神经膜细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体的实验研究

目的 探索神经膜(旧称许旺细胞)与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体。方法 用10μmol/mlBrdU标记体外培养纯化的许旺细胞与ECM凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人工神经桥接体,移植入SD大鼠坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中。S-100蛋白免疫组化染色鉴定许旺细胞,倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白的共培养,石蜡切片抗BrdU免疫组化染色观察体外培养纯化的许旺细胞在体内的生长情况。结果 体外培养的许旺细胞能黏附于人发角蛋白上进行良好的生长,移植入神经缺损处4周后,坐骨神经缺损处、皮下、骨骼肌中的桥接体内的人发角蛋白开始降解,黏附于该人发角蛋白上的许旺细胞均见成活并分裂增殖。结论 许旺细胞可与人发角蛋白进行三维培养,构建成人工神经桥接体,填补神经缺损。     

IL-1β激活后的许旺细胞与人发角蛋白三维培养构建人工神经桥接体

目的 探索白细胞介素-1β（IL-1β）激活后的许旺细胞与人发角蛋白复合培养构建人工神经桥接体,修复神经缺损.方法 体外培养纯化的许旺细胞经IL-1β激活前、后与细胞外基质凝胶修饰的人发角蛋白进行三维方向的共培养而构建成人工神经桥接体,移植入SD大鼠坐骨神经缺损处.S-100蛋白免疫组化染色鉴定许旺细胞,倒置显微镜和扫描电镜下观察许旺细胞与人发角蛋白共培养情况,原位杂交法观察人发角蛋白降解及神经生长因子（NGF）在坐骨神经内的表达,移植术4周后检测坐骨神经功能指数.结果 经IL-1β激活后的许旺细胞能更好地黏附于人发角蛋白表面,进行分裂、增殖.3～4周,桥接体内的人发角蛋白开始降解,其周围可见IL-1β激活后的处于增殖分裂期的许旺细胞NGF表达强阳性,坐骨神经功能恢复时间提前.结论 经IL-1β激活后的许旺细胞与细胞外基质凝胶修饰的人发角蛋白复合培养构建成人工神经桥接体,具有修复神经缺损的同时还能够加速坐骨神经损伤后功能的恢复.     

BrdU 体外标记移植许旺细胞在构建人工神经中的应用

目的 探讨5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU) 在人工神经移植体中许旺细胞的体外标记情况,为观察组织工程化人工神经中许旺细胞的转归提供方法.方法 取胎兔许旺细胞培养后(2×10 6/ml)微注入法植入2cm长去细胞神经桥接体,在含BrdU的培养液(25 mg/ml)培养1周后, 抗BrdU单克隆抗体免疫组化ABC法染色,观察许旺细胞的标记和在神经桥接体中的分布.结果 在神经桥接体中有染色阳性细胞,细胞分布均匀.结论 BrdU可作为许旺细胞移植的标记物,观察其在体外神经桥接体中的迁徙、分布,为探讨组织工程化人工神经中许旺细胞的转归奠定基础.     

组织工程化神经修复周围神经缺损的实验研究

目的通过人工神经修复神经缺损的实验研究，为神经组织工程的进一步研究和临床应用提供实验依据。方法分3组修复大鼠1cm长坐骨神经缺损：（A组）含许旺细胞的移植体；（B组）无许旺细胞的移植体；（C对照组）自体神经移植。术后10周内，进行肌肉湿重、电生理等测定以及组织学观察、图像分析。结果许旺细胞能与PLGA纤维构成活性细胞-材料复合物；神经修复术后10周，A、C两组电生理特性、组织学变化以及肌肉湿重等测定均明显优于B组，A组与C组之间无显著差别。结论许旺细胞能与PLGA纤维在体外构建具有活性的神经移植体并能够促进神经再生，其修复效果接近于自体神经移植。     

BrdU标记冷冻胚胎雪旺细胞构建人工神经的研究

目的寻求人工神经较为理想的种子细胞。方法将体外扩增的胚胎兔雪旺细胞两步冷冻法处理后运用组织工程学的原理,5-溴脱氧尿嘧啶（5-bromodeoxyuridine,BrdU）标记后种植到去细胞基膜管中制备2cm长人工神经桥接体,经培养后,桥接修复兔正中神经缺损。结果16周后移植体再生神经中仍可见到大量BrdU阳性标记的雪旺细胞。冷冻雪旺细胞为种子细胞组,取得了与自体移植组相似的效果。结论冷冻保存胚胎雪旺细胞有可能成为人工神经较好的种子细胞来源;     

冻干去细胞异种神经和类许旺细胞共移植修复外周神经缺损的实验研究

目的 研究冻干化学去细胞异种神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果.方法 48只成年雌性DA大鼠分别用4种移植物桥接大鼠1.5cm坐骨神经缺损:冻干化学去细胞异种神经与类许旺细胞共移植组、冻干化学去细胞异种神经移植组、化学去细胞异种神经移植组、异种神经移植组.术后4周、24周通过大体观察、神经电生理、肌肉湿重及组织学指标评价各组修复神经缺损的效果.结果 术后24周A组运动神经传导速度和肌肉湿重恢复率优于B、C、D组(P＜0.05);组织学检测发现,术后24周A组移植段再生神经纤维较多,以有髓神经纤维为主.结论 种植类许旺细胞的冻干化学去细胞异种神经能有效的修复大鼠周围神经缺损.     

脱细胞异种神经移植体复合BMSCs修复大鼠坐骨神经缺损的研究

目的：对脱细胞异种神经的生物相容性进行评价,证明应用其复合BMSCs促进神经再生和功能恢复的效果。方法：采用化学萃取法制备兔的脱细胞神经,应用扫描电镜观察其超微结构;将BMSCs种植到神经支架构建神经移植体,体外培养后观察细胞形态;用构建的异种神经移植体桥接大鼠坐骨神经缺损,术后8周,检测胫前肌湿重比率,对再生神经进行组织形态学分析;并应用免疫荧光染色检测神经内NGF的表达。结果：脱细胞异种神经较完整地保留了天然立体的施万细胞基底膜管结构,完全地移除了神经内的施万细胞、轴突和髓鞘成分;在体外培养中支持种植的BMSCs黏附和生长。神经移植术后,与单纯异种脱细胞神经移植组相比,复合BMSCs的异种神经移植体移植能使胫前肌湿重比率增加、有髓神经纤维数目、髓鞘厚度和轴突直径增加;增加再生神经内NGF的表达。结论：异种脱细胞神经移植体具备天然的立体结构,移除了施万细胞、髓鞘等抗原成分;神经支架无细胞毒性,具有良好的细胞相容性;复合BMSCs的异种神经移植体可显著地促进神经再生及功能恢复。     

躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管治疗坐骨神经损伤的实验研究

目的探讨体外培养的躯干神经嵴干细胞在壳聚糖纤维上立体培养后复合硅胶管治疗坐骨神经损伤的实验研究。方法采用孕10．5dWistar大鼠的胚胎神经管分离培养躯干神经嵴干细胞,将体外培养48h的躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维材料上,观察两者的组织相容性。应用黏附有躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管桥接了缺损的大鼠坐骨神经,术后进行电生理、组织学检测,观察了周围神经再生及神经通路重建的状况。结果从神经管取材的躯干神经嵴干细胞在无血清培养基内可以大量扩增;将躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维支架材料上行扫描电镜观察,可见躯干神经嵴干细胞贴附在壳聚糖纤维表面,存活良好,表明躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维支架材料有良好的相容性;桥接手术后,电生理检测结果显示,含躯干神经嵴干细胞的壳聚糖一硅胶管桥接组坐骨神经传导潜速率及波幅值显著好于单纯硅胶管桥接组（均P〈0．01）;甲苯胺蓝染色光镜观察及图像分析结果均显示含躯干神经嵴千细胞的壳聚糖一硅胶管桥接组再生轴突的髓鞘化更明显,再生纤维密度及直径等各检测指标均优于单纯硅胶管桥接组（均P〈0．01）。结论壳聚糖纤维支架材料与躯干神经嵴干细胞构建的桥接管具有良好的生物相容性,其中躯干神经嵴干细胞可分化为施万细胞,以此桥接缺损的周围神经,可促进其再生和修复。     

BMSCs联合人发角蛋白移植治疗陈旧性脊髓损伤效果

目的研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)联合人发角蛋白支架复合体移植治疗陈旧性脊髓损伤可行性。方法体外采用全骨髓贴壁筛选法原代培养大鼠BMSCs,移植前应用5溴-2脱氧尿嘧啶(BrdU)标记。采用改良Allen打击法制备大鼠陈旧性脊髓损伤模型,随机分为对照组、单纯BMSCs移植组、BMSCs联合人发角蛋白移植组,每组10只,采用立体定位移植方法分别于各组脊髓损伤部位植入细胞培养基、BMSCs悬液、人发角蛋白+BMSCs细胞悬液。移植后第1、2、4、8周应用动物后肢运动功能评分法(BBB)对大鼠后肢运动功能进行评分;移植后第8周处死大鼠,取T9~T11节段脊髓组织制备切片,采用苏木精-伊红(HE)染色法观察脊髓组织大体形态,免疫组化方法检测BrdU阳性细胞的存活及移植细胞的分化情况。结果单纯BMSCs移植组、BMSCs联合人发角蛋白移植组各时段大鼠BBB评分均优于对照组,BMSCs联合人发角蛋白移植组优于单纯BMSCs移植组,差异均有显著性(F=25.64,q=11.86~20.79,P<0.05)。HE染色观察见3组脊髓均严重受损,灰白质界限模糊,均有空洞和坏死瘢痕组织,BMSCs联合人发角蛋白移植组空洞较其余两组少。BMSCs联合人发角蛋白移植组移植部位以及头尾端距离移植中心约1 cm处均可见BrdU染色阳性细胞及BrdU+神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞。结论 BMSCs联合人发角蛋白移植后移植细胞可以存活并分化为神经元样和神经胶质样细胞,有效促进陈旧性脊髓损伤大鼠模型后肢功能的恢复,其效果较单纯干细胞移植显著。     

人发角蛋白非神经移植材料的基础研究

①目的 研究人发角蛋白非神经移植材料的解剖学特点和组织相容性，及其对周围神经缺损的修复效果。②方法 Wistar大白鼠18只随机分成3组，将其坐骨神经切取10mm，分别用人发角蛋白非神经移植材料(实验组)、大白鼠自体骨骼肌(对照I组)和未经特殊处理的人发(对照Ⅱ组)连接神经两断端。术后不同时间进行组织形态及解剖学观察。③结果 术后第8周实验组坐骨神经两断端之间出现白色新生组织；第12周白色新生组织出现于移植材料腔隙；第24周移植材料腔隙被充满，人发被初步降解，光镜下可见人发周围有大量呈无序排列的再生神经纤维，透射电镜下可见人发周围雪旺细胞增殖并形成髓鞘。对照组未出现上述变化。④结论 人发角蛋白非神经移植材料的组织相容性好，并可诱导神经纤维再生，是用于修复神经缺损较为理想的材料。     

天然脱细胞神经支架复合骨髓间充质细胞修复坐骨神经缺损

目的观察脱细胞神经支架复合骨髓间充质细胞、构建组织工程化人工神经,修复大鼠坐骨神经缺损的效果。方法贴壁法体外分离、纯化、增殖骨髓间充质细胞,取第5代细胞与脱细胞异体神经复合培养,构建移植物。SD大鼠18只,随机分为实验组,支架组,对照组。术后12周,采用坐骨神经功能指数测定、腓肠肌湿质量恢复率检测及组织学等方法评价神经缺损的修复效果。结果坐骨神经功能指数及腓肠肌湿质量恢复率的检测显示实验组优于支架组(P<0.05);组织学检查,实验组修复神经S-100蛋白表达明显强于支架组,足底皮肤单位面积内触觉小体明显多于支架组,实验组缝合神经有效神经截面积、纤维数目、纤维密度、纤维直径、髓鞘厚度均优于支架组(P<0.05),其坐骨神经缺损修复效果接近对照组。结论脱细胞神经支架复合骨髓间充质细胞可有效修复坐骨神经缺损,经脱细胞神经支架溶液诱导的骨髓间充质细胞在体内具有施万细胞的功能。     

Fas 配体(FasL)在大鼠损伤坐骨神经中的表达及其功能研究*

目的：采用分子生物学技术分析大鼠坐骨神经损伤后坐骨神经远端Wallerian溃变(Wallerian degeneration, WD)过程中,Fas配体(Fas ligand, FasL)的表达变化,并通过干扰FasL的表达分析FasL在施万细胞(Schwann cells, SCs)中的功能,探讨FasL在周围神经损伤修复与再生过程中的作用机制。方法：建立大鼠损伤坐骨神经WD模型,采用Real-time PCR和Western Blot的方法,分析FasL在大鼠坐骨神经WD过程中的表达变化,并通过培养和纯化的SCs,siRNA干扰FasL的表达分析FasL在SCs中的功能。结果：大鼠坐骨神经损伤后,在WD过程中,FasL的表达量显著升高,FasL siRNA干扰后SCs的增殖和迁移均增加,且引起SCs其他相关基因的表达变化。结论：大鼠坐骨神经损伤后,FasL的表达发生变化并影响SCs的生物学功能,提示FasL在周围神经损伤修复与再生过程中发挥了一定的作用。     

激活态雪旺细胞对神经干细胞分化作用的研究

目的探讨激活态雪旺细胞(SCs)对神经干细胞(NSCs)的分化作用。方法取出生24 h内的SD乳鼠脊髓NSCs,分离培养并传至4代。取体重(100±5)g的SD大鼠,结扎右侧坐骨神经,1周后取双侧坐骨神经,左侧提取正常坐骨神经分离培养SCs(普通SCs),右侧提取结扎变性的坐骨神经分离培养SCs(激活态SCs),均采用双酶消化加差速贴壁法。将SCs与NSCs应用Transwell培养皿联合培养,分为三组:A组为激活态SCs与NSCs;B组为普通SCs与NSCs;C组仅为NSCs。于培养的第2、4、6天检测各组NSCs活性。1周后,Western blot检测各组SCs表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达水平,免疫荧光检测各组NSCs分化比例。结果传至4代的NSCs生长稳定,分离的SCs 7 d后大量增殖呈旋涡状。联合培养后MTT法检测细胞活性,第2、4天三组细胞的活性差异无统计学意义(P>0.05),第6天C组活细胞比例开始降低,A、B组与C组比较差异有统计学意义(P<0.05),A组与B组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot检测A组细胞表皮生长因子(EGF)表达水平(0.486±0.028)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达水平(0.385±0.023)均高于B组,差异有统计学意义(P<0.05)。MAP-2荧光染色,每高倍视野阳性细胞比例A组[(35.26±2.53)%]高于B组[(27.63±3.45)%],差异有统计学意义(P<0.05);GFAP荧光染色,每高倍视野阳性细胞比例A组[(62.42±3.78)%]低于B组[(70.18±1.26)%],差异有统计学意义(P<0.05)。结论激活态SCs能够促进NSCs向神经元的分化进程,提高神经元的分化比例。     

有活性的人工神经导管修复大鼠面神经的实验研究

目的探讨胶原细胞源性神经生长因子（GDNF）基因转染的许旺细胞与聚乳酸／聚羟基乙酸（PLGA）管复合构建的人工神经导管在修复面神经缺损方面的优势。方法利用乳鼠臂丛神经和坐骨神经取材,双酶消化法培养许旺细胞,PcDNA3．1（＋）／GDNF质粒通过脂质体转入许旺细胞。与PLGA管构建有生物活性的人工神经导管。将30只sD大鼠随机分成3组,分别用直接缝合（A组）,未转染的许旺细胞与PLGA管（B组）,转染的许旺细胞与PLGA管修复面神经缺损（C组）。术后2周,1个月,2个月,3个月分别进行大体观察、面神经肌电图、有髓神经纤维计数和髓鞘厚度测量。结果C组的面神经肌电图较A,B组恢复快,且差异有统计学意义;A,B组之间神经肌电图差异无统计学意义。C组的有髓神经纤维计数和髓鞘厚度均较A,B组高,差异有统计学意义。结论GDNF基因转染的许旺细胞复合PLGA管构建的具有生物活性的人工神经导管在修复面神经缺损方面优势明显。     

PRKCq在大鼠损伤坐骨神经组织中的表达及其作用研究

目的：通过分子生物学方法,分析大鼠坐骨神经损伤后Wallerian溃变过程中,Protein Kinase-theta （PRKCq）在远端神经组织中的表达,进一步通过培养的施旺细胞（Schwann cell, SC）,分析PRKCq对体外培养SC的作用,揭示PRKCq在周围神经Wallerian溃变过程中的功能及机制。方法：制备不同时间点损伤大鼠坐骨神经溃变模型,采用Real-time PCR和siRNA的方法,分析PRKCq在大鼠坐骨神经损伤后,不同时间点远端组织中的表达变化,进一步培养和纯化SC,干扰PRKCq在SC中的表达,分析PRKCq对SC增殖和迁移的影响。结果：大鼠坐骨神经损伤后,在Wallerian溃变过程中,远端组织PRKCq的表达显著降低,PRKCq可在培养的SC中表达,PRKCq siRNA干扰SC后,抑制了SC的增殖和迁移。结论：在大鼠坐骨神经损伤后Wallerian溃变过程中,PRKCq的表达显著降低并影响SC的功能,提示PRKCq在神经损伤修复过程中可能发挥一定的作用。     

Study on the adoption of Schwann cell phenotype by bone marrow stromal cells in vitro and in vivo

To explore the possibilities of bone marrow stromal cells （MSCs） to adopt Schwann cell phenotype in vitro and in vivo in SD rats. Methods MSCs were obtained from tibia and femur bone marrow and cultured in culture flasks. Beta-mercaptoethanol followed by retinoic acid, forskolin, basic-FGF, PDGF and heregulin were added to induce differentiation of MSCs＇. Schwann cell markers, p75, S-100 and GFAP were used to discriminate induced properties of MSCs＇ by immunofluorescent staining. PKH-67-1abelled MSCs were transplanted into the mechanically injured rat sciatic nerve, and laser confocal microscopy was performed to localize the PKH67 labelled MSCs in the injured sciatic nerve two weeks after the operation. Fluorescence PKH67 attenuation rule was evaluated by flow cytometry in vitro. Results MSCs changed morphologically into cells resembling primary cultured Schwann cells after their induction in vitro. In vivo, a large number of MSCs were cumulated within the layer of epineurium around the injured nerve and expressed Schwann cell markers, p75, S- 100, and GFAP. Conclusion MSCs are able to support nerve fiber regeneration and re-myelination by taking on Schwann cell function, and can be potentially used as possible substitutable cells for artificial nerve conduits to promote nerve regeneration.     

自体神经-变性骨骼肌并联复合桥接物修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究

目的:研究自体神经-变性骨骼肌并联复合桥修复大鼠坐骨神经缺损的效果及可行性。方法:成年Wistar大鼠54只,雌雄不限,随机分为3组。各组动物均切除一段坐骨神经形成10mm缺损,A组(n=18)行缺损远端神经原位束间分离后,切取10mm一束,与经过热变性处理的自体骨骼肌条“并联”形成复合桥桥接缺损坐骨神经;B组(n=18)行自体神经桥接;C组(n=18)行单纯变性骨骼肌桥接。术后24周,对各组胫前肌湿重恢复率,桥体再生神经纤维数目、直径和髓鞘厚度进行图像测量分析。结果:胫前肌湿重恢复率、桥体单位面积再生有髓神经纤维数量(密度)、纤维直径和髓鞘厚度统计学分析显示:A、B两组与C组相比有统计学差异(P<0.05),A、B两组再生效果优于C组;A、B组的胫前肌恢复率和单位面积再生有髓神经纤维数目比较,无显著性差异(P>0.05)。结论:损伤神经远端束间分离自体神经与变性骨骼肌“并联”复合桥修复大鼠坐骨神经缺损效果接近自体神经,优于变性骨骼肌桥,有深入研究的必要。     

失神经骨骼肌提取液对雪旺细胞体外增殖的作用

目的：观察去神经支配骨骼肌粗提液在体外培养条件下对雪旺细胞（Schwann cells,SCs)增殖的作用,了解外周神经损伤后SCs大量增殖的机理。方法：将新生大鼠SCs培养标本分为加正常骨骼肌提取液组,加失神经支配骨骼肌提取液组和正常对照组,每组10个标本。通过活细胞计数和S－100免疫细胞化学染色证实,观察两种肌肉提取液对SCs增倍时间的影响。结果：对照组SCs增倍时间为8天,正常骨骼肌提取液组为7天,而去神经支配骨骼肌提取液组为5．5天。结论：周围神经损伤后SCs可能受失神经支配骨骼肌产生的某些物质的刺激而增殖加快。