酵母双杂交技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白基因

乙型肝炎病毒(HBV )的慢性感染是引发肝细胞癌的主要危险因子,HBV诱导细胞恶性化的发病机制还未完全弄清,已有许多研究提示HBVX蛋白(HBxAg)对多种增强子及启动子有反式激活作用[1,2 ] ,在HBV诱导肝细胞癌的发生中起着重要作用。筛选肝细胞中与HBxAg结合的蛋白对探讨HBV致癌的细胞效应机制提供了重要线索。材料与方法一、材料及主要试剂AH10 9酵母菌株、预转化的cDNA肝文库(Y187)、pGBKT7 BD克隆载体及酵母YPD培养基、SD培养基、X αgal购于Clontech公司。大肠埃希菌DH5α及HBVayw亚型基因全序列质粒载体pCP10为本室保存…     

酵母双杂交技术筛选人白细胞cDNA文库中HCV NS4B结合蛋白

目的筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白4B（HCV NS4B）在人白细胞eDNA文库中的相互作用蛋白。方法应用酵母双杂交技术筛选人白细胞文库中与HCV NS4B相互作用的蛋白,对筛选结果中目的蛋白的编码基因进行克隆,并构建其酵母表达载体,在酵母细胞中进行回交验证。结果共筛选出人白细胞eDNA文库中与能够与HCV NS4B相互作用的蛋白5种（溶菌酶前体、推测的人翻译起始因子、人选择素P配体、人HC7371基因和TNF—alpha转换酶）以及一个未知功能基因。对新基因成功克隆,在酵母细胞中回交验证了HCVNS4B与该基因的相互作用。结论在人白细胞cDNA文库中存在一些能够与HCV NS4B相互作用的蛋白,它们均与细胞的生长和代谢状态有着密切的关系,其具体作用机制尚有待进一步研究。     

酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(Middle hepatitis B surface protein,MHBs protein)相互作用的肝细胞蛋白。方法 PCR扩增MHBs编码基因并将S区起始密码子突变,获得目的基因MHBs-mut,克隆于诱饵载体pGBKT7。在证实MHBs-mut蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。结果构建酵母双杂交诱饵载体,获得重组质粒pGBKT7-MHBs-mut。Western blot显示其在酵母中表达MHBs-mut蛋白。酵母双杂交筛选并验证,得到与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白:COP9信号体第五个亚单位(COPS5,又名C-Jun结合蛋白1,c-Jun-activation-domain binding protein 1,JAB1)。结论乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白与COPS5在酵母AH109细胞中具有相互作用。     

酵母双杂交筛选肝细胞中乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白基因

目的筛选并克隆人肝细胞中与HBsAg中蛋白(MHBs)相互作用肝细胞蛋白的基因,探讨MHBs的生物学功能。方法应用PCR法以HBV adr亚型全序质粒A7为模板扩增MHBs基因,克隆到pGEM-T载体中扩增并测序鉴定,EcoR I和BamH I双酶切后回收连接到酵母表达载体pGBWT- 7中并应用酵母双杂交系统3,构建MHBs诱饵质粒并转化酵母AH109,与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖苷酸上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌氨苄青霉素-LB平板上,选择并测序结果在GenBank中进行生物信息学分析。结果构建MHBs酵母细胞表达载体,配合后筛选出既能在四缺培养基(SD/-Trp-Leu-Ade-His)上培养也能在铺有X-α-半乳糖苷酸的四缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落2个,其中一个克隆为人醛缩酶B、另一个克隆为未知功能基因,新基因命名为MBP1。结论扩增出MHBs基因,用酵母双杂交技术筛选出2个与MHBs相互作用的肝细胞结合蛋白编码基因,为阐明MHBs的生物学功能及HBV损害肝细胞、致癌等方面的作用提供了新线索。     

丙型肝炎病毒E2结合蛋白1结合蛋白的酵母双杂交筛选研究

目的 应用酵母技术筛选丙型肝炎病毒(HCV)7包膜蛋白E2结合蛋白1(E2BPl)的结合蛋白。方法 应用酵母双杂交系统3，构建E2BP1诱饵质粒，转化酵母AH109，与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合，于涂有x-α-gal营养缺陷型培养基(SD／-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长，对于阳性克隆的插入基因片段序列进行测定，并进行生物信息学分析。结果 53个阳性克隆测序，结果与GenBank数据库进行初步比较。其中6个克隆为未知功能基因，其余47个均与己知基因的序列高度同源(90％～100％)。这47个己知基因包括人类酶原颗粒蛋白16、人类染色体序列、人类乙酰辅酶A转乙酰酶1(ACATl)、人类4．羟基苯丙酮酸二加氧酶、人类硒蛋白P1(SEPP1)、人类组织蛋白酶F(CTSF)、人类prosaposin(PSAP)、人类金属硫蛋白2A等16种。结论 HCVE2BP结合蛋白的酵母双杂交技术筛选为进一步研究E2BP1蛋白相互作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础。     

酵母双杂交技术筛选人胰腺细胞中HCV 1b NS3结合蛋白基因

目的:应用酵母双杂交技术筛选人胰腺cDNA文库中与HCV 1b亚型非结构蛋白NS3相互作用的结合蛋白的编码基因, 为进一步研究HCV影响糖、脂代谢机制奠定实验基础.方法:扩增人胰腺cDNA文库并纯化鉴定, 纯化后的文库质粒转化酵母菌Y187; 构建诱饵质粒PGBKT7-NS3并转化酵母菌AH109, 在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落.应用酵母双杂交系统3将阳性重组AH109菌株与重组酵母菌株Y187进行配合, 在四缺培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的四缺培养基上进行筛选, 提取蓝色酵母菌落质粒, 电转化大肠埃希菌DH5α后提取质粒测序,对测序结果进行序列比对和分析.结果:成功构建人胰腺cDNA文库和pGBKT7-NS3重组质粒; 将pGBKT7-NS3质粒转化AH109酵母菌株后, 并从人胰腺cDNA文库中筛选出11种与HCV NS3蛋白相结合的蛋白基因.结论:筛选出的与HCV NS3蛋白结合的胰腺蛋白基因中, 部分与2型糖尿病、肝脏脂肪变性密切相关.     

酵母双杂交法对HBV表面抗原主蛋白候选结合蛋白的筛选

目的:自肝细胞cDNA文库中筛选与HBV主蛋白(SHBs)相互作用的蛋白基因,探讨主蛋白的生物学功能.方法:利用PCR扩增S主蛋白基因,定向克隆技术将靶基因克隆到pDEST32构建出S主蛋白的诱饵质粒:Western blot方法验证转化诱饵质粒的酵母细胞表达SHBs:将诱饵质粒与人肝cDNA文库猎物质粒共同转化MaV203酵母细胞,在营养缺陷型培养基和X-gal上进行三重筛选阳性菌落,提取阳性酵母茵落的猎物质粒进行DNA测序;利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对于筛选结果进行分析.结果:构建S主蛋白及肝文库酵母细胞表达载体,进行酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,筛选出既能在缺陷培养基也能在X-gal的检测下变成蓝色的真阳性菌落3个,分别为核糖体蛋白L3、微管蛋白α-1a和α-2巨球蛋白.结论:用酵母双杂交技术筛选出3个与SHBs相互作用的肝细胞结合蛋白编码基因,提示SHBs可能参与到肝细胞内部的多种生物学反应.     

酵母双杂交技术对人胰腺cDNA文库中HBcAg结合蛋白基因的筛选

目的: 应用酵母双杂交技术,筛选人胰腺cDNA文库中与HBV核心抗原结合的蛋白的基因.方法:扩增人胰腺cDNA文库并纯化鉴定,将其转化至酵母菌Y187;诱饵质粒pGBKT7-HbcAg转化酵母菌AH109并筛选鉴定.应用酵母双杂交系统3进行配合,在SD/-Trp/Leu-His/-Ade培养基和含X-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上进行双重筛选,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌DH5α,提取质粒并测序,对测序结果进行生物信息学分析.结果:人胰腺cDNA文库的构建以及pGBKT7-HBcAg质粒转化AH109酵母菌株均获成功,并从人胰腺cDNA文库中筛选出9个与HBcAg蛋白相结合的蛋白基因.分别与以下已知的9种编码蛋白基因序列同源:人胰脂肪酶(PNLIP)、人胆盐刺激酯酶(CEL)、人胰凝乳蛋白C(CTRC)、人胰蛋白酶原、人羧肽酶B1(CPB1)、人线粒体全基因组、人胰弹性酶2A、人辅脂肪酶(CLPS)和人核糖体蛋白(RPL10A).结论:筛选出的与HBcAg蛋白相结合的蛋白基因主要与胰腺外分泌功能相关,HBV感染可能通过与胰腺所分泌的糖、脂类代谢相关的酶类结合,而引发代谢性疾病.     

酵母双杂交筛选与CVB3 VP3相互作用的人心脏蛋白

目的 从人心脏cDNA文库中筛选与B3型柯萨奇病毒(coxsackievirus group B type 3,CVB3)结构蛋白VP3相互作用的蛋白,为进一步研究CVB3分子致病机制提供新的线索。方法 构建酵母双杂交重组质粒(pGBKT7-VP3),转化至感受态酵母菌AH109,检测BD-cMyc-VP3融合蛋白自激活,应用酵母双杂交筛选与CVB3 VP3相互作用的人心脏蛋白。对阳性候选克隆进行测序和同源性比对分析;α-半乳糖苷酶活性定量分析VP3与各阳性蛋白之间相互作用的强弱。结果 诱饵质粒pGBKT7-VP3构建成功,检测到BD-cMyc-VP3融合蛋白在AH109中表达,且诱饵蛋白VP3在酵母中不存在自激活,从人心脏cDNA文库中筛选到10个与CVB3 VP3相互作用的蛋白:真核翻译起始因子4A2、羟酰辅酶A脱氢酶三官能蛋白转录变体3、肌钙蛋白I3型、平滑肌蛋白3、线粒体乙醛脱氢酶2等。结论 本研究成功应用酵母双杂交技术筛选出与CVB3 VP3相互作用的10个蛋白。为研究CVB3引起心肌炎和心肌疾病的分子致病机制提供了一些新的线索。     

应用酵母双杂交技术筛选与癌性锚蛋白重复序列相互作用的蛋白

目的:筛选与癌性锚蛋白重复序列(Gankyrin)相互作用的蛋白。方法:构建诱饵(Bait)质粒pGB-Psmd10-1,采用β-半乳糖苷酶滤膜分析检测其自身转录活性,以Bait质粒筛选人Hela细胞MATCHMAKER cDNA文库,共转染重复验证阳性克隆,并测序鉴定。结果:成功构建Bait质粒,经验证对报告基因LacZ无自激活作用。以Bait质粒筛选人Hela细胞cDNA文库,获得83个克隆,其中5个克隆经重复验证确定为阳性克隆,测序结果显示其cDNA为Psmc4的3段不同剪接体(NM_006503.2,NM_153001.1)。结论:在人Hela细胞中,Psmc4为与Gankyrin相互作用的蛋白。     

噬菌体表面展示技术筛选隐源性肝炎血清蛋白结合蛋白

目的:通过筛选隐源性肝炎血清蛋白结合蛋白,为隐源性肝炎的发病机制研究探索新途径.方法:应用噬菌体表面展示技术,将隐源性肝炎患者血清作为固相筛选蛋白,用噬菌体正常人肝细胞T7cDNA文库进行5轮生物筛选,经噬斑PCR,对筛选克隆进行DNA序列分析,将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索,自GenBank中获得结合蛋白的cDNA和基因组的全长序列,然后再探讨该蛋白在隐源性肝炎发病机制中的作用.结果:噬菌体经过5轮生物富集后,从随机筛选的60个克隆中得到24个阳性克隆,经序列测定后进行同源搜索,初步确定人类HCVNS5A转化调节蛋白13(NS5ATP13)为人体肝脏中固有的与隐源性肝炎血清蛋白结合的蛋白.结论:应用T7cDNA噬菌体表面展示技术,我们发现隐源性肝炎血清蛋白与人类肝细胞HCVNS5A转化调节蛋白13相互作用,在隐源性肝炎发生及抗病毒治疗有重要意义.     

Screening of hepatocyte proteins binding to F protein of hepatitis C virus by yeast two-hybrid system

AIM: To investigate the biological function of F protein by yeast two-hybrid system. METHODS: We constructed F protein bait plasmid by cloning the gene of F protein into pGBKT7, then recombinant plasmid DNA was transformed into yeast AH109 (a type). The transformed yeast AH 109 was mated with yeast Y187 (a type) containing liver cDNA library plasmid in 2×YPDA medium. Diploid yeast was plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) containing X-α-gal for selection and screening. After extracting and sequencing plasmids from positive (blue) colonies, we underwent sequence analysis by bioinformatics. RESULTS: Thirty-six colonies were selected and sequenced. Among them, 11 colonies were zymogen granule protein, 5 colonies were zinc finger protein, 4 colonies were zinc-α-2-glycoprotein, 1 colony was sialyltransferase, 1 colony was complement control protein factor I, 1 colony was vitronectin, and 2 colonies were new genes with unknown function. CONCLUSION: The yeast two-hybrid system is an effective method for identifying hepatocyte proteins interacting with F protein of hepatitis C virus. F protein may bind to different proteins.     

乙型肝炎病毒全S蛋白结合蛋白基因的筛选

HBV与肝硬化、肝细胞癌的发生发展密切相关[1],通过其表达的病毒蛋白与肝细胞蛋白相互作用导致疾病进展.本研究中,我们对全S基因编码产物功能进行了探讨,并以其为靶蛋白,利用酵母双杂交技术寻找其与肝细胞相互作用的蛋白质,以进一步探讨HBV致病机制.     

酵母双杂交筛选与CVB3 3A相互作用的人心脏蛋白

目的 以CVB3非结构蛋白3A为诱饵,从人心脏cDNA文库中筛选与其相互作用的宿主蛋白,对阳性cDNA克隆进行初步分析和鉴定。方法 构建pGBKT7-3A重组质粒, Western Blot检测3A融合蛋白的表达;利用酵母双杂交技术筛选人心脏cDNA文库,经PCR扩增cDNA插入片段和Alu I酶切等实验将阳性克隆归类,并通过测序、相似性比对分析和回返配合实验去除假阳性蛋白。结果 成功构建诱饵质粒pGBKT7-3A,Western Blot结果表明,pGBKT7-3A重组质粒在酵母菌中成功表达3A融合蛋白;经双杂交筛选和回返配合实验,获得了7个相互作用的蛋白,分别为:兰尼碱受体2(Ryanodine Receptor 2,RyR2),信号肽酶 2(Signal peptidase complex subunit 2 ,SPCS2),跨膜蛋白emp24(Transmembrane emp24 protein transport domain containing 4,TMED4),细胞色素c氧化酶亚基I(Cytochrome c oxidase subunit I ,COX1),细胞色素c氧化酶亚基III(Cytochrome c oxidase subunit III,COX3),肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MYH7)和琥珀酸脱氢酶亚基D(Succinate dehydrogenase complex subunit D,SDHD)。结论 应用酵母双杂交技术,以CVB3 3A为诱饵蛋白,从人心脏cDNA文库中获得7种不同的阳性基因: RyR2 、SPCS2 、TMED4、COX1、COX3、MYH7和 SDHD,在分子水平上探索3A蛋白的新功能。     

Screening of genes of proteins interacting with p7 protein of hepatitis C virus from human liver cDNA library by yeast two-hybrid system

AIM: To investigate the biological function of p7 protein and to look for proteins interacting with p7 protein in hepatocytes. METHODS: We constructed p7 protein bait plasmid by cloning the gene of p7 protein into pGBKT7, then transformed it into yeast AH109 (a type). The transformed yeast was mated with yeast Y187 (a type) containing liver cDNA library plasmid, pACT2 in 2xYPDA medium. Diploid yeast was plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) containing x-α-gal for selection and screening. After extracting and sequencing of plasmids from blue colonies, we performed sequence analysis by bioinformatics. RESULTS: Fifty colonies were selected and sequenced. Among them, one colony was Homo sapiens signal sequence receptor, seven colonies were Homo sapiens H19, seven colonies were immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat, three colonies were spermatid peri-nuclear RNA binding proteins, two colonies were membrane-spanning 4-domains, 24 colonies were cancer-associated antigens, four colonies were nucleoporin 214 ku and two colonies were CLL-associated antigens. CONCLUSION: The successful cloning of gene of protein interacting with p7 protein paves a way for the study of the physiological function of p7 protein and its associated protein.     

酵母双杂交体系筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白相关蛋白

目的 利用酵母双杂交体系筛选乙型肝炎病毒前S1(PreS1)蛋白相关蛋白,进一步探讨PreS1在乙型肝炎病毒(HBV)人胞中的作用机制。方法 以HBV DNA阳性血清为模板扩增含EcoRⅠ与PstⅠ酶切位点的PreS1基因序列,pAS2—1载体及PreS1基因PCR产物经双酶切并连接,对饵载体pAS2—1—PreS1进行序列测定;将pAS2—1—PreS1转化入酵母菌AH109,以western blot法证实其在酵母细胞中的表达。将pAS2—1—PreS1及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞,通过选择性培养、LacZ活性测定筛选阳性菌落,分离实验及交合实验排除假阳性,扩增阳性克隆的目的基因并进行序列测定,结果提交BLAST程序,在GenBank数据库查询其同源序列。结果 饵载体pAS2—1—PreS1经序列测定含有完整的PreS1基因片段,western blot证实转化的酵母细胞能正确表达完整的PreS1—BD融合蛋白。pAS2—1—PreS1与正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养共长出97个菌落,筛选出1个阳性克隆,其PCR扩增产物经GenBank数据库查询与人类初期多肽相关复合体α亚单位(NACA)高度同源。结论 成功构建了pAS2-1-PreS1饵载体,并通过酵母双杂交体系筛选出肝细胞内与PreS1相互作用的蛋白NACA。     

Localization of hepatitis C viral RNA and capsid protein in human liver

In the livers of patients whose sera contained antibodies to C100-3 antigen (anti-HCV) and hepatitis C virus (HCV) RNA, the presence of HCV RNA and HCV capsid protein (CP) antigen was demonstrated byin situ hybridization and immunohistochemistry, respectively. It was found that occasional hepatocytes in four of ten livers from patients whose sera were positive for both anti-HCV and HCV RNA hybridized with antisense as well as sense oligonucleotide DNA probes, whereas the probes did not hybridize with livers from patients whose sera were negative for anti-HCV and HCV RNA. Monoclonal antibody against a synthetic oligopeptide with amino acid sequence of HCV CP reacted with occasional hepatocytes in six of 14 livers from patients whose sera contained these HCV markers, but not with livers from patients whose sera were negative for both of them. These results suggest that HCV proliferates within hepatocytes since both antisense and sense probes hybridized with cytoplasm of the hepatocytes and that the virus matures in the cytoplasm as the capsid proteins were also found in the hepatocytes.This study was supported in part by grants from the Japanese Ministry of Health and Welfare     

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒 E2蛋白反式调节基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HCVE2蛋白反式调节相关基因。方法以HCVE2表达质粒pcDNA3.1(-)_E2转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,从中提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR)扩增,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HCVE2蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到78个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到100～1000bp插入片段。挑取38个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得35个已知基因序列和3个未知基因。通过生物信息学分析获得其全长序列,其功能正在研究中。结论应用SSH技术成功构建了HCVE2反式调节基因差异表达的cDNA消减文库。该文库的建立为进一步阐明HCVE2反式调节的靶基因及致慢性肝脏疾病发生的分子生物学机制提供理论依据。