究

目的　评价重组人骨形成蛋白 - 2 (rh BMP- 2 )与胶原复合物在大鼠颅骨表面的成骨作用。方法　用 SD大鼠 9只在两侧颞部各制备一骨膜下袋后 ,分为实验侧和对照侧。右侧植入 rh BMP- 2与胶原复合物为实验侧 ,左侧植入单纯胶原作为对照 ,分别于术后 2、4及 8周处死动物各 3只 ,取标本制作脱钙石蜡切片 ,观察成骨情况 ,并测量成骨厚度。结果　 rh BMP- 2与胶原复合物可在颞骨表面通过膜内成骨的方式诱导新骨形成 ,并与颞骨外板良好结合 ,术后 2周 ,植入物大部分降解吸收 ,颞骨表面有大量新生骨 ;术后 4周 ,植入物完全为新骨代替 ,颞骨厚度约为厚原度的 5倍 ;术后 8周 ,新骨更加成熟 ,颞骨厚度约为原厚度 2 .8倍。而对照侧骨质在术后各周均无明显增厚。结论　 rh BMP- 2与胶原复合物可作为良好的表面植骨替代材料 ,并能与植骨床良好结合     

骨形成蛋白2基因修饰的老年大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究

目的观察年龄因素对骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)成骨分化能力的影响;了解基因治疗对老年大鼠MSCs成骨分化能力的影响. 方法 1月龄(幼年组)、9月龄(成年组)及24月龄(老年组)雄性Wistar大鼠各6只,取MSCs经体外分离、培养及携带骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因的腺病毒载体(Ad-BMP-2)转染后,定量检测BMP-2、碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)表达,以及成骨细胞标志性蛋白:Ⅰ型胶原、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)和骨桥素(osteopontin, OPN)的表达.将转染的各组MSCs分别与磷酸三钙(tricalcium phosphate, TCP)复合后植入裸鼠体内,3周后取材,比较各组诱导异位成骨能力. 结果 ELISA检测表明BMP-2基因修饰的MSCs可以有效表达BMP-2,且表达量在各年龄组间差异无统计学意义(P>0.05);各组ALP于诱导后第9天达高峰,但组间差异均无统计学意义(P＞0.05);诱导后第7天,RT-PCR半定量检测示各组均有成骨细胞特征性蛋白,即:Ⅰ型胶原、OPN及BSP的明显表达,表达量在各组间差异无统计学意义(P>0.05);BMP-2基因转染的MSCs与TCP复合后可诱导裸鼠体内异位成骨,各组成骨量差异无统计学意义(P>0.05). 结论 BMP-2基因修饰的老年大鼠MSCs可以恢复成骨分化能力,基因治疗可能为老年性骨骼疾病提供一种新的治疗途径.     

骨形成蛋白2活性多肽体外定向诱导骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的剂量依赖性研究

目的探讨自行合成的骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP-2)活性多肽对大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)体外定向诱导成骨的能力,评价BMP-2活性多肽的成骨诱导性及诱导成骨的剂量依赖性。方法取4周龄Wistar大鼠分离培养MSCs,传至第3代时改用条件培养基,培养基中分别加入浓度为300、200、100、50及0μg/ml的BMP-2活性多肽,并依次记为A、B、C、D和E组。细胞培养至5、10、15及20d,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,测定钙含量,采用实时荧光定量PCR(fluorescent quantitativePCR,FQ-PCR)检测型胶原、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及骨钙素(osteocalcin,OCN)mRNA的表达,检测不同浓度BMP-2活性多肽体外诱导成骨的能力。结果倒置相差显微镜下观察,用条件培养基培养3～4d后,培养细胞由长梭形转变为短梭形或多角形。随条件培养基中BMP-2活性多肽浓度的增加,细胞发生成骨样改变的时间提前。ALP活性和钙含量检测显示,A组和B组较其他组增加明显,且差异有统计学意义(P<0.05),但A、B组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。FQ-PCR检测发现不同浓度条件培养基培养14d后,型胶原、OPN和OCN mRNA在各组均有表达。Ct值表明其表达量的大小顺序为A、B、C、D组,E组无表达,A组和B组的Ct值明显大于C组和D组,差异有统计学意义(P<0.05),但A组和B组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论BMP-2活性多肽能有效地促进MSCs向成骨方向分化,其诱导作用存在剂量依赖关系,最佳诱导剂量为200μg/ml。     

克隆并构建人骨形成蛋白2真核表达载体

目的探讨构建人骨形成蛋白2(human bone morphgenetic protein 2,hBMP 2)真核表达载体的方法.方法由人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA,利用RT PCR方法扩增获得hBMP-2基因cDNA,将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM T hBMP-2重组质粒载体,转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒.分别用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3.1( )真核表达载体,将克隆载体中hBMP基因重组到pcDNA3.1( )真核表达载体,提取质粒作酶切电泳、PCR鉴定及DNA测序.结果人骨肉瘤细胞中经RT-PCR得到1.2kbp的hBMP 2扩增条带,重组质粒pGEM T-hBMP 2经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP 2条带和4.0 kbp的载体片断;pcDNA3.1 hBMP-2质粒经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP-2条带和5.0kbp的载体片断,重组质粒酶谱分析与预期一致;DNA序列分析测序结果校对后经BLAST分析,表明核酸序列与Gene Bank中和hBMP-2的mRNA序列完全吻合.结论通过此方法能成功克隆获得hBMP-2基因,并构建其真核表达载体.     

自体微小颗粒骨复合骨形成蛋白修复兔桡骨缺损

目的探讨自体微小颗粒骨复合I型胶原以及骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)移植修复节段性兔桡骨缺损的效果。方法新西兰大耳白兔56只，切取自体髂骨研磨成微小颗粒，分别与BMP及I型胶原复合，实验分成4组（n=16)。A组：自体微小颗粒骨复合BMP、I型胶原，B组：自体微小颗粒骨复合I型胶原，C组：自体微小颗粒骨，用于修复兔桡骨干1．5cm缺损的动物模型。D组：空白对照组(n=8)，双侧桡骨缺损不作处理。术后2、4、8和12周，行X线片、组织学观察，骨密度及生物力学检测，比较各移植物修复节段性骨缺损的疗效。结果X线片显示，A组术后8周即可使骨缺损完全修复，而B组术后12周使骨缺损完全修复。术后8、12周骨量测定A组成骨量最多，12周生物力学测定显示移植物修复后的骨缺损具有最佳生物力学表现，而C组则不能完全修复骨缺损。结论自体微小颗粒骨复合BMP、I型胶原及自体微小颗粒骨复合I型胶原均能有效修复节段性骨缺损，以复合BMP移植效果更理想。