苦参碱对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的作用及机制

目的 探讨苦参碱(matrine,Ma)对人神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB) SH-SY5Y细胞的作用及机制。方法 取对数生长期的细胞,分为对照组(含细胞无Ma)及4个浓度组（Ma的作用浓度）分别为0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml和3.0mg/ml,每组5个复孔。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖抑制率;流式细胞仪(FCM)检测凋亡率;RT-PCR方法检测TrkA mRNA的表达。最后采用SPSS 16.(0统计软件进行单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。结果 MTT比色法检测对照组及各浓度组增殖抑制率分别为(7.25±1.55)％、(12.56±1.94)％、(17.22±0.90)％、(22.39±0.78)％和(25.35±1.38)％;流式细胞仪检测对照组及各浓度组凋亡率分别为(5.30±0.60)％、(10.04±1.18)％、(14.34±1.79)％、(21.36±0.96)％和(24.80±1.53)％;RT-PCR方法检测TrkA mRNA的表达,对照组及各浓度组的灰度值分别为：0.502±0.043、0.584±0.032、0.644±0.052、0.836±0.056和0.948±0.030。以上检测各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论 苦参碱在体外环境下作用神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,可以有效抑制该细胞的增殖、诱导调亡并促进TrkA mRNA的表达,这为临床上神经母细胞瘤的治疗开拓了新的思路。     

苦参碱联合顺铂对SH-SY5Y细胞药物敏感性及TrkB表达的影响

目的探讨不同浓度苦参碱对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞存活及凋亡的影响,及苦参碱降低顺铂化疗耐药性的作用及可能机制。方法分别以全反式维甲酸(ATRA)、脑源性神经生长因子(BDNF)、顺铂、苦参碱处理SH-SY5Y细胞,实验分对照组、ATRA诱导的顺铂干预组、顺铂干预组、苦参碱干预组、苦参碱联合顺铂干预组。应用四甲基偶氮蓝比色法检测苦参碱与顺铂对SH-SY5Y细胞存活率的影响,流式细胞仪检测苦参碱与顺铂对SH-SY5Y细胞凋亡率的影响,Western-blot方法检测SH-SY5Y细胞的p-TrkB表达。结果除ATRA诱导的顺铂干预组外,其余各组SH-SY5Y细胞的存活率及凋亡率与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);顺铂干预组与ATRA诱导的顺铂干预组比较,SH-SY5Y细胞的存活率及凋亡率差异有统计学意义(P<0.05);相同浓度的苦参碱干预组与苦参碱联合顺铂干预组比较,SH-SY5Y细胞的存活率及凋亡率差异有统计学意义(P<0.05);苦参碱联合顺铂组与顺铂干预组比较,SH-SY5Y细胞的存活率及凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。苦参碱0.5 mg/ml组与顺铂干预组比较,SH-SY5Y细胞的存活率及凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。各组SH-SY5Y细胞间,p-TrkB的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论苦参碱可以抑制SH-SY5Y细胞的增殖并诱导凋亡,从而提高顺铂化疗的敏感性,该作用与TrkB/BDNF信号通路(间)无相关性。     

细胞色素C1对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y增殖作用的研究

目的分析细胞色素C1(CYC1)在神经母细胞瘤(NB)增殖中的作用,探讨神经母细胞瘤增殖的分子机制。方法首先采用在SH-SY5Y细胞系中慢病毒介导敲减CYC1基因方法,建立神经母细胞瘤CYC1敲减模型,并利用实时定量RT-PCR方法验证敲减效率;随后利用荧光显微镜观察及细胞分析系统连续检测慢病毒感染SH-SY5Y细胞后连续5 d细胞增殖数。结果慢病毒介导的SH-SY5Y细胞中CYC1基因敲减效率达77.0%±4%,具极显著差异(P<0.01);通过细胞分析系统连续检测SH-SY5Y细胞慢病毒感染敲减CYC1后0~5 d细胞数发现细胞增殖速度明显降低,对照组/敲减CYC1组细胞数1~5 d比值分别为(1.00±0.11)、(1.61±0.16)、(1.58±0.17)、(1.97±0.13)、(1.44±0.13),具极显著差异(P<0.01)。结论 CYC1基因沉默可抑制神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y增殖,CYC1在调节神经母细胞瘤生长增殖方面发挥重要作用。     

雷帕霉素对人神经母细胞瘤细胞株生长抑制及诱导凋亡的研究

目的 研究雷帕霉素对人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y生长抑制及诱导凋亡的作用.方法 雷帕霉素处理SH-SY5Y细胞,并设立对照组,以CCK-8检测细胞生长活性,流式细胞法(FCM)检测细胞周期,DNA梯度条带(DNA Ladder)和罗丹明123-碘化丙啶(Rhodamine 123/PI)染色法分析细胞凋亡.结果 雷帕霉素处理后,神经母细胞瘤细胞呈浓度依赖性生长抑制.20μM雷帕霉素处理12 h后,细胞周期出现G2/M期、S期阻滞,G2/M期(24.22±2.89)%、S期(22.05±0.96)%的细胞百分比明显高于对照组.罗丹明123-碘化丙啶检测细胞凋亡率(54.35±5.39)%也明显高于对照组,并有明显的凋亡条带出现.结论 雷帕霉素具有抑制神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y生长、诱导其凋亡的作用.     

γ干扰素与阿霉素联用对成神经细胞瘤细胞生长及凋亡的影响

目的探讨γ干扰素(IFN-γ)对阿霉素抗人成神经细胞瘤细胞作用的影响,并探讨其影响机制。方法应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)分析和流式细胞仪,研究IFN-γ与化疗药阿霉素联合应用前后人成神经细胞瘤细胞SH-SY5Y的存活率及凋亡率;免疫组化方法检测IFN-γ作用前后半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)蛋白的表达。结果阿霉素(0.03,0.10,0.30μg/ml)单独作用24h后,SY5Y细胞的存活率分别为(95.62±13.03)%,(82.62±7.94)%和(64.84±9.19)%,各组间差异显著。IFN-γ(10,100,1000U/ml)单独作用48h后,SY5Y细胞的存活率分别为(98.37±11.25)%,(97.15±5.36)%和(98.84±7.41)%,各组间差异无显著性。IFN-γ(1000U/ml)与不同浓度的阿霉素(0.03,0.10,0.30μg/ml)联合作用后,SY5Y细胞的存活率同单独应用阿霉素组比较明显下降,差异有显著性;阿霉素(0.30μg/ml)单独作用24h,SH-SY5Y的凋亡率为(22.00±6.55)%,IFN-γ(1000U/ml)单独作用48h,凋亡率为(8.22.±4.00)%。二者联合作用后,凋亡率较单用阿霉素组比较明显升高,差异有显著性;免疫组化方法发现SH-SY5Y细胞株不表达caspase-8,IFN-γ作用48h后caspase-8表达阳性。结论阿霉素对成神经细胞瘤细胞SH-SY5Y具有抑制增殖和诱导凋亡的作用,IFN-γ可以使其作用明显增强。其发生机制可能是通过IFN-γ上调caspase-8蛋白的表达而实现的。     

小剂量维甲酸诱导对神经母细胞瘤耐药的影响

目的探讨小剂量维甲酸诱导对神经母细胞瘤(NB)化疗耐药的影响。方法选择人NB细胞株SH SY5Y,用RT PCR方法检测小剂量全反式维甲酸(ATRA)作用下TrkB mRNA水平;通过四甲基偶氮蓝比色(MTT)法及流式细胞仪(FCM)检测ATRA诱导前后顺铂对人NB细胞株SH SY5Y的生长及凋亡的影响。结果SH SY5Y中未检测到TrkB mRNA表达,用1、10、100nM/LATRA诱导5d后可检测到TrkB mRNA表达,且随ATRA浓度增加TrkB mRNA水平逐渐升高。100nM/LATRA诱导7d,TrkB mRNA的相对比值与诱导5d比差异无显著性意义(P>0.05);MTT分析显示:BDNF+顺铂组(无TrkB表达)、ATRA+顺铂组(无BDNF刺激)细胞存活率同单用顺铂组比较无显著性差异(P>0.05);10nM/LATRA+BDNF+顺铂组NB细胞存活率明显高于单用顺铂组(P<0.01);FCM分析显示:ATRA+BDNF+顺铂组NB细胞凋亡率明显低于单用顺铂组(P<0.01)。结论存在BDNF的条件下,小剂量ATRA能阻断顺铂对SH SY5Y的细胞毒性作用,从而使SY5Y细胞对化疗耐药。     

小白菊内酯诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞凋亡的研究

目的 探讨小白菊内酯对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH细胞凋亡的影响及机制.方法 MTT法检测不同浓度小白菊内酯对SK-N-SH细胞增殖抑制的影响,同时计算IC50,根据IC50选取实验组小白菊内酯浓度(10、15μmol/L);流式细胞仪分析对照组及实验组肿瘤细胞凋亡率;EMSA检测NF-κB的活性;Western Blot法检测细胞凋亡相关蛋白表达.结果 小白菊内酯抑制神经母细胞瘤SK-N-SH细胞生长,并呈浓度依赖关系.用10、15μmol/L小白菊内酯处理细胞48 h后凋亡率分别为(35.63±0.98)％,(53.32±1.08)％,与对照组(6.42±1.26)％比较,差异显著(P＜0.01).EMSA结果表明,小白菊内酯处理组细胞NF-κB活性降低.Western Blot结果显示,小白菊内酯使细胞中Bax、Caspase-3蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达降低.结论 小白菊内酯促进神经母细胞瘤SK-N-SH细胞凋亡,可能与抑制NF-κB活性,下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax、Caspase-3蛋白表达有关.     

Caspase-8在TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡中的作用

目的：应用干扰素(IFNγ)诱导神经母细胞瘤（neuroblastoma, NB）细胞caspase 8的表达并观察其是否可以恢复NB细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）的敏感性。方法：应用RT PCR方法检测IFNγ作用前后NB细胞caspase-8 mRNA的表达;应用Alamar Blue法及流式细胞术检测IFNγ、TRAIL、IFNγ+TRAIL、IFNγ+caspase-8抑制剂zIETD-FMK+TRAIL对NB细胞生长及凋亡的影响;应用比色法测定NB细胞caspase-8相对活性。结果：对TRAIL敏感的CHP212细胞表达caspase-8,且经IFNγ处理后caspase-8 表达水平逐步增加;对TRAIL不敏感的SY5Y细胞不表达caspase-8,IFNγ作用后其caspase-8 mRNA表达明显增加。IFNγ与TRAIL联用对SY5Y细胞有明显诱导凋亡作用。CHP212细胞caspase-8相对活性随TRAIL作用时间的延长逐步升高;IFNγ与TRAIL联合作用的SY5Y细胞caspase-8相对活性明显高于未加药物处理的对照组、IFNγ组、TRAIL组及抑制剂组。结论：表达caspase-8的NB细胞对TRAIL的诱导凋亡作用敏感,TRAIL诱导NB细胞凋亡过程中伴随caspase-8活性的增加。［中国当代儿科杂志,2010,12(11)：902-907］     

Am80对神经母细胞瘤细胞化疗敏感性的影响及机制研究

目的探讨他米巴罗汀(Am80)对人神经母细胞瘤(NB) SH-SY5Y细胞化疗敏感性的影响,并进一步研究相关分子机制。方法 SH-SY5Y细胞随机分为实验组和空白对照组。浓度分别为0、10、20、40、80、160μmol/L的Am80作用于SH-SY5Y细胞48 h后,以CCK-8法检测细胞增殖的变化;浓度分别为0、0.1、0. 2、0.4、0. 8、1.6μmol/L的阿霉素单独及分别联合浓度为10、20μmol/L的Am80处理细胞48 h,应用CCK-8法检测各组细胞增殖能力;浓度为0、10、20μmol/L的Am80处理细胞48 h后,均更换含浓度1μmol/L阿霉素的培养基继续培养1 h,流式细胞术检测细胞内阿霉素相关平均荧光强度(MFI);浓度为0、10、20μmol/L的Am80处理细胞48 h后,Western blot检测细胞MRP1及MYCN蛋白的表达。结果不同浓度Am80能有效抑制SH-SY5Y细胞的增殖,并呈剂量依赖性(P0.05);Am80能降低阿霉素的IC_(50)值并提高阿霉素的细胞内蓄积量(P0.05);Western blot结果显示,Am80以浓度依赖方式下调MRP1及MYCN蛋白的表达(P0.05)。结论 Am80能有效抑制SHSY5Y细胞的增殖,并增加细胞化疗敏感性,其作用机制可能通过抑制MYCN蛋白表达,下调MRP1蛋白的表达,进而增强阿霉素胞内浓度,从而提高SH-SY5Y细胞对阿霉素的化疗敏感性。     

苦参碱对人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞趋化因子受体4表达的影响

目的探讨苦参碱对体外培养人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞抑制增殖及诱导凋亡的作用。方法体外培养人肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞分对照组,0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml苦参碱干预组,应用四甲基偶氮蓝比色法、流式细胞术检测苦参碱对SK-NEP-1细胞抑制率、凋亡率的影响,逆转录聚合酶链反应检测SK-NEP-1细胞的趋化因子受体4(CXCR4)mRNA表达。结果不同浓度苦参碱干预组及对照组SK-NEP-1细胞的抑制率、凋亡率以及CXCR4 mRNA表达差异均有统计学意义(P0.01);随苦参碱浓度增加,SK-NEP-1细胞的抑制率和凋亡率呈上升趋势,而CXCR4 mRNA表达呈下降趋势,差异均有统计学意义(P0.01)。结论苦参碱可以抑制SK-NEP-1细胞增殖并诱导凋亡,该作用可能与下调CXCR4的表达有关。     

5-氮杂胞苷增强阿霉素对神经母细胞瘤细胞的抗瘤活性

目的：许多神经母细胞瘤细胞系及肿瘤组织标本中caspase-8表达缺失, caspase-8基因沉寂的主要原因是其启动子区域高度甲基化。该文探讨去甲基化药物5-氮杂胞苷对caspase-8表达及对化疗药阿霉素抗人神经母细胞瘤细胞作用的影响及其影响机制。方法：应用RT-PCR方法检测5-氮杂胞苷作用前后SH-SY5Y细胞中caspase-8 mRNＡ水平变化。MTT分析研究5-氮杂胞苷与化疗药阿霉素联合应用前后人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的存活率,以及加入caspase-8活性抑制剂后存活率的变化。结果：RT-PCR方法发现SH-SY5Y细胞株不表达caspase-8 mRNA, 5-氮杂胞苷作用3 d后可检测到 caspase-8 mRNA表达,5 d后表达较第3天增加; 5-氮杂胞苷与不同浓度阿霉素(0.05, 0.1, 0.25, 0.5 μg/mL)联合应用后SH-SY5Y细胞存活率为(77.61±7.30)%,（57.35±6.64）%,（46.25±4.46）%,（35.59±5.12）%,同一浓度单独应用阿霉素组细胞存活率为（94.89±4.15）%,（80.60±8.50）%,（64.48±4.92）%,（52.32±6.71）%,5-氮杂胞苷与阿霉素联用组细胞存活率明显低于单用阿霉素组,差异均有显著性。Caspase-8抑制剂组与同一浓度的5-氮杂胞苷+阿霉素组比较,细胞存活率明显增加,依次为（92.95±3.48）%,（78.39±4.28）%,（62.31±6.50）%,（49.92±5.77）%,差异均有显著性。结论：阿霉素对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y具有增殖抑制作用,5-氮杂胞苷可以增强阿霉素的抗瘤活性。其发生机制可能是通过上调caspase-8 mRNA的表达而实现的。［中国当代儿科杂志,2007,9（6）：577-579］     

RNAi抑制Wnt1信号通路对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖抑制的实验研究

目的 检测人神经母细胞瘤细胞株SH-SYSY中Wnt1的表达情况,并通过抑制Wnt1基因的表达来干预Wnt1信号通路,观察其对神经母细胞瘤增殖的影响,阐明Wnt1信号通路与神经母细胞瘤之间的相关性.方法 检测人神绛母细胞瘤株SH-SY5Y中Wnt1在基因和蛋白水平的表达及细胞内定位情况;将SH-SY5Y细胞分为四组,分别是阴性对照组、空白载体组、非特异性siRNA组和Wnt1-siRNA组.用针对Wnt1的特异性siRNA阻断该细胞中Wnt1信号通路的传递,分别检测上述四组细胞中Wnt信号通路中Wnt1及β-catenin浓度的变化;显微镜下观察细胞形态、数量的改变;用MTT方法检测肿瘤细胞增殖情况.结果 SH-SY5Y中的Wnt1在mRNA转录水平以及蛋白水平均有表达,且位于细胞浆内.采用Wnt1的特异性siRNA技术干预细胞后,Wnt1特异性siR-NA干预组中Wnt1蛋白的表达较阴性对照组、空白载体组及非特异性siRNA组明显下降(P<0.01),其下游通路中的关键蛋白β-catenin的表达同样明显下降(P<0.01);光学显微镜下发现特异性干预组中细胞明显较其他三组少,死亡漂浮的细胞较多,细胞突触减少;MTT结果提示,Wnt1基因表达被抑制后,SH-SY5Y细胞的增殖率明显下降(P<0.01).结论 Wnt1在人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y中呈阳性表达;阻断Wnt1信号通路可以抑制人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y的增殖.Wnt1信号通路可能是影响神经母细胞瘤增殖的重要通路.     

肿瘤细胞来源的外泌体对神经母细胞瘤细胞增殖和转移的影响

目的:探讨肿瘤细胞来源的外泌体对神经母细胞瘤细胞增殖和转移的影响。方法:使用外泌体提取纯化试剂盒对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞培养上清液中的外泌体进行提取和纯化,通过透射电子显微镜、蛋白免疫印记法对外泌体的形态、大小和标志蛋白进行鉴定。根据细胞培养基中是否加入外泌体,分为外泌体组和对照组,利用CCK-8法和Tran...     

Effects of retinoic acid on proliferation,apoptosis, cytotoxicity,migration, and invasion of neuroblastoma cells

BACKGROUND: Because of the known property of less aggressiveness of differentiated cells compared to immatured cells all attempts are made to elucidate whether differentiation inducers possibly could be applied for neuroblastoma therapy. We are interested in examining the influence of retinoic acid (RA) on proliferation, apoptosis, cytotoxicity, migration, and invasion in dependence of the differentiation of neuroblastoma cells classified into N-type (SK-N-FI, SH-SY5Y), I-type (SK-PN-DW), and S-type (SK-N-LO, SK-N-MC) cells. PROCEDURE: Neuroblastoma cells were exposed to 10(-5) M RA and 200 ng/ml camptothecin (CAM) (control substance for apoptosis). Proliferation, apoptosis, and cytotoxicity were quantified by photometric assays. The influence on migration and invasion of neuroblastoma cells was examined by a scratch-test and by the measurement of the invasion through matrigel coated chamber inserts. RESULTS: In general, RA treatment induced proliferation inhibition predominantly in the cell lines SK-PN-DW (16%, P < 0.05) and SK-N-MC (8%, (P < 0.001), respectively. In the N-type cell lines SK-N-FI (P > 0.05) and SH-SY5Y (P < 0.001) no proliferation inhibition was determined conforming with no detection of apoptosis. CAM confirmed its capability to induce apoptosis in the cell lines SH-SY5Y (43.6%, P < 0.05), SK-PN-DW (54.8%, P > 0.05), and SK-N-MC (28.9%, P < 0.0 01) except for SK-N-FI with only 9.3% (P > 0.05), but after 24 hr of treatment. Minor signs of restricted migration were observed, while RA treatment reduced significantly the invasion rate through Matrigel of SK-N-FI to 13.3% (P < 0.01), SH-SY5Y to 19.2% (P < 0.05), SK-N-MC to 27.8% (P < 0.05), and SK-N-LO to 17.7% (P < 0.01). CONCLUSIONS: It is demonstrated that RA treatment can interfere with cell growth and in invasion by inducing neuronal differentiation in N-type and apoptosis in S-type neuroblastoma cell lines.     

miR-144通过靶定ITGβ1调控神经母细胞瘤的侵袭转移

目的 本研究旨在探讨miR-144对神经母细胞瘤的侵袭和转移的影响,并探索miR-144是否通过靶定ITGβ1调节神经母细胞瘤的侵袭和转移.方法 利用生物信息学技术预测miR-144的靶基因ITGβ1,应用荧光报告基因检测以及荧光定量PCR、Western Blot实验对靶基因进行验证.在神经母细胞瘤SH-SY5Y和SK-N-BE分别瞬时转染化学合成的成熟双链miR-144和靶基因敲降质粒及对照质粒,建立过表达miR-144细胞模型和靶基因敲降细胞模型.通过 Transwell侵袭实验和划痕实验检测细胞的体外侵袭和转移能力.结果 Transwell实验结果表明,在神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和SK-N-BE中过表达miR-144后,细胞的侵袭数目分别为41±2和55±2,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01).抑制ITGβ1基因的表达后,体外划痕实验结果表明,过表达miR-144后,与对照组相比,SH-SY5Y和SK-N-BE细胞的转移能力分别下降了65.45%和75.41%(P<0.01).荧光报告基因检测结果显示过表达miR-144后,含有结合位点的荧光报告质粒的相对荧光量降低了37.11%(P<0.01),而将结合位点进行基因突变后miR-144对靶基因的抑制作用消失.过表达miR-144后,与对照组相比,SH-SY5Y和SK-N-BE细胞内的ITGβ1 mRNA水平分别降低了40%和43%,Western Blot检测结果显示,ITGβ1蛋白水平分别降低了39%和40%.结论 miR-144通过靶定ITGβ1基因抑制神经母细胞瘤的侵袭和转移过程.     

Enhanced effect of IFNgamma on the induced apoptosis of neuroblastoma cells by cytotoxic drugs

The objective of this study was to explore the antitumor effects of cytotoxic drugs combined with IFNgamma on neuroblastoma cell line SH-SY5Y cells. The expression of caspase 8 mRNA and protein was detected with RT-PCR and Western blot analysis. The effects of cytotoxic drugs and IFNgamma combined with cytotoxic drugs on the growth and apoptosis of SH-SY5Y cells were detected with the methods of MTT and flow cytometry. Caspase 8 activity was measured by colorimetric assay. Caspase 8 was undetectable in SH-SY5Y cells with an increased expression of caspase 8 after the treatment of IFNgamma. SH-SY5Y cells were sensitive to Adriamycin relatively but resistant to TNFalpha and TRAIL, while IFNgamma-pretreated SH-SY5Y cells were more sensitive to the cytotoxic drugs with an increase of caspase 8 activity. The authors conclude that IFNgamma can sensitize SH-SY5Y cells to Adriamycin-, TNFalpha-, and TRAIL-induced apoptosis and this may be realized by the upregulation of caspase 8.