武汉地区儿童乙型肝炎患者病毒S基因"a"决定簇变异的研究

目的研究武汉地区儿童乙型肝炎患者中乙型肝炎病毒（HBV）S基因变异株的分子流行病学特征。方法通过流行病学调查筛选出30例经乙型肝炎疫苗免疫的儿童乙型肝炎患者及30例未免疫儿童乙型肝炎患者，利用聚合酶链反应（PCR）扩增HBV S基因片段，直接将PCR产物进行DNA序列测定。结果在60例儿童乙型肝炎患者中检测出55例adw血清亚型，其中8例HBV S基因发生氨基酸置换；直接测序检测的已免疫和未免疫儿童乙型肝炎患者S基因氨基酸置换频率分别为20．0％和6．7％，感染基因变异株的患儿发病年龄明显偏大，其疫苗免疫年限均较长。结论本地区流行的乙型肝炎病毒毒株主要为adw血清亚型；乙型肝炎疫苗具有免疫选择表面抗原基因变异株的作用；基因变异株病毒感染有随疫苗免疫年限延长而明显增加的趋势。     

39例成人急性乙型肝炎患者血清HBV基因变异检测及其临床意义探讨

目的了解成人急性乙型肝炎患者流行的病毒基因型及基因变异情况。方法在2010年12月~2014年1月北京佑安医院收治39例急性乙型肝炎患者,采用直接基因测序法和平行等位基因特异性检测技术检测HBV基因型、P区、S区、前C区(Pre C)和基本核心启动子(BCP)区序列。结果在39例患者中,成功测序35例。35例急性乙型肝炎患者感染HBV B基因型12例(36.4%),C基因型21例(57.6%,D基因型2例(6.0%);通过直接测序法和PASS法均检测到同1例患者存在A181S耐药变异,变异病毒占准种池比例达100%;直接测序法检测到1例患者存在S区S132F和W172C变异;1例患者存在Pre C/BCP区G1896A和T1758C变异。结论急性乙型肝炎患者感染病毒基因型与文献报道的慢性乙型肝炎患者感染病毒基因型分布一致,以C型和B型为主,存在P区、S区和Pre C/BCP区变异可能,未见不同病毒株感染引起转归的不同。     

乙型肝炎病毒基因组nt531位突变特异性聚合酶链反应

目的:为调查国内乙型肝炎病毒(HBV)nt531位变异株的流行情况提供方法学。方法:根据已知的HBV基因组序列并结合国内主要流行adr和adw亚型的特点,合成在nt531位分别为C、G和T的3种不同引物,建立了突变特异性聚合酶链反应(msPCR)方法。结果:利用msPCR对10个乙型肝炎疫苗免疫失败儿童体内扩增的HBV S基因片段进行了初步检测,表明该法可分别特异性扩增nt531为C、G或T的HBV DNA,并可推测nt531为A的HBV DNA。结论:该法是鉴定HBV基因组nt531位变异株的有效方法之一。     

肝移植后乙型肝炎病毒再感染患者的病毒S区与P区重叠基因变异

目的 探讨乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)和拉米夫定对肝移植术后HBV再感染患者的HBV S基因与P基因重叠区变异的影响.方法 对2002年6月-2003年12月320例因乙型肝炎相关性终末期肝病行原位肝移植手术患者随访1.5～3.0年,选择资料完整的HBV再感染者14例为研究对象.直接基因测序法分析术前、术后HBV S基因及重叠P基因的序列改变情况;荧光定量PCR检测HBV DNA含量;微粒子捕捉酶免疫法检测血清HBIG浓度. 结果 14例患者术前、术后S区与P区氨基酸变异数量无明显改变,变异位点略有改变.基因型检测结果显示12例为C型,2例为B型,无其他基因型.S区"a-决定簇"基因变异发生在I126S、T131N、S143T和G145R位点,"a-决定簇"的上游和下游变异的有L110F、I113S和T160K位点.S区核苷酸突变时S区氨基酸存在同义与错义变异,可引起相应的P区氨基酸错义变异,其中包括已知的拉米夫定耐药位点变异及其以外的多位点氨基酸变异,且变异位点差异较大,大部分变异位点移植前已存在变异.术前有4例血清HBV DNA低于检测限,术后均阳性.HBIG浓度为0U/L者7例,≤100 U/L 5例,＞100U/L2例.结论 肝移植术后免疫抑制剂治疗对氨基酸变异位点的数目影响不大,对变异位点的位置有一定的影响;除了"a-决定簇"的基因变异点以外,"a-决定簇"的上游或下游基因位点也存在变异,可能是引起HBV再感染的另一原因;S区核苷酸位点的突变可引起S区氨基酸的同义和错义变异,并可同时引起重叠P区相应位点的错义变异,其临床意义有待进一步探讨.     

动态分析老年重症乙肝患者乙肝病毒全基因组及其表达蛋白抗原性变化

目的 动态分析1例老年重症乙型肝炎患者全基因组序列变化，在全基因组水平上阐述HBV基因组变异对其不同基因生物学特性的影响。方法 一次扩增全长乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)DNA基因组，测序鉴定，建立HBV全基因组克隆、转染表达。结果 通过测序鉴定、同源性比较和真核细胞转染分析，显示HBV基因组序列变异集中在S基因，其表达蛋白前后有抗原性变化。结论 S基因变异可以导致S蛋白抗原性变化，打破宿主体内免疫耐受，诱发重症肝炎的发生。     

慢性乙型肝炎免疫清除期患者HBsAg基因多态性

目的 研究慢性乙型肝炎免疫清除期患者乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因多态性.方法 设计特异性引物,自10例慢性乙型肝炎免疫清除期患者血清中扩增S基因片段,TA克隆法克隆到T载体中,随机选择克隆测序.结果 共20个克隆被测序,20个克隆S蛋白发现12个不同位点的32次变异.主要集中在T细胞表位,B细胞表位及a决定簇.结论 慢性乙型肝炎免疫清除期患者存在HBsAg变异,可能仍然存在HBsAg免疫耐受.     

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA和松弛环状DNA耐药突变检测及比较

目的 建立检测乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)逆转录酶区(RT)耐药位点的方法,并分析HBV cccDNA与松弛环状DNA(rcDNA)RT区耐药位点及耐药突变率的差异. 方法利用滚环扩增法(RCA)同时扩增20例慢性乙型肝炎患者肝组织中HBVcccDNA和HBV载量为108拷贝/ml血清中的rcDNA,再以该扩增产物为模板,以跨缺口引物扩增HBV cccDNA和HBV rcDNA RT区;巢式PCR直接扩增同一患者血清中HBV rcDNA RT区.HBV cccDNA和HBV rcDNA RT区扩增片段经测序后采用Vector NTI Suite8.0及chromaslite201分析其耐药突变位点;采用x2检验比较rcDNA和cccDNA RT区的耐药突变率. 结果以RCA产物为模板用跨缺口引物成功扩增并获得肝组织cccDNA RT区片段,阴性对照组及HBV载量为108拷贝/ml血清rcDNA组均无扩增产物;巢式PCR.直接扩增获得同一患者血清中HBV rcDNART区片段.序列测定结果显示,本组试验中10例有抗病毒史的慢性乙型肝炎患者发生rcDNA RT区耐药者有6例,突变率为60%,1例发生cccDNA RT区突变,突变率为10%,两者比较,P=0.019,差异有统计学意义.10例无抗病毒史的慢性乙型肝炎患者有2例发生rcDNA耐药,耐药突变率为20%,1例发生cccDNA耐药突变,突变率为10%,两者比较,P=0.531,差异无统计学意义.产生耐药突变的患者其cccDNA与rcDNA RT区耐药突变位点均不相同.结论 RCA可用于HBV cccDNA RT区耐药突变位点检测;有抗病毒史的患者的rcDNA与cccDNA RT区耐药突变不同步.在辅助临床治疗中,对HBV cccDNA进行耐药监测比对HBV rcDNA耐药监测更有意义.     

乙型肝炎病毒X区基因变异与原发性肝癌的关系研究

目的初步研究乙型肝炎病毒(HBV)X区基因变异与原发性肝癌的关系。方法收集39例HBV感染患者的肝(癌)石蜡组织标本,其中慢性乙型肝炎(CHB)14例、肝细胞癌(HCC)25例。采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增组织中HBV X区基因,并对PCR产物进行DNA测序,分析常见变异位点的变异情况。结果 1.HCC组与CHB组相比,在X区发生插入/缺失变异,联合变异的位点及例数增多,并且A1762T与G1764A常发生双突变。2.HBV X区变异频率较高位点依次是C1655T/G、A1605C/G、A1762T、G1764A、A1772B、A1645C、C1687A、G1776T。结论 HBV X区存在点突变、插入/缺失变异及联合变异,可能在HCC的发生和发展过程中起重要作用。     

重型乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒全基因克隆及测序

目的建立重型乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒（HBV）DNA克隆并测序，从全基因水平分析HBV基因变异与重型乙型肝炎发病的关系。方法10例重型乙型肝炎患者血清提取HBV DNA，聚合酶链反应（PCR）扩增HBV全基因。PCR产物构建到PUCm-T载体上，转化至大肠杆菌感受态DH-5α细胞，经酶切鉴定，获得含3．2Kb HBVDNA的重组克隆菌，全基因测序，分析各读码框核苷酸和氨基酸变化。结果4例成功构建HBV DNA克隆，并完成全基因测序。其中3例在前C区发生G1896A变异，产生一个终止密码子，导致HBeAg缺失；1例在C启动子区1762、1764双位点出现突变；有多处点突变及缺失变异分布于PreS2区及C区已知细胞毒T淋巴细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞的细胞表位。结论该法可用于临床研究HBV病毒基因结构与重型乙型肝炎发病的关系，并为进一步研究其HBV基因功能奠定基础。     

乙型肝炎疫苗母婴阻断失败与乙型肝炎病毒S基因变异

目的　探讨母亲感染HBV基因变异在乙型肝炎 (乙肝 )疫苗母婴阻断失败过程中所起的作用。方法　PCR直接测定母婴HBVS基因序列 ,对婴儿存在HBVS基因变异而母亲未发现者 ,进一步通过克隆筛选法对母亲所感染的HBV进行S基因亚群分析。结果　 11例乙肝疫苗母婴阻断失败者中有 3例幼儿存在S基因“a”决定簇的氨基酸变异 ,其中 1例幼儿母亲也存在相同的变异。对另 2例母亲所感染的HBV进行S基因亚群分析发现 ,1例母亲 9个克隆所测序列与其原序列完全一致 ;另 1例母亲 8个克隆中 ,有 6个克隆与其原序列一致 ,另 2个克隆与其幼儿所感染的HBV序列一致。结论　乙肝疫苗母婴阻断失败者感染的HBVS基因变异株可能早已存在于母亲体内 ,通过免疫选择传染给患儿。     

慢性HBV感染者HBV前C区/基本核心启动子区基因突变与临床应用

目的:探讨2010年10月至2013年6月来我院门诊及住院慢性HBV感染者中HBV前C(Pre C)区/基本核心启动子(BCP)区基因突变与其病程进展的相关性。方法:165例慢性HBV感染者血清生化指标检测,血清HBV DNA含量和HBe Ag定性检测,HBV Pre C区/BCP区突变率比较,分析Pre C区l896、BCP区1762/1764变异在HBV携带者(As C)、慢性乙型肝炎(CHB)和慢性乙型肝炎肝硬化(CHB-LC)患者中的分布。结果:血清生化指标在慢性HBV感染者病程发展中呈现相关性。与As C组比较:CHB组、CHB-LC组患者血清ALT、AST、AFP、TBA水平升高,差异有显著性意义(p0.01),呈显著正相关,而TP、Alb、A/G水平降低,差异有显著性意义(p0.05),呈负相关。HBe Ag(+)、HBe Ag(-)的标本中,BCP的突变率高于前C区突变率,差异有非常显著性意义。BCP区1762/1764双突变的突变率高于Pre C1896突变率。As C、CHB、CHB-LC 3组患者Pre C A1896、BCP区1762/1764变异率依次升高,与As C组比较,CHB组差异有显著性意义(P0.05);CHB-LC组差异有非常显著性意义(P0.01)。结论:对165例慢性HBV感染者观察,HBe Ag(+)/HBe Ag(-)患者及其病程不同发展阶段,Pre C/BCP出现相关联的突变率。特别需要注意的是HBe Ag(-)的慢性HBV感染者BCP区的突变率高于Pre C区的突变率,需要慎防HBV复制的危害性。HBV Pre C区/BCP区突变率可以预测到慢性HBV感染者病情的发展程度,对临床此类患者的研究具有重要意义。     

基因芯片技术检测拉米夫定治疗过程中乙型肝炎病毒变异的临床意义

目的探讨基因多态性诊断芯片在拉米夫定治疗慢性乙型肝炎中乙型肝炎病毒变异的临床意义。方法应用点样法制备的乙型肝炎病毒基因多态性诊断芯片对HBV前C与BCP区和P区基因包括(YMDD基序)的6个位点进行检测。结果60例患者中58例出现了基因变异,但前C/BCP区/P区各位点突变率比较无显著性差异(x2=0.97,P>0.05)。变异后血清ALT逐渐升高,在YMDD变异后,89.4%患者出现肝功能异常,3位点以上变异组为86.6%。3位点以上变异者出现HBeAg/抗HBe血清转换率为56.6%。BCP区双突变者血清转换率为35.7%,YMDD位点血清转换率为42.1%。结论拉米夫定治疗HBV感染的复发与病毒突变密切相关,但与何种位点突变更有关系,尚不清楚。     

慢性乙型肝炎拉米夫定耐药患者HBV基因型及ALT变化的观察

观察慢性乙型肝炎患者用拉米夫定治疗后HBVP基因变异与不同HBV基因型感染及HBV DNA复升水平和转氨酶变化.收集51例慢性乙型肝炎患者用拉米夫定治疗52-78周后发生YMDD变异的血清标本,对照组128例未用拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本,应用聚合酶链反应方法,测定HBV DNA基因型;用限制性片段长度多态性分析方法(PCR RELP)测定HBV DNA YMDD变异;同时进行HBV DNA定量分析.结果显示51例拉米夫定治疗后HBV DNA基因变异患者以B型和C型为主,分别为10例(19.6%)和39例(76.47%),B C混和型2例(3.92%),未见其它基因型.拉米夫定治疗引起HBVDNAYMDD变异可以发生在不同HBV基因型感染的慢性乙型肝炎患者中,与对照组比较二者没有显著性差异.     

乙型肝炎病毒复制调控元件对HBV DNA疫苗诱导的免疫应答

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）复制调控元件增强子Ⅰ（ENHⅠ）及前S2（Pre-S2）抗原基因对HBV DNA疫苗诱导的免疫应答的影响。方法采用常规聚合酶链反应（PCR）从HBV adr亚型全基因DNA序列中分别扩增HBsAg、PreS2-HBsAg、HBsAg-ENHI和PreS2-HBsAg-ENHⅠ基因片段，重组到VR1012载体中，构建4种HBV DNA疫苗，转染HepG2细胞并免疫Balb／C小鼠。通过细胞免疫化学、酶联免疫分析（ELISA）、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）等方法检测其在HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答。结果转染的HepG2细胞表达相应的目的蛋白．ENHⅠ及Pre-S2抗原基因均可增强HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg；免疫接种小鼠后第2周产生抗-HBs及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL），Pre—S2抗原基因可增强HBV DNA疫苗免疫Balb／C小鼠诱导的抗-HBs及HBsAg特异性CTL的产生，ENHⅠ基因对免疫应答无影响。结论ENHI及Pre—s2抗原基因均可增强HBVDNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg．Pre-S2抗原基因可增强HBVDNA疫苗免疫Balb／C小鼠引起的免疫应答。     

HBsAg基因变异及其意义

HBV复制过程中存在逆转录,容易发生基因变异,表面抗原基因变异可能影响临床诊断、病毒复制以及疫苗效果等。从S基因变异的发生机制、生物学及临床意义等方面讨论研究现状和存在的问题。既往大多数研究仅仅限于S基因片段,将来须要更多地从HBV角度对S基因变异进行研究。     

乙型肝炎病毒S基因变异、基因型与宫内感染免疫失败的关系

目的 探讨HBV S基因变异、基因型与宫内感染免疫失败的关系.方法选择东南大学附属南京第二医院出生的35例宫内感染免疫失败的幼儿及其母亲,实时荧光定量PCR法检测血清HBV DNA含量;并扩增其HBV S基因序列,测序并通过DNASTAR软件与基因库标准序列比对.结果幼儿及其母亲HBV DNA定量检测结果均＞1×106拷贝/mL;幼儿及母亲HBV S基因核苷酸变异率分别为11.4%和17.1%;母婴序列同源性＞99.3%;35对母婴中,23对HBV基因型为C型,血清型为adr亚型,12对为B型,血清型为adw亚型,母婴基因型相同.结论 HBV S基因是否变异可能不是高病毒血症患者宫内感染免疫失败的主要因素;基因分型并不能预测和评价新生儿是否发生宫内感染和免疫失败.     

慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒准种特点的初步研究

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）准种在慢性乙型肝炎患者中的存在状态。方法 以已知中国株HBV基因序列为依据。设计特异性聚合酶链反应（PCR）引物,自3例慢性乙型肝炎患者体内扩增HBV全S基因片段,克隆人pGEMTeasy质粒,用限制性片段长度多态性（RFLP）法确定HBV的变异现象,DNA测序确定病毒的变异程度。结果 分别自3例患者血清中克隆出29、28和8个阳性克隆,以EcoRⅠ酶切患者1和2的RFLP结果提示各有5种不同的长度带型,PCR产物XhoI酶切RFLP结果表现为高度保守,测序结果发现HBV体内毒株DNA序列高度一致,同一患者两株全S区序列测序结果表明DNA序列的同源性大于97%。结论 慢性乙型肝炎患者体内有HBV准种共存,且呈现出一定的优势克隆现象。可能与患者预后有关。     

乙型肝炎病毒基本核心启动子突变与基因型的关系

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）基本核心启动子（BCP）突变与HBV基因型的关系。方法随机选取我院68例慢性乙型肝炎患者外周血,采用荧光定量PCR结合TaqmanMGB探针技术检测HBV基因型,并用基因扩增和DNA测序方法检测BCPT1762／A1764双突变。结果68例患者HBV分型中,B基因型20例,C基因型46例,B、C混合型1例,未分型（非B非C型）1例。66例B、C两基因型中,B基因型组T1762／A1764双突变5例,突变率25．0％（5／20）,C基因型组T1762／A1764双突变24例,突变率52．2％（24／46）,C基因型T1762／A1764双突变率明显高于B基因型（P〈0．05）。结论苏州地区慢性乙型肝炎患者基因型以C型和B型为主,C基因型比B基因型更易发生T1762／A1764双突变。     

乙型肝炎病毒表面抗原一级结构多态性的初步研究

目的 研究慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原一级结构的多态性。方法 设计特异性引物，自7例慢性乙型肝炎患者血清中扩增S基因全长或全基因组片段，TA克隆法克隆到T载体中，随机选择克隆测序。结果 共20个克隆被测序。20个克隆全S蛋白的总一致率仅为32．0％，13株全长为401氨基酸残基的克隆氨基酸一致效率为82．5％。患者血清中发现2株克隆编码截短型表面抗原中蛋白，在前S1或前S2的免疫决定区或可能的肝细胞结合部位均发现缺失突变。结论 慢性乙肝患者体内存在HBV准种群，病毒编码的截短型表面抗原中蛋白可为HBV诱导原发性肝癌提供一种途径，应加强对HBsAg一级结构多态性的研究。     

宫颈癌组织中HPV16型E6/E7序列突变分析

目的：分析泉州地区宫颈癌患者HPV16型E6/E7序列突变情况,探讨其与宫颈癌发生的相关性。方法：取35例HPV16阳性的宫颈癌组织标本,采用PCR法扩增E6、E7全长基因。PCR产物直接测序,并与野生型序列进行比对。分析E6、E7基因的变异情况。结果：E6、E7基因的突变率分别为91.4%和89.2%。E6基因中有10个位点为错义突变, 2个位点为无义突变。氨基酸突变频率最高的是D25E（77.1%）。E7基因中共发现5个突变位点,有2个位点为错义突变,3个位点为无义突变,突变频率最高是N29S和无义突变T846C（均为75.0%）。结论：HPV16 E6、E7基因中最常见突变位点D25E、N29S和T846C可能与宫颈癌的发生密切相关,可为研究针对中国人群的HPV疫苗提供一定的线索。