用茜素红—锥蓝联合染色法对兔角膜内皮细胞活性的评价

利用茜素红—锥蓝联合染色法,对正常新鲜角膜和干燥保存角膜内皮细胞进行染色。正常新鲜角膜内皮细胞为六角形,边界呈桔红染色,核淡蓝色、蚕豆状;而保存角膜内皮细胞则仅可看到淡蓝色、蚕豆状细胞核。提示保存角膜与新鲜角膜内皮细胞染色所见有明显区别。     

角膜保存的现状与展望

角膜保存的关键是保存角膜内皮细胞的活性,因此关于角膜保存的研究主要是围绕角膜内皮细胞进行的。近年来随着眼库技术的发展,诸多学者针对各种保存方法中对内皮细胞的有利及有害因素进行了深入研究,取得了较大进展,使角膜保存质量有较大提高,时间也明显延长。对于一些原来认为是非活性保存的方法,现在也认为能保存一部分内皮细胞活性,有应用于穿透性角膜移植获得成功的报道。现就角膜保存技术近年来所取得的进展及未来发展趋势进行综述。     

器官培养法保存角膜对角膜内皮细胞活性的影响

成功的角膜保存方法应能很好地维持角膜内皮细胞的活性.测定角膜内皮细胞的活性是器官培养保存角膜中最为重要的环节之一.本文总结了常用的角膜内皮细胞观察方法以及现阶段对其凋亡的研究,分析了保存液中主要成分、不同脱水剂以及保存时间对角膜内皮细胞活性的影响.     

应用跨角膜内皮细胞膜电位评价角膜保存液的保存效果

目的角膜透明性的维持决定于角膜内皮细胞的功能，内皮细胞膜上的钠泵不断地进行着离子转运，从而维持角膜的正常水合状态，这种由离子转运所产生的电位差（跨角膜内皮细胞膜电位）直接反映着角膜内皮细胞的功能状态。本研究通过测定跨角膜内皮细胞膜电位评价角膜保存液的保存效果。方法使用Ｕｓｓｉｎｇ灌流小室分别测定了新鲜兔去上皮角膜片和保存于ＭＫ液、Ｋ液和高钾保存液不同时间的兔去上皮角膜片的跨角膜内皮细胞膜电位。结果新鲜兔角膜跨角膜内皮细胞膜电位值是０．４～０．５±０．１ｍＶ；随着保存时间的延长，３种保存液所保存的角膜片电位值均出现下降，二者呈线性关系。当保存至ｄ１２时，高钾保存液所保存的角膜其电位值最接近新鲜角膜。结论高钾保存液维持角膜内皮细胞活性的作用优于ＭＫ液和Ｋ液。     

角膜中期保存液的基础研究及初步临床应用

目的研制一种配方简单、适合我国国情的角膜中期保存液。方法人角膜27片、23片分别保存于角膜中期保存液与Optisol GS液,保存结束取周边角膜行苔盼兰和茜素红联合染色,计算角膜内皮细胞密度及角膜内皮细胞活性率,比较两组数据,保存7d和14d各取2片角膜进行扫描电镜检查。取8片角膜保存于中期保存液,所保存角膜用于临床角膜移植,对患者定期进行裂隙灯检查,角膜内皮照相。结果角膜中期保存液组平均保存时间（8.39±0.72）d,角膜内皮细胞平均密度为（2743.48±366.54）个/mm^2;Optisol GS液组平均保存时间（7.58±0.34）d,角膜内皮细胞密度为（2568.95±245.47）/mm^2,两组比较,差异无统计学意义;角膜中期保存液组的内皮细胞平均活性率（96.65±2.59）%高于Optisol GS液组（93.47±3.81）%,差异具有统计学意义。角膜中期保存液所保存角膜用于临床,4例病人术后随访4d～11m,角膜平均内皮细胞计数（2285.75±534.05）个/mm^2。结论角膜中期保存液可活性保存人角膜片长达2w,其保存效果与Optisol GS液相似,初步临床使用显示了较好的效果。     

Optisol中期保存液房水置换对角膜内皮细胞的保护作用

目的:研究Optisol中期保存液房水置换对角膜内皮细胞的保护作用。方法:采用4℃湿房保存方法保存离体兔眼球,设立房水对照组、Optisol中期保存液房水置换组,每组10只眼球。于低温保存开始前、保存后24,48及72h检测角膜厚度、角膜内皮细胞密度及形态,保存后72h取下角膜行胎盘蓝-茜素红染色,检测角膜内皮细胞存活率。结果:4℃湿房保存开始前两组平均角膜厚度、角膜内皮细胞密度及六角形细胞比率差异没有统计学意义(P>0.05)。保存后24h两组平均角膜厚度、角膜内皮细胞密度及六角形细胞比率差异没有统计学意义(P>0.05);保存后48h及72h两组平均角膜厚度、角膜内皮细胞密度及六角形细胞比率差异有统计学意义(P<0.05)。保存后72h房水对照组角膜内皮细胞存活率为(55±5.81)%,Optisol中期保存液房水置换组角膜内皮细胞存活率为(87.16±3.64)%,两组间比较有统计学意义(P<0.05)。结论:Optisol中期保存液房水置换对角膜内皮细胞活性有保护作用,可以提高湿房保存法的效率,延长有效保存时间至72h。     

改良C3F8保存法中期保存兔角膜植片的实验研究

目的采用改良的C3F8保存法中期保存新西兰白兔的角膜植片。方法将新西兰白兔眼的角膜植片采用C3F8保存于无菌小房,观察保存不同时间后角膜内皮细胞的数量、形态以及角膜厚度,并用同一保存时间的新西兰白兔角膜植片进行同种异体的穿透性角膜移植手术,观察术后第5天角膜植片中央部的角膜厚度以及内皮细胞密度。结果经C3F8中期保存3、5天后的角膜植片,其内皮细胞数量、大小与0天相比无明显的统计学差异,7、9天后的角膜植片,其内皮细胞数量减少,内皮细胞面积增大,而角膜厚度与0天相比有统计学差异。保存5天的角膜内皮细胞界限清晰,上皮细胞微绒毛结构形态正常。保存7、9天的角膜内皮细胞的边界不清晰。将保存后第3、5天的角膜植片行同种异体角膜移植术,术后第5天,保存3天及5天移植组与保存0天角膜植片相比,角膜内皮细胞计数及角膜厚度无显著性差异。结论采用改良的C3F8保存法中期保存角膜植片是可行的。     

不同保存方法对角膜内皮细胞活性的影响

目的:探索简易安全的中长期保存供体角膜方法,评价不同保存方法保存后角膜内皮细胞活性,为临床提供优质角膜材料。方法:建立简易中期保存液,深低温保存法保存大鼠角膜。将30只鼠眼随即分为3组。分别为湿房保存,中期保存液和深低温保存。采用活性染色对角膜内皮细胞进行评价。判定3种方法保存的角膜内皮细胞的活性状态。结果:使用中期保存液和深低温保存后复温的角膜植片内皮细胞密度和活性率与湿房保存组比较差异无显著性(湿房组细胞密度个/mm2为2729.5±158.0,ESR%为88.9±3.5;中期保存组分别为2646.8±217.2和86.9±2.7;深低温组分别为2706.2±184和287.3±3.3,P>0.05)。结论:简易中期保存液和深低温保存后角膜具有较好的内皮细胞活性和临床应用价值。     

角膜保存方法现状及进展

角膜内皮细胞(corneal endothelial cell, CEC) 是保证角膜正常生理功能的基础,角膜移植术后患者的视力恢复与角膜内皮细胞的活性有很大关系,保持供体角膜正常的自净状态和角膜内皮细胞的功能状态具有重要的临床意义.国内外目前有多种经典的角膜保存方法,明显延长了角膜保存的时间,提高了供体角膜的质量.本文将就供体角膜的保存方法的现状及其进展进行综述.     

高钾保存液对角膜内皮细胞存活的影响

应用流式细胞仪及细胞活性染料Ｄｉｏ，ＰＩ对高钾角膜保存液保后角膜内皮细胞的存活与Ｋ液进行了对照研究，结果表明：（１）高钾保存液组保存５、７、９、１１天的角膜内皮细胞存活率均高于Ｋ液组（Ｐ〈０．０５），（２）含钾离子浓度在１２．１５ｍＭ的高钾保存液角膜内皮细胞存活高于其它高钾组（Ｐ〈０．０５），提示低温状态下高钾角保存液对延长角膜内皮细胞的存活有一定的作用。     

供体角膜离体和保存时间与植片内皮细胞密度的关系

用角膜内皮显著镜摄像对３１眼部分穿透性角膜移植术后６个月的植片内皮细胞密度进行了计数观察，以探讨供体角膜离体和保存时间与植片内皮细胞密度的关系。结果表明，离体１５－１８小时的供体角膜，术后植片内皮细胞密度与≤１２小时者无显著性差异。供体角膜平均保存５９－７１小时与保存≤４８小时者，术后植片内皮细胞密度无显著性差异。说明除夏日暴晒之外，供体角膜在人体死亡后１８小时内离体和角膜湿房保存时间不超过７１小     

应用封闭式Dexsol基质保存角膜的研究

应用自制的Dexsol基质保存角膜，对40只动物(兔、猴各20只)角膜及5只人角膜进行了实验研究。保存时间为4℃者2周，34℃者5周。对保存在不同时间及不同温度的角膜应用锥蓝及茜素红双重染色，角膜内皮细胞活性良好。透射及扫描电镜观察保存2周(4℃)及4周(34℃)的角膜内皮细胞超微结构均无病理性改变。应用Dexsol基质保存的兔角膜进行同种穿透角膜移植，术后2个月，植片透明。20例接受Dexsol基质保存的供体角膜移植的患者，术后3个月移植片透明。植片中央部角膜内皮细胞密度平均为1915个／mm^2。     

影响中期保存的角膜供体内皮细胞活力的相关因素分析

目的 探讨影响中期保存的供体角膜内皮细胞活性的相关因素.方法 对保存液中的角膜内皮细胞进行培养和评分,并与供体年龄、供体保存与死亡时间间隔、供体采集与死亡间隔、是否曾在常温下长时间暴露等因素进行相关分析.结果 细胞培养评分与供体年龄呈负相关,与供体保存时间呈负相关,与是否在常温下过夜呈负相关.结论 供体的年龄、植片的保存时间及是否在常温下长时间暴露均是影响供体角膜内皮细胞活力和功能的关键因素.     

角膜中期保存法

应用角膜中期保存法（Ｋ液，ＣＳＭ，Ｄｅｘｓｏｌ及Ｏｐｔｉｓｏｌ）对８５只动物角膜及５只人角膜进行保存试验，保存时间为３、８、１０、１４及２０天。应用０．２５％锥蓝及０．２％茜素红双染色，保存１０天以内的动物及人角膜内皮完整性良好，１４天的供体角膜部分出现水肿，内皮细胞丢失率为５－１０％，保存２０天的供体角膜在部分出现水肿，内皮细胞丢失率在３０－４０％。对保存８及１０天之动物角膜进行电镜检查，其超微     

湿房和深低温保存角膜穿透性移植术后角膜内皮分析

目的　探讨深低温长期保存和短期湿房保存角膜移植术后植片角膜内皮细胞形态学特征。方法　应用深低温长期保存 30～ 5 0个月 (平均 2 5 .0± 11.9个月 )青壮年供体眼角膜完成穿透性角膜移植 2 4例 (2 4只眼 ) ,同时与来自于青壮年供体经 4℃湿房保存的新鲜供眼角膜穿透性移植术后的角膜内皮细胞状况相比较。全部患者术后角膜植片保持透明 ,未曾出现移植免疫排斥反应 ,手术操作由同一医生完成。术后 2～ 2 0 (平均 6 .7± 3.1)个月应用接触式角膜内皮显微镜及与其同步显示的角膜内皮细胞分析仪对角膜植片中央内皮细胞进行观察和分析。结果　应用深低温保存和湿房保存角膜行穿透性角膜移植术后角膜内皮细胞平均面积、细胞平均密度、面积变异系数、细胞最大面积、细胞最小面积以及六角形细胞出现率间均无显著性差异 (t=0 .116～ 1.195 ,P >0 .0 5 )。结论　应用深低温保存角膜和湿房保存角膜行穿透性角膜移植术后角膜内皮细胞具有相同的临床价值     

脱水保存角膜基质为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的探讨以脱水保存角膜基质/后弹力层为载体培养角膜内皮细胞,构建组织工程化角膜内皮细胞移植膜的可行性及其机理。设计实验性研究。研究对象体外培养的兔角膜内皮细胞和脱水保存角膜基质/后弹力层。方法兔角膜经中性蛋白酶37°C孵育5min,去除内皮细胞保留后弹力层和角膜基质,无水氯化钙脱水后低温保存,使用前磷酸盐缓冲液复水。纯化的角膜内皮细胞接种于基质载体的后弹力层上进行体外培养,直至生长融合为细胞单层,倒置显微镜下观察细胞形态学变化。在不同时间点(1、2、4、6d)收集植片进行HE染色和电镜检测,分析组织结构的变化。主要指标角膜内皮细胞在脱水保存角膜基质/后弹力层载体上形成单层时间和生长特性,组织工程化角膜内皮细胞移植膜的三维结构和超微结构。结果角膜内皮细胞在载体上快速贴壁生长并增殖,体外培养6～7d即融合成单层,复合角膜内皮组织由基质/后弹力层和单层扁平内皮细胞组成,与生理状态下的角膜内皮组织相近。电镜下组织培养的兔角膜内皮细胞间连接紧密,细胞为多边形,胞核清晰,具有正常兔角膜内皮细胞的超微结构。结论角膜内皮细胞能够在干燥脱水保存基质/后弹力层载体上良好生长,并形成形态结构与正常角膜内皮组织相似的细胞单层,为角膜内皮细胞移植提供了新的载体选择。(眼科,2006,15:164-168)     

真空冷冻干燥保存兔角膜内皮细胞酶的实验研究

目的　通过光/电镜酶组织细胞化学方法测定兔角膜内皮细胞酶活性,探讨真空冷冻干燥保存法(冻干法)对于兔角膜内皮细胞活性的影响。方法　按随机及配对原则将兔眼分为新鲜对照组、冷冻对照组、冻干实验组。对冷冻组进行角膜深低温冷冻保存。对冻干组进行真空冷冻干燥保存。将冷冻及冻干保存的兔角膜片分别复水及复温后,与新鲜的角膜片同时进行三磷酸腺苷酶(AT Pase)、琥珀酸脱氢酶(SDH)的光镜及电镜酶组织细胞化学染色,观察三组酶的活性是否有差异。结果　在新鲜组、冷冻组、冻干组中,ATPase及DSH的酶组织化学染色在光镜观察下均呈阳性反应。三组样本内皮细胞ATPase和SDH酶的平均积分光密度值(IOD)差异具有统计学意义(P <0 .0 1)冻干组活性较低。电镜酶组织细胞化学染色见三组样本角膜内皮细胞膜上均有电子致密颗粒沉着。结论　真空冷冻干燥保存法可使离体角膜内皮细胞保持一定的活性。与新鲜及冷冻保存的兔角膜相比,活性较低。但可以推测冻干法有望成为一种新的角膜长期保存方法     

角膜中期保存液成分的研究进展

自ＭＫ液问世以来，角膜中期保存法一直为美国眼库最常用的角膜活性保存方法。随着保存液成分的改进，对角膜内皮细胞活性的保存效果逐渐提高。对有关角膜保存液的组成成分的研究进行综述，重点介绍基础液、高分子物质、抗生素、抗氧化剂等在保存液中的意义和研究进展。     

从开矿和超微结构对干燥保存角膜内皮细胞活性的评价

为从形态和超微结构上观察干燥保存角膜内皮细胞是具有活性，应用０．２％茜素红和０．２５％台寺对干燥保存不同时间的兔、猴和人角膜内皮细胞分别进行活性染色，并与正常新鲜才作对照。同时，在电镜下对干燥保存角膜及其新鲜标本进行超微结构观察。结果，新鲜角膜六角形细胞边界清楚，核呈淡蓝色；干燥保存角膜，六角形细胞边界不清，但核的染色及分布密度一新鲜者几无区别。电镜下，干燥保存角肛六角形镶嵌状细胞边界看不清，但     

眼库中角膜内皮细胞活性的检测方法

角膜内皮细胞对于维持角膜的透明性起着关键作用。眼库工作中角膜保存的焦点是如何保持角膜内皮细胞的活性。诚然，在穿透性角膜移植术后２周内植片的透明性是评价内皮细胞功能的重要标准，但眼库的更重要任务是在供体角膜保存后能确切地评价内皮细胞活性，以确保眼库提供...