鸡肌腱的玻璃化冷冻保存

目的：筛选出适合于肌腱玻璃化冷冻保存的溶液及保存程序，并通过细胞培养来进一步检测玻璃化肌腱的活性。方法：实验于2003-11／2005—02在解放军总医院骨科研究所完成。实验包括（1）筛选与检测：取来亨鸡30只，切取屈趾深肌腱，按随机数字法分为2组，新鲜鸡肌腱组，玻璃化组。运用正交设计和肌腱活性快速检测技术，筛选出适合鸡屈趾肌腱玻璃化保存程序，再从6种玻璃化溶液中（二甲基亚砜＋乙酰胺＋丙二醇＋聚乙二醇；乙二醇＋二甲基亚砜＋蔗糖；乙二醇＋二甲基亚砜＋丁二醇；丙二醇＋二甲基亚砜＋蔗糖；二甲基亚砜＋乙酰胺＋丙二醇；二甲基亚砜＋丙二醇）筛选出适于肌腱玻璃化保存的配比方案。②细胞培养：将玻璃化法保存鸡屈趾深肌腱进行细胞培养，观察培养后细胞的存活情况，以了解玻璃化法保存肌腱的细胞活性。结果：①通过统计学分析，肌腱玻璃化保存的最佳程序为平衡处理选择4℃3个浓度梯度、平衡时间选择4℃30min、洗脱处理选择4℃3个浓度梯度、洗脱时间选择4℃20min。玻璃化溶液二甲基亚砜＋丙二醇为的最佳配比方案。②应用酶消法测得新鲜肌腱活性为89．26％，玻璃化法优化组合所保存肌腱的活性为78．49％。（3）将玻璃化组肌腱进行细胞培养，细胞第8天自组织块周边长出，第21天后传代，培养3代后出现明显的退化现象，玻璃化组肌腱细胞的生物学特性与新鲜肌腱组相似。④将两组肌腱所培养的细胞分别进行免疫组织化学染色，经鉴定均为肌腱细胞。结论：玻璃化法冷冻保存的肌腱具有良好的细胞活性，经细胞培养获得成功，其生物学特性无明显变异。     

鸡肌腱的玻璃化冷冻保存

目的:筛选出适合于肌腱玻璃化冷冻保存的溶液及保存程序,并通过细胞培养来进一步检测玻璃化肌腱的活性。方法:实验于2003-11/2005-02在解放军总医院骨科研究所完成。实验包括①筛选与检测:取来亨鸡30只,切取屈趾深肌腱,按随机数字法分为2组,新鲜鸡肌腱组,玻璃化组。运用正交设计和肌腱活性快速检测技术,筛选出适合鸡屈趾肌腱玻璃化保存程序,再从6种玻璃化溶液中(二甲基亚砜 乙酰胺 丙二醇 聚乙二醇;乙二醇 二甲基亚砜 蔗糖;乙二醇 二甲基亚砜 丁二醇;丙二醇 二甲基亚砜 蔗糖;二甲基亚砜 乙酰胺 丙二醇;二甲基亚砜 丙二醇)筛选出适于肌腱玻璃化保存的配比方案。②细胞培养:将玻璃化法保存鸡屈趾深肌腱进行细胞培养,观察培养后细胞的存活情况,以了解玻璃化法保存肌腱的细胞活性。结果:①通过统计学分析,肌腱玻璃化保存的最佳程序为平衡处理选择4℃3个浓度梯度、平衡时间选择4℃30min、洗脱处理选择4℃3个浓度梯度、洗脱时间选择4℃20min。玻璃化溶液二甲基亚砜 丙二醇为的最佳配比方案。②应用酶消法测得新鲜肌腱活性为89.26%,玻璃化法优化组合所保存肌腱的活性为78.49%。③将玻璃化组肌腱进行细胞培养,细胞第8天自组织块周边长出,第21天后传代,培养3代后出现明显的退化现象,玻璃化组肌腱细胞的生物学特性与新鲜肌腱组相似。④将两组肌腱所培养的细胞分别进行免疫组织化学染色,经鉴定均为肌腱细胞。结论:玻璃化法冷冻保存的肌腱具有良好的细胞活性,经细胞培养获得成功,其生物学特性无明显变异。     

深低温冷藏并戊二醛化同种异体肌腱移植修复手部肌腱缺损的特点评价

背景采用不同方法处理的异体肌腱移植修复手外伤肌腱缺损,已成为近年手部组织工程研究的重点.目的探讨经深低温冰箱冷藏及戊二醛处理的同种异体肌腱移植修复手部肌腱缺损的特点.设计自身前后对照观察.单位惠州市中心人民医院骨科病房.对象选择1997-01/2001-08在惠州市中心人民医院骨科二病区住院的男性手外伤肌腱缺损患者15例(17条肌腱),年龄20～35岁.其中伸指肌腱缺损8条,屈指肌腱缺损9条;缺损肌腱长3～9 cm.方法应用从健康青壮年意外死亡者志愿贡献或外伤断肢后无再植条件废弃肢体经无菌操作条件取出的手指屈肌腱(本人或家属均知情同意),经-80℃深低温冰箱保存,术前应用3.5 g/L戊二醛溶液浸泡后按显微外科缝合肌腱的方法将异体肌腱移植于手部肌腱缺损处.随访时按国际手外科联合会制定的总活动度法评定疗效,分为优、良、可、差4级.主要观察指标手指总主动活动度和排斥反应.结果15例患者(17条肌腱)均进入结果分析.随访8个月,手指肌腱总活动度优级4条,良级6条,可级4条,差级3条,总有效率82.36%(14/17).全部病例没有使用激素及免疫抑制剂,均没有发生急性免疫排斥反应,移植的肌腱无断裂.结论异体肌腱经-80℃深低温保存及术前应用戊二醛处理,可以降低移植后的抗原反应,增加移植肌腱的强度和韧性,避免可能发生的传染病的感染,是代替自体肌腱移植的良好方法之一,但移植后存在着肌腱粘连的并发症尚需解决.     

玻璃化冷冻保存组织工程肌腱植入大鼠体内的组织学变化

背景：应用玻璃化冷冻方法保存组织工程肌腱具有可行性和应用前景,有待进一步研究。目的：探讨应用玻璃化冷冻保存组织工程肌腱体内植入对大鼠跟腱缺损修复的影响。方法：选用成年SD大鼠64只,于大鼠跟腱中段制备5mm肌腱缺损模型,随机摸球法均分为2组,分别植入玻璃化冷冻保存组织工程肌腱和新鲜非冷冻保存组织工程肌腱。植入后2,4,6,8周,观察植入肌腱材料及周围组织的大体形态和组织学变化。结果与结论：两组肌腱材料体内植入后的大体形态和组织学反应无明显差异。植入后2,4周,植入的肌腱材料发生降解,材料中间及周围有大量炎性细胞浸润和纤维结缔组织增生。植入后6,8周,大量新生胶原纤维组织长入并替代降解的植入材料,形态和排列方式趋近于正常肌腱组织,大鼠跟腱缺损基本修复。结果表明玻璃化冷冻保存组织工程肌腱体内植入可修复大鼠跟腱缺损。     

玻璃化冷冻保存组织工程肌腱植入大鼠体内的组织学变化◆

背景:应用玻璃化冷冻方法保存组织工程肌腱具有可行性和应用前景,有待进一步研究.目的:探讨应用玻璃化冷冻保存组织工程肌腱体内植入对大鼠跟腱缺损修复的影响.方法:选用成年SD大鼠64只,于大鼠跟腱中段制备5 mm肌腱缺损模型,随机摸球法均分为2组,分别植入玻璃化冷冻保存组织工程肌腱和新鲜非冷冻保存组织工程肌腱.植入后2,4,6,8周,观察植入肌腱材料及周围组织的大体形态和组织学变化.结果与结论:两组肌腱材料体内植入后的大体形态和组织学反应无明显差异.植入后2,4周,植入的肌腱材料发生降解,材料中间及周围有大量炎性细胞浸润和纤维结缔组织增生.植入后6,8周,大量新生胶原纤维组织长入并替代降解的植入材料,形态和排列方式趋近于正常肌腱组织,大鼠跟腱缺损基本修复.结果表明玻璃化冷冻保存组织工程肌腱体内植入可修复大鼠跟腱缺损.     

牵伸应力对假性肌腱组织结构影响的实验研究

目的：探讨假性肌腱在牵伸应力作用下组织学结构的变化，以及用于治疗肌腱缺损的可行性。方法：取健康成年日本大耳白兔36只，建立肌腱牵伸延长的动物模型，设立实验组、对照组和空白对照组，术后第7d开始延长，速度为1mm/d，分早晚两次进行，3w后停止延长，此时开始被动活动踝关节，每日两次，以增加局部的应力刺激，术后分别于3、6、9、12w取材，大体观察形成的假性肌腱的长度及光镜观察组织学结构的变化。结果：实验组的假性肌腱在大体标本上明显长于对照组，假性肌腱内胶原的含量较对照组明显增多，胶原纤维多数沿应力方向排列，组织内部的纤维细胞较对照组趋向成熟。结论：假性肌腱在牵伸应力下能够逐渐延长，实验组形成的假性肌腱在组织学结构上明显不同于对照组，应力作用能促进胶原纤维的台成并能使胶原纤维沿其纵轴重新排列。     

兔肌腱细胞的分离、培养及鉴定

背景：肌腱细胞是一种高分化的细胞,其增殖相对缓慢,在体外经多次传代后甚至丧失增殖能力,因此有必要建立肌腱细胞良好的体外分离、培养模式。目的：探讨兔肌腱细胞的分离、培养及鉴定。方法：无菌条件下切取新西兰乳兔趾屈肌腱,显微镜下剥离腱外膜,采用Henderson分步酶消化法分离肌腱细胞,用含体积分数为20%胎牛血清的F-12培养液进行培养、传代。结果与结论：通过不同的酶消化分离可获得较纯肌腱细胞,体外培养细胞表现出良好的细胞增殖能力和传代能力。免疫组织化学染色见分离培养的第2代腱细胞Ⅰ型胶原抗体染色呈阳性,而Ⅲ型胶原抗体染色呈阴性,证明所获细胞为肌腱细胞。提示肌腱细胞能够在体外分离、扩增和传代。     

自体肌腱与人工韧带联合应用重建兔前交叉韧带

背景：自体肌腱与人工肌腱是目前治疗前交叉韧带断裂的主要移植物，两者各有优缺点。 目的：将自体肌腱与人工韧带联合重建兔前交叉韧带，观察其在不同时间段组织学反应及生物力学改变。 设计、时间及地点：同体对照观察，于2007—09／2008—02在郑州大学骨科实验室和郑州大学生物实验室力学中心完成。 材料：SPF成年健康新西兰大白兔28只由郑州大学动物实验中心提供，体质量2．4—31kg，平均2．8kg，雌雄不限。MB66编织线为上海施乐辉医用产品国际贸易有限公司产品。 方法：①取兔的双下肢伸趾肌腱，一个伸趾肌腱完全包裹人工韧带，另一个伸趾肌腱单纯末端编织备用。②取兔双膝内侧髌旁切口暴露关节，切断并去除正常前交叉韧带，定位上下止点，分别钻股骨和胫骨骨道，一个膝关节穿入自体肌腱与人工韧带联合肌腱（联合肌腱组），另一个关节穿入单纯肌腱（单纯肌腱组），两端钻骨桥缝线固定。分别于术后第2，4，6，8周随机抽出的7只兔，麻醉后处死。主要观察指标：①两组兔重建的前交叉韧带大体观察和组织学观察结果。②两组移植物的最大拉断力。 结果：移植后第2，4周，移植物内细胞消失，呈坏死状：联合肌腱之间有炎症细胞浸润，边缘开始有细胞向中心长入。移植后第6周，移植物表面滑膜增生明显；单纯肌腱有少许变形和松弛；联合肌腱部分间隙被滑膜填充，浸润的炎症细胞减少，内部仍有界限。增生的细胞由周围向中心推进明显。移植后第8周，移植物大部分组织被新长入的细胞替代，人工韧带被滑膜完全包裹，浸润的炎症细胞基本消失，部分接触面己融合，但部分面仍有间隙：联合肌腱无变形和松弛，移植物内细胞形态，数量接近正常前交叉韧带，但纤维细胞排列杂乱，纤维有了一定的纵向性。生物力学测试结果联合肌腱最大拉断力大于单纯肌腱（P〈0．05）。 结论：联合肌腱与单纯肌腱都经历坏死、再血管化、韧带化的改建过程，与其生物力学经历由强到弱再逐渐增强的过程相一致。联合肌腱硬度或韧性均可弥补单纯肌腱早期易松弛的缺点，晚期自体肌腱成活可弥补人工肌腱被永久性拉长或断裂的缺点。     

保存人鼻中隔软骨活性的3种体外方法比较

背景:软骨损伤后难以自身修复,以活性软骨进行修复效果较好,但活性软骨的可靠来源尚未根本解决。目的:以3种不同方法体外保存成人鼻中隔软骨块的活性比较。设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2007-06/2008-03在解放军第四军医大学唐都医院耳鼻喉科实验室及西京医院全军耳鼻咽喉-头颈外科中心实验室完成。材料:材料为临床常规手术中切除的成人正常鼻中隔软骨20块,按国务院2006年《医疗机构管理条例》规定,已与患者签订知情同意书。方法:将所取软骨,块剪成大小约15mm×10mm×2mm软骨块,分别置于4,-20,-80℃冷冻及RPMI-1640液于37℃培养保存,于保存24h,7,14,21d和30d时取样品。主要观察指标:以苏木精-伊红、AB/PAS及Masson三色染色和锥虫蓝排斥试验检测软骨活性。结果:用RPMI-1640培养液保存的成人鼻中隔软骨,在整个保存期中均能保持较好活性,软骨细胞活性率保持在80%左右。以-80℃冷冻保存7d及-20℃保存14d时,软骨基本失去活性,当4℃保存在21d时,软骨可保持较好活性,保存30d时,软骨活性明显降低。结论:与低温保存方法相比,用组织培养法保存成人软骨块能较好地保持其活性,有望为临床治疗提供一种取材方便、新型有效的软骨修复材料。     

玻璃化法保存同种异体肌腱移植材料的可行性

背景:处理同种异体肌腱最主要目的是减少免疫原性和保持肌腱结构与活性。现在临床上常用的低温冷冻法操作复杂、费时,所保存的肌腱活性较低。目的:以玻璃化法保存鸡屈趾深肌腱,探索其作为肌腱移植材料的可行性。方法:将成年来亨鸡跖趾关节远侧屈趾深肌腱切断,以数字表法随机分为2组,分别移植同种异体玻璃化肌腱与自体肌腱。术后2,4,8,12,16周观察移植肌腱在形态结构、羟脯氨酸含量和力学性能等方面的变化。结果与结论:玻璃化肌腱移植组早期存在轻度的免疫排斥反应,但不影响肌腱愈合与重建。两组肌腱周围产生中度粘连,移植后肌腱中段的羟脯氨酸含量先减少,8周后逐渐增高,而吻合口部羟脯氨酸含量随时间逐渐增高,两组间羟脯氨酸含量差异无显著性意义。在8周内玻璃化肌腱移植组吻合口部的破裂强度与弹性模量低于自体肌腱移植组(P<0.05),12周后差别无显著性意义。两组肌腱中段部生物力学性能差异无显著性意义。说明玻璃化保存的同种异体肌腱生物活性好、免疫原性低,是良好的肌腱移植材料。     

震荡热管技术在生物材料低温玻璃化保存中的应用

玻璃化保存是一种新的低温保存方法,可通过提高保护剂浓度或增大降温速率两个途径实现溶液的玻璃化,但高浓度的低温保护剂会对细胞产生毒性损伤和渗透压损伤,因此一般需要快速的降温速率来实现玻璃化.震荡热管具有强化传热的性能,文章综述了国内外震荡热管的理论研究现状与实际应用,讨论了其提高降温速率的技术路线,即震荡热管具有优良的传热性能,可提供细胞在冷冻过程中所需的极快速的降温速率;同时对应用于玻璃化保存的可行性进行分析,认为震荡热管可加快细胞在降温过程中通过危险温度区域的时间,从而减少其冷冻损伤.     

玻璃化法保存同种异体肌腱移植材料的可行性

背景：处理同种异体肌腱最主要目的是减少免疫原性和保持肌腱结构与活性。现在临床上常用的低温冷冻法操作复杂、费时,所保存的肌腱活性较低。目的：以玻璃化法保存鸡屈趾深肌腱,探索其作为肌腱移植材料的可行性。方法：将成年来亨鸡跖趾关节远侧屈趾深肌腱切断,以数字表法随机分为2组,分别移植同种异体玻璃化肌腱与自体肌腱。术后2,4,8,12,16周观察移植肌腱在形态结构、羟脯氨酸含量和力学性能等方面的变化。结果与结论：玻璃化肌腱移植组早期存在轻度的免疫排斥反应,但不影响肌腱愈合与重建。两组肌腱周围产生中度粘连,移植后肌腱中段的羟脯氨酸含量先减少,8周后逐渐增高,而吻合口部羟脯氨酸含量随时间逐渐增高,两组间羟脯氨酸含量差异无显著性意义。在8周内玻璃化肌腱移植组吻合口部的破裂强度与弹性模量低于自体肌腱移植组（P〈0.05）,12周后差别无显著性意义。两组肌腱中段部生物力学性能差异无显著性意义。说明玻璃化保存的同种异体肌腱生物活性好、免疫原性低,是良好的肌腱移植材料。     

Flexor pollicis longus tendon rupture by sandwiched underlying volar locking plate and distal radius

Flexor pollicis longus (FPL) tendon rupture is a major complication of volar locking plate fixation for distal radius fractures. The tendon rupture is usually caused by friction between the distal edge of the plate and the FPL tendon, and has been well detected recently with ultrasonography. Rarely, the volar locking plate itself entraps the FPL tendon, leading to its rupture. A 63-year-old man was consistently unable to flex his right thumb after previous surgery for a distal radius fracture at another hospital. Ultrasonography demonstrated loss of tendon gliding and unusual patterns of the FPL tendon. The tendon was sandwiched between the plate and the distal radius, and was penetrated by the distal locking screw, which was comparable to intraoperative findings of complete entrapment and rupture of the FPL tendon from the underlying plate. The tendon defects were repaired using a palmaris longus tendon graft after removing the screws and plate. Finally, he could flex his thumb actively with satisfaction. Unusual patterns of FPL tendon rupture buried under inadequate plate positioning must be recognized, as in this case. Ultrasonographic assessment is routinely recommended to visibly determine any FPL tendon damage after volar locking plate fixation for distal radius fractures.     

组织工程皮肤构建中胎儿皮肤标本玻璃化冻存的实验

目的：建立一种用于细胞培养的皮肤标本新的保存方法。 方法：实验于2004-05-01／2-31在第四军医大学西京医院烧伤外科实验室进行。①分别取流产胎儿头部及躯干部全层皮片（家属知情同意），按照标本保存方法不同分为常规组（4℃保存2h）、冻存1组（-196℃液氮保存1周组）、冻存2组（-196℃液氮保存1个月组）和冻存3组（-196℃液氮保存6个月组）。采用抗冻液4℃下预处理20min后直接快速置于-196℃液氮中的玻璃化冻存方法进行冻存。②分别进行胎儿角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞的原代培养，进行细胞形态学观察，并采用锥虫蓝染色法、四唑盐比色法和克隆形成实验观察培养的第2代角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞的活力。 结果：①与常规组同种细胞相比，冻存1组、冻存2组和冻存3组的胎儿角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞的形态学特点基本相同。②与常规组相比，冻存1组、冻存2组和冻存3组角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞活细胞率、细胞存活率及克隆形成率差异均无显著性意义（P〉0．05）。 结论：利用液氮玻璃化保存用于细胞培养的皮肤标本不会影响细胞活力，是保持组织活性的一种有价值的组织标本保存方法，对组织工程皮肤的建立，乃至构建组织细胞库有着重要意义。     

组织工程皮肤构建中胎儿皮肤标本玻璃化冻存的实验

目的:建立一种用于细胞培养的皮肤标本新的保存方法。方法:实验于2004-05-01/2-31在第四军医大学西京医院烧伤外科实验室进行。①分别取流产胎儿头部及躯干部全层皮片(家属知情同意),按照标本保存方法不同分为常规组(4℃保存2h)、冻存1组(-196℃液氮保存1周组)、冻存2组(-196℃液氮保存1个月组)和冻存3组(-196℃液氮保存6个月组)。采用抗冻液4℃下预处理20min后直接快速置于-196℃液氮中的玻璃化冻存方法进行冻存。②分别进行胎儿角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞的原代培养,进行细胞形态学观察,并采用锥虫蓝染色法、四唑盐比色法和克隆形成实验观察培养的第2代角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞的活力。结果:①与常规组同种细胞相比,冻存1组、冻存2组和冻存3组的胎儿角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞的形态学特点基本相同。②与常规组相比,冻存1组、冻存2组和冻存3组角质形成细胞、成纤维细胞和毛乳头细胞活细胞率、细胞存活率及克隆形成率差异均无显著性意义(P>0.05)。结论:利用液氮玻璃化保存用于细胞培养的皮肤标本不会影响细胞活力,是保持组织活性的一种有价值的组织标本保存方法,对组织工程皮肤的建立,乃至构建组织细胞库有着重要意义。     

2种冻融方法对人类早期胚胎质量的影响

目的:探讨2种冷冻方法对人类早期胚胎冷冻复苏后胚胎质量的影响.方法:回顾性分析本院胚胎实验室胚胎冷冻复苏资料,依据胚胎冷冻方法不同分为玻璃化冷冻组(130枚)和程序化冷冻组(120枚),分析比较2组胚胎复苏率、复苏胚胎完整率、优质胚胎率、临床妊娠率等数据.结果:玻璃化冷冻复苏组与程序化冷冻组胚胎复苏率分别为100.0%与83.3%,复苏胚胎完整率为96.2%与63.5%.优质胚胎率为76.7%与50.0%,临床妊娠率为54.6%与33.3%,2组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:玻璃化冷冻技术可简化胚胎冷冻程序,冷冻复苏效果显著.可提高临床妊娠率.     

玻璃化低温保存卵巢癌细胞的配方及优化降温过程参数

实验采用玻璃化低温保存方法和程序降温方法来研究COC1细胞的低温保存效果。玻璃化低温保存：采用3种玻璃化溶液，①质量浓度为400g／L聚乙烯基吡咯烷酮＋质量浓度为200g／L蔗糖＋质量浓度为100g几甘露醇②VS55。③质量浓度为300gm聚乙烯基吡咯烷酮＋质量浓度为200g／L海藻糖。每种溶液以不同的比例与细胞悬液混合均匀，投入液氮保存。程序降温法：以甘油和二甲基亚砜为低温保护剂，分别以不同的比例添加到含有细胞悬液的冻存管中。然后采用两步降温法，投入液氮保存。结果玻璃化溶液（质量浓度为300g／L聚乙烯基吡咯烷酮＋质量浓度为200g／L海藻糖）保存COC1细胞可以获得最高细胞存活率，且玻璃化方法取得的存活率高于程序降温法。初步表明，用玻璃化方法长期保存卵巢癌细胞具有一定的可行性和前景，使COC1细胞能够最大限度的保持较好的生理功能。