负载乳腺癌干细胞RNA树突状细胞疫苗抗肿瘤免疫机制的研究

目的:通过制备负载乳腺癌干细胞RNA的树突状细胞疫苗,研究其抗肿瘤免疫机制.方法制备乳腺癌干细胞RNA树突状细胞疫苗的采用细胞毒性试剂盒检测2种乳腺癌干细胞疫苗[(A组,CD44+CD24-+MCF-7-CTLs)、(B组,MCF-7-CTLs)]和(C组,DC-CTLs)的体外细胞杀伤能力.取24只小鼠均分为四组:A1组皮下接种活化的A组疫苗+MCF-7乳腺癌细胞;B1组接种活化的B组疫苗+MCF-7乳腺癌细胞;C1组皮下注射活化的DCs-CTLs+MCF-7乳腺癌细胞;D1组单用MCF-7乳腺癌细胞作为对照.分析裸鼠接种后肿瘤在体内的生长情况.结果:体外对CD44+CD24-+MCF-7乳腺癌细胞杀伤能力强度:A组>B组>C组(P<0.05).体外对MCF-7乳腺癌细胞杀伤能力强度:B组>A组>C组(P<0.05).在体成瘤实验显示,B1组和A1组的成瘤时间分别为第7周和第6周,明显长于D1组(第1周)和C1组(第2周)(P<0.05).结论:CD44+CD24-乳腺癌干细胞RNA树突状细胞疫苗诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞能够产生特异性免疫应答,从而发挥抗肿瘤作用.     

肿瘤干细胞标志物ALDH1及CD133在乳腺癌中的表达及意义

目的:通过检测醛脱氢酶-1(ALDH1)及CD133的表达,探讨其作为乳腺癌干细胞标志物的敏感性和特异性。方法:应用免疫组织化学方法,检测乳腺癌干细胞标志物ALDH1及CD133在人乳腺癌组织中的表达。结果:ALDH1在乳腺癌中的表达阳性率为40.74%,ALDH1阳性染色主要分布于肿瘤细胞的胞浆,胞核不染色,阳性细胞散在分布于肿瘤组织中,部分区域可见阳性细胞密集分布现象。CD133阳性细胞表现为位于胞膜、胞浆上的棕褐色染色,胞核不染色。在27例乳腺浸润性导管癌中6例CD133呈阳性,阳性率为22.22%,并且随着乳腺癌组织学级别的增高其表达增高。结论:ALDH1及CD133联合应用可作为乳腺癌干细胞的特异性标志物。     

乳腺癌患者外周血ALDH1~(high)CD44~+CD24~(-/low)细胞含量变化及其临床意义

目的:检测乳腺癌患者外周血ALDH1highCD44+CD24-/low细胞含量的变化,探讨其与乳腺癌发生的关系及临床意义。方法:观察对象为46例Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期乳腺癌患者和12名健康女性志愿者(对照组)。采用流式细胞仪检测、分析各组外周血中ALDH1high细胞和ALDH1highCD44+CD24-/low细胞含量及其变化情况。结果:①所有样本均能检出ALDH1high细胞,各组间均数比较差异无统计学意义(P>0.05);②Ⅳ期乳腺癌组的外周血ALDH1highCD44+CD24-/low细胞含量与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.05),而其他各组间比较差异无统计学意义(P>0.05);③Ⅳ期乳腺癌患者原发癌灶免疫组化结果各不相同,但均可在外周血中检出ALDH1highCD44+CD24-/low细胞。结论:①各组中的ALDH1high细胞含量无显著差异,说明ALDH1具有普遍干细胞性质;②ALDH1highCD44+CD24-/low细胞含量与乳腺癌的发生有明显相关性。③ALDH1highCD44+CD24-/low细胞与乳腺癌的免疫分型无相关性。     

E-钙黏蛋白与miR-200c在MCF-7/ADR及乳腺癌组织的表达研究

目的探讨乳腺癌耐药株中E-钙黏蛋白（E-cadherin）和miR-200c的表达,以及E-cadherin表达与新辅助化疗疗效的关系。方法应用定量RT-PCR方法检测人乳腺癌细胞株MCF-7和阿霉素耐药株MCF-7/ADR中E-cadherin、Twist1以及miR-200c表达,采用免疫组化法检测82例乳腺癌患者新辅助化疗前组织E-cadherin表达。结果与MCF-7相比,E-cadherin在MCF-7/ADR中表达明显降低（P=0.01）,Twist1在MCF-7/ADR中表达明显升高（P〈0.01）,miR-200c在MCF-7/ADR表达较MCF-7显著下降（P〈0.01）。结论 E-cadherin和miR-200c表达下调参与乳腺癌阿霉素耐药,可能是逆转乳腺癌耐药的潜在治疗靶点。     

不同化疗药物对三阴乳腺癌亚型的作用效果研究

目的探究不同化疗药物对不同三阴乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)亚型的作用效果。方法培养人三阴乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-468、SKBR-3、HCC1937细胞株,MTT法测定各株细胞在不同化疗药物(表柔比星、紫杉醇、5氟尿嘧啶、顺铂、环磷酰胺)作用下的增殖抑制,经流式细胞仪分析各细胞株中ALDHhiCD44+CD24-/low干细胞的含量以及在不同药物作用后其含量的变化,Western印迹检测不同细胞株内ERCC1、TOPOIIα、TS、β3-tubulin等耐药相关蛋白的表达情况。结果体外实验中,不同三阴乳腺癌亚型细胞株对不同的化疗药物反应性不同,细胞株中ALDHhiCD44+CD24-/low细胞含量不同,耐药相关蛋白表达存在差异。结论不同化疗药物对三阴乳腺癌亚型的作用效果存在差异,这种差异体现在干细胞含量、蛋白表达水平等多个层面上。     

槲皮素逆转人乳腺癌MCF - 7细胞阿霉素耐药及其相关机制的研究

目的 探讨槲皮素（quercetin,Que）逆转人乳腺癌MCF - 7细胞阿霉素（doxorubicin,Dox）耐药及其相关机制。方法 用不同浓度的槲皮素处理MCF - 7细胞及其阿霉素耐药的MCF - 7/dox细胞,MTT法筛选无毒剂量的槲皮素用于实验。用无毒剂量的槲皮素联合不同浓度的阿霉素处理MCF - 7和MCF - 7 /dox细胞,MTT法检测细胞增殖率,Transwell法检测细胞侵袭能力,流式细胞法检测细胞凋亡率和人乳腺癌干细胞表面标志物CD44+/CD24 - /low的表达, Western - blot检测人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 ,PTEN）及磷酸化的丝氨酸/苏氨酸激酶（Phosphorylated serine/threonine kinases,p - AKT）的表达。结果 与MCF - 7细胞组相比较,MCF - 7/dox细胞组的乳腺癌干细胞表面标志物CD44+/CD24 - /low表达增高(P＜0.01),且PTEN的表达降低、p - AKT的表达升高(P＜0.05);与单用阿霉素组相比较,阿霉素与槲皮素联合应用能抑制细胞增殖和侵袭、诱导细胞凋亡、杀死肿瘤干细胞,并能上调PTEN、下调p - AKT的表达。结论 槲皮素能有效逆转人乳腺癌MCF - 7细胞阿霉素耐药,其机制可能与槲皮素协同阿霉素杀死人乳腺癌干细胞,调控PTEN/AKT信号通路有关。     

Twist及其相关调控基因在不同转移性人乳腺癌细胞中的差异表达

目的:观察不同转移潜能人乳腺癌细胞株中Twist及其相关调控基因mRNA表达的差异。方法:培养低侵袭性人乳腺癌细胞株MCF-7和高转移性人乳腺癌细胞株MDA-MB-435S,采用RT-PCR法检测两种细胞株中Twist、脆性组氨酸三联体(FHIT)、皮性钙黏附素(E-cadherin)、细胞凋亡相关基因Mcl-1、Bcl-2和Bax mRNA表达的差异。结果:MCF-7中FHIT、E-cadherin、Bax mRNA的表达显著高于MDA-MB-435S细胞,Twist mRNA在MDA-MB-435S细胞中的表达明显高于MCF-7,Mcl-1、Bcl-2 mRNA在两种细胞株中的表达无明显差异。结论:Twist、FHIT、E-cadherin、Bax mRNA表达差异可能与人乳腺癌细胞的不同转移潜能有关。     

溴泰君(W198)联合加温逆转MCF-7/ADM细胞株耐药的实验研究

[目的]观察溴泰君(W198)联合加温对人乳腺癌耐药细胞的耐药逆转作用.[方法]以人乳腺癌细胞MCF-7为对照,以人乳腺癌耐药细胞MCF-7/Adm为研究对象,当阿霉素(Adm)作用浓度为1μg·ml-1时,不同温度加温(37℃～42℃)与不同浓度(0.125μmol·L-1～1.0μmol·L-1)W198联合作用1h条件下,检测MCF-7及MCF-7/Adm的细胞生长抑制率、细胞内Adm的荧光强度、细胞表面P-糖蛋白(p-gp)荧光强度,统计分析其与加温温度和W198浓度间的变化趋势.[结果]MCF-7/Adm细胞对Adm的敏感性明显低于MCF-7细胞.加温联合W198作用于MCF-7/Adm,随加温温度和W198浓度增加,细胞表面P-gp表达降低,细胞内Adm浓度及细胞生长抑制率增加.42℃加温与1.0μmol·L-1W198联合作用时能最大程度的逆转MCF-7/Adm对Adm的耐药.[结论]加温联合W198对于人乳腺癌耐药细胞的耐药逆转具有协同作用.     

二甲双胍拮抗STAT3信号通路在人乳腺癌顺铂耐药细胞凋亡中的作用

目的 分析二甲双胍拮抗信号传导与转录活化因子3(STAT3)信号通路在人乳腺癌顺铂耐药细胞凋亡中的作用。方法 MCF-7细胞株为A组,MCF-7/DDP细胞株为B组,MCF-7/DDP细胞株+DDP为C组,MCF-7/DDP细胞株+二甲双胍为D组,MCF-7/DDP细胞株+STAT3抑制剂STA-21为E组。A组和B组采用正常培养基培养,C组MCF-7/DDP细胞株加入1μg/ml DDP培养,D组MCF-7/DDP细胞株加入5 mmol/L二甲双胍培养,E组加入10μmoL/L的STAT3抑制剂STA-21培养。对MCF-7细胞株和MCF-7/DDP细胞株采用CCK-8法检测DDP的敏感性;采用平板克隆试验检测各组细胞增殖数目;采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;采用免疫荧光法检测各组受体相互作用蛋白(RIP)1和RIP 3蛋白表达水平;采用免疫印迹法检测各组细胞STAT3、p-STAT3、Caspase及p-Caspase蛋白表达水平。结果 浓度分别为0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml及100μg/ml的DDP对MCF-7细胞IC50值均高于MCF-7...     

MCF-7耐米托蒽醌细胞株甲基化结合蛋白表达

目的 研究乳腺癌细胞(MCF-7)经米托蒽醌诱导耐药后其甲基化结合蛋白(Methyl-DNA-binding protein,MBD)的表达变化,并分析在MCF-7细胞经诱导产生多药耐药性中与甲基化结合蛋白的关系.方法 利用耐米托蒽醌的MCF-7耐药株,并用未染毒的野生型MCF-7为对照,通过蛋白印迹法检测不同浓度米托蒽醌处理的细胞组乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)和甲基化结合蛋白MBD1、MBD2及MBD4的蛋白表达水平.结果 跟野生型MCF-7比较,随着染毒浓度的增大,乳腺癌耐药蛋白BCRP的表达逐渐增加,而MBD1、MBD2、MBD4的表达均呈降低趋势,且MBD4的降低尤为明显,与对照组比较,其MBD4蛋白表达水平分别为(0.910±0.049)、(0.835±0.065)、(0.708±0.082)、(0.660±0.145)(P＜0.05).结论 在米托蒽醌诱导产生耐药的MCF-7细胞株中,MBDs的表达,尤其是MBD4,有可能参与了肿瘤耐药的形成.     

三苯氧胺对雌激素受体阳性乳腺癌细胞侵袭转移能力的影响及其机制

目的探讨三苯氧胺（TAM）对雌激素受体阳性乳腺癌细胞侵袭转移能力的作用及机制。方法用不同浓度（10-7、10-8、10-9mol/L）的TAM作用于人乳腺癌MCF-7细胞株,48h后,用Transwell侵袭小室法检测细胞的侵袭能力,用RT-PCR法检测细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和金属蛋白酶组织抑制物-1（TIMP-1）基因的表达。结果上述浓度的TAM对MCF-7侵袭转移均有一定的抑制作用,均可下调其MMP-9基因表达,上调其TIMP-1基因表达,但组间比较没有显著性差异。结论 TAM可抑制雌激素受体阳性MCF-7乳腺癌细胞的侵袭和转移,在10-9mol/L～10-7mol/L之间,没有明显的剂量依赖关系;其作用机制与影响MMP-9/TIMP-1的平衡有关。     

Evaluation of Hydro-Alcoholic Extract of Eclipta alba for its Multidrug Resistance Reversal Potential: An In Vitro Study

The development of multidrug resistance (MDR) causes problems in the chemotherapy of human cancer. The present study was designed to evaluate and establish the role of Eclipta alba as MDR reversal agent using multidrug resistant hepatocellular carcinoma cell line (DR-HepG2). To develop DR-HepG2, hepatocellular carcinoma cell line (HepG2) was transfected with 2-Acetylaminofluorene (AAF) and Aflatoxin B1 (AFB). Cytotoxic effects of the Eclipta alba hydroalcoholic extract (EAE) and standard anti-ancer drug Doxorubicin (DOX) were determined in DR-HepG2 and the parental cells HepG2 using MTT assay. The expression level of MDR1 gene and P-glycoprotein (P-gp) level was analyzed by RT-PCR and western blotting. From the present investigation, it was found that EAE (10 and 20 μg/ml) could significantly inhibit cell proliferation in DR-HepG2 whereas DOX (0.5 μg/ml) could not because of enhancement effect of MDR1/P-gp. This study demonstrated for the first time the antiproliferative activities of EAE in multidrug resistant DR-HepG2 cells. The findings revealed that Eclipta alba components are effective inhibitors of MDR1/P-gp.     

枸橼酸芬太尼对乳腺癌细胞体外增殖和侵袭的影响

目的:探讨枸橼酸芬太尼对人乳腺癌MCF-7细胞体外增殖和侵袭的影响。方法:分别用0.000 1μmol/L、0.01μmol/L、1μmol/L的枸橼酸芬太尼处理MCF-7细胞,MTT比色法检测MCF-7细胞增殖;流式细胞仪检测MCF-7细胞细胞周期;采用划痕实验及侵袭小室法检测MCF-7细胞侵袭能力。结果:MTT比色法显示不同浓度枸橼酸芬太尼处理的MCF-7细胞的增殖率分别为(58.84±11.31)%、(54.37±9.89)%和(51.83±10.33)%,明显低于对照组;各组MCF-7细胞停滞在G2/M期的比例增加,S期比例减少;各实验组及对照组划痕实验显示48 h时间段的愈合率分别为(70.41±6.86)%、(64.36±3.87)%、(62.52±4.95)%和(83.34±4.59)%;侵袭小室实验显示枸橼酸芬太尼在体外具有抑制MCF-7细胞侵袭转移作用。结论:芬太尼可抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖、使细胞周期停滞于G2/M期,并且降低其侵袭能力,对MCF-7细胞的生物学性状产生较大的影响。     

姜黄素对人骨肉瘤细胞株/阿霉素多药耐药逆转作用的实验研究

目的观察姜黄素对多药耐受糖蛋白(P-gp)介导的人骨肉瘤细胞株/阿霉素(U-2OS/ADM)细胞多药耐药(MDR)的逆转作用。方法以阿霉素为诱导药物,人骨肉瘤细胞系U-2OS为诱导对象,采用大剂量冲击法建立人骨肉瘤多药耐药细胞系模型(U-2OS/ADM),采用MTT法检测姜黄素作用于U-2OS/ADM细胞前后对化疗药物的逆转;流式细胞仪检测细胞内罗丹明-123积聚和外排的影响。结果 MTT显示姜黄素20μmol/L能增加不同浓度阿霉素对U-2OS/ADM细胞的抑制作用(P<0.01),且姜黄素对阿霉素为2.0μg/ml时的U-2OS/ADM细胞抑制作用增加幅度达49%。FCM结果显示,姜黄素能增加阿霉素对U-2OS/ADM的细胞毒性作用,且呈剂量依赖关系。结论姜黄素可有效逆转U-2OS/ADM细胞的多药耐药现象的作用。     

乳腺癌中MDR1/P-gp与CerbB-2、p53表达的关系及临床意义

目的探讨乳腺癌中多药耐药基因MDR1/P-gp与CerbB-2、p53表达的关系及临床意义。方法采用免疫组化SP法,检测186例手术切除的乳腺癌组织中P-gp与CerbB-2、p53蛋白的表达。结果乳腺癌组织中P-gp与CerbB-2、p53蛋白的阳性表达率分别为41.4%、51.1%、38.7%。P-gp蛋白阳性组CerbB-2过表达率高于P-gp蛋白阴性组,过表达率分别为37.66%、20.18%,差异有显著性意义(P<0.01)。P-gp蛋白阳性组p53过表达率也高于P-gp蛋白阴性组,过表达率分别为28.57%、15.60%,差异有显著性(P<0.05)。P-gp表达与患者原发肿瘤的大小、淋巴结转移状况、TNM分期、病理类型以及E、P激素受体状况无关(P>0.05)。CerbB-2、p53表达在淋巴结转移的乳腺癌患者中明显升高。结论乳腺癌中存在MDR1/P-gp与CerbB-2、P53基因共表达,与多药耐药有关。联合检测可为乳腺癌患者综合治疗方案的选择提供重要的依据。     

p53及p21^wafl蛋白表达与人舌癌细胞多药耐药性的关系

目的 探讨p53及p21^wafl蛋白表达与人舌癌细胞系Tca8113多药耐药性（MDR）的关系。方法 采用脂质体介导的转染技术，将野生型p53（wt-p53）基因导入人舌癌耐药细胞系Tca8113／BLM；分子信标（Molecular Beacon）法检测人舌癌细胞系Tca8113及其耐药细胞系Tca8113／BLM中p53基因的mRNA水平；Western blot检测亲本、耐药细胞和转染细胞中p53、p21^wafl、P-gp和MRP蛋白的表达变化；MTT法检测不同细胞的药物敏感性，流式细胞仪检测细胞周期的改变，激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡。结果 在人舌癌耐药细胞系Tca8113／BLM中p53基因的表达明显下调，并且未检测到p21^wafl蛋白的表达；转染了wt—p53的耐药细胞Tca8113／BLM／p53中p53和p21^wafl蛋白表达均显著上调，而P-gP和MRP的蛋白表达则明显下调，其对药物BLM的敏感性增加10．1倍（P〈0．01）；转染细胞的周期也发生改变，G2期细胞增加，G1和S期细胞减少，转染细胞明显出现凋亡。结论 人舌癌耐药细胞系Tca8113／BLM多药耐药性的产生，可能通过p53和p21^wafl的表达下调使得多药耐药性相关蛋白P—gp和MRP表达上调来实现。     

p53及p21waf1蛋白表达与人舌癌细胞多药耐药性的关系

目的探讨p53及p21waf1蛋白表达与人舌癌细胞系Tca8113多药耐药性(MDR)的关系。方法采用脂质体介导的转染技术,将野生型p53(wt-p53)基因导入人舌癌耐药细胞系Tca8113/BLM;分子信标(Molecular Beacon)法检测人舌癌细胞系Tca8113及其耐药细胞系Tca8113/BLM中p53基因的mRNA水平;W estern blot检测亲本、耐药细胞和转染细胞中p53、p21waf1、P-gp和MRP蛋白的表达变化;MTT法检测不同细胞的药物敏感性,流式细胞仪检测细胞周期的改变,激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡。结果在人舌癌耐药细胞系Tca8113/BLM中p53基因的表达明显下调,并且未检测到p21waf1蛋白的表达;转染了wt-p53的耐药细胞Tca8113/BLM/p53中p53和p21waf1蛋白表达均显著上调,而P-gp和MRP的蛋白表达则明显下调,其对药物BLM的敏感性增加10.1倍(P<0.01);转染细胞的周期也发生改变,G2期细胞增加,G1和S期细胞减少,转染细胞明显出现凋亡。结论人舌癌耐药细胞系Tca8113/BLM多药耐药性的产生,可能通过p53和p21waf1的表达下调使得多药耐药性相关蛋白P-gp和MRP表达上调来实现。