昆明小鼠胰腺干细胞分离培养及特性鉴定

目的：分离培养昆明小鼠胰腺干细胞并进行鉴定和观察其分化胰岛细胞的能力。方法：用酶消化法分离生后不同时期昆明小鼠胰腺干细胞，用细胞角质蛋白19（Cytokeratin19,CK19）、胰岛素（Insulin）和胰高血糖素（Glucagon）抗体进行免疫细胞化学染色，鉴定细胞各类和分化特性。结果：分离初，可见少量上皮样细胞存活，更换含有生长因子的培养基后，可见细胞分裂增殖，呈长梭形，逐渐形成集落。传代后鉴定呈CK19阳性。高糖诱导分化后，细胞形成胰岛样结构，免疫细胞化学染色显示大部分细胞胰岛素阳性，少数细胞呈胰高血糖素阳性。结论：昆明小鼠胰腺干细胞能在体外培养条件下增殖，具有分化形成胰岛β细胞和α细胞的能力。     

新生大鼠胰腺干细胞的分离和培养及初步鉴定

目的探讨分离、培养及初步鉴定新生大鼠胰腺干细胞的方法。方法取30只无特定病原体(SPF)级新生大鼠的胰腺组织,用完整胰腺胶原酶消化法分离胰岛。以低糖改良Eagel培养液为基础培养液,于不同时期分别添加血清、碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂、白血病抑制因子、神经干细胞原代培养的无血清培养液中的营养因子B27、神经元培养的无血清培养液中的营养因子N2等进行培养,倒置相差显微镜下观察其形态学特征及生长特性。应用免疫细胞化学法对培养不同时期的细胞进行巢蛋白(Nestin)及细胞角质蛋白19(CK-19)检测,并进行初步鉴定。结果 1新生大鼠胰腺内纤维组织少,体积小,完整胰腺胶原酶消化法简化了胰岛分离步骤,减少了污染机会,有利于进一步培养。2培养24 h可见细胞贴壁,但贴壁细胞数量较少,改用无血清培养后,贴壁细胞快速生长,10~15 d形成单层细胞汇集,细胞形态较一致。3培养所得细胞一直较多表达胰腺干细胞的标志物Nestin,随培养时间延长,表达CK-19的细胞数量逐渐增多。结论新生大鼠胰腺消化后,获得的细胞于不同时期表达胰腺干细胞的标志物Nestin、CK-19。     

人胰腺干细胞的体外分离培养、鉴定和分化特性

目的：体外分离培养人胰腺干细胞，进行鉴定并初步观察其分化为胰岛内分泌细胞的能力。方法：用酶消化法从人胎儿胰腺分离胰腺干细胞，培养并传代，应用胰腺干细胞特异性标志物CK－19、胰岛β细胞特异性成分胰岛素和α细胞特异性成分胰高血糖素的抗体进行免疫细胞化学染色鉴定细胞种类和分化特性。结果：分离培养的人胎儿胰腺干细胞呈梭形，最初1周生长较慢，以后增殖较快，约培养3周后即可传代培养。传代细胞约生长2周即可再次传代，免疫细胞化学染色显示细胞呈CK－19免疫阳性反应。经诱导分化后，细胞形成类胰岛样组织，此时免疫细胞化学染色显示部分细胞呈随岛素免疫阳性反应，少数细胞呈胰高糖素免疫阳性反应。结论：人胰腺干细胞能在体外培养条件下快速增殖，并具有多向分化潜能，能分化形成胰岛β细胞和α细胞。     

成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离?培养及鉴定

目的:建立成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养及鉴定的方法.方法:V型胶原酶溶液灌注消化成年大鼠胰腺组织,并经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,而后加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)继续培养,7天可形成单层细胞,用0.25%胰酶-EDTA消化并传代培养.取第2代细胞利用免疫荧光染色和RT-PCR方法检测CK19、Pdx-1、Nestin、insulin及glucagon的表达.结果:经胶原酶灌注消化胰腺导管上皮,再经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织,可使胰腺导管细胞得到较好的纯化.免疫荧光结果示:胰腺导管细胞CK19、Pdx-1和Nestin染色呈阳性,阳性细胞率分别为(88.6±6.2)%、(84.6±8.6)%和(79.3±10.5)%,而insulin及glucagon染色为阴性.RT-PCR结果显示该细胞表达CK19、Pdx-1和Nestin基因.结论:该方法可较好的分离出胰腺导管细胞.经鉴定该法培养所获细胞具有胰腺干细胞的特性.     

人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定

目的：进行人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定,为组织工程的进一步研究提供实验依据。方法：将剪碎的人脂肪组织加入Ⅰ型胶原酶消化,离心。将细胞悬液置于6孔培养板中,37℃、5%CO₂培养箱中培养,细胞达80％融合时进行传代。选取第3代细胞,进行免疫组织化学染色,检测细胞表面抗原标记物;选取第3代细胞,分为成骨诱导组和成脂诱导组,每组又分为诱导组（加入相应诱导培养基）及对照组（未经诱导的细胞）。成骨诱导72 h后进行碱性磷酸酶（AKP）含量检测,8 d后进行茜素红染色,检验细胞内是否出现钙沉积;成脂诱导2周后进行油红O染色,检测细胞内是否形成脂滴。结果：培养细胞均有CD44、CD49d抗原阳性表达,不表达CD45、CD106抗原;成骨诱导72 h后,诱导组细胞内AKP含量(0.488 3 U•g^-1prot)较对照组(0.063 2 U•g^-1prot)明显增高（P<0.05）;8 d后诱导组茜素红染色阳性,对照组阴性;成脂诱导2周后油红O脂肪颗粒染色为阳性,对照组为阴性。结论：利用原代细胞培养技术可成功地从人脂肪组织中分离出脂肪干细胞。     

神经干细胞的分离培养及其鉴定

目的：从成年大鼠纹状体区和胎鼠皮层分离并鉴定神经干细胞。方法：利用无血甭培养和单细胞克隆技术在成年大鼠纹状体区和胎鼠皮层分离具有单细胞克隆能力的细胞群,选取单个克隆进行连续传代培养获得大量亚克隆,采用免疫荧光细胞化学技术检测克隆细胞Ｎｅｓｔｉｎ抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果：从纹状体区和皮层分离的细胞群具有连续克隆能力,胚胎早期细胞抗原－Ｎｅｓｔｉｎ抗原阳性,分化后的细胞表达神经元     

人牙周膜干细胞的分离培养及鉴定

目的:探讨人牙周膜干细胞的多向分化潜能。方法:体外分离培养人牙周膜细胞,光镜下及HE染色鉴定细胞形态学特征。免疫组化法检测波形蛋白、角蛋白、CD44的表达。成骨诱导法培养人牙周膜干细胞向成骨细胞分化。结果:体外成功分离培养人牙周膜干细胞。角蛋白阴性表达,波形蛋白阳性表达,CD44阳性表达。诱导成骨结果显示人牙周膜干细胞具有潜在的多向分化潜能。结论:人牙周膜干细胞在体外可以诱导分化为成骨样细胞,具有多向分化的潜能。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

兔骨髓间质干细胞的体外分离,培养及活性鉴定

目的：建立一种体外分离培养自体兔骨髓间质干细胞（ＭａｒｒｏｗＳｔｒｏｍａｌＣｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ）的方法。方法：抽取兔骨髓液３～５ｍｌ经密度梯度离心得骨髓单个核细胞,以１．６×１０＾４／ｃｍ＾２细胞浓度培养,１２～１４ｄ后得到贴壁生长的单层细胞,随后进入传代培养,每传一代约５～７ｄ。结果：原代培养的,以及传代后培养的细胞均为贴壁生长的,均匀一致的纺锤形细胞,两种细胞经体外特殊环境诱导后可转化为骨髓网     

小鼠神经干细胞的分离和培养及其鉴定

目的：探讨体外分离和培养及鉴定小鼠神经干细胞,为相关的实验研究奠定基础。方法：利用神经干细胞条件培养基和单细胞克隆技术,从胚胎小鼠大脑皮质分离并体外培养胚胎期小鼠大脑皮质细胞,连续稳定传代20代后,以免疫荧光细胞化学法检测克隆细胞Nestin和分化后细胞中胶质原纤维酸性蛋白、β-tublin和半乳糖苷酶的表达。结果：从小鼠大脑皮层分离的细胞群具有连续形成克隆能力,其Nestin表达阳性。分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞的特异性抗原。结论：成功分离并获得了小鼠皮层神经干细胞,该细胞可连续稳定传代,具备多向分化潜能,可用于进一步的实验研究。     

人表皮干细胞的快速分离培养及鉴定

目的 探讨人表皮干细胞的体外快速分离和培养方法.方法 运用Dispase Ⅱ酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮干细胞.分离的表皮片经表皮干细胞培养基(ESCM)悬浮,接种于IV型胶原包被的培养板中,37 ℃、5%CO2 饱和湿度的细胞培养箱内静置培养10 min,留用贴壁细胞;Ⅳ型胶原黏附、分离并富集后继续培养.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况;检测细胞克隆形成率及克隆维持时间;免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达.以角质形成细胞作为对照.结果 组织学观察显示,培养24 h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞,且克隆维持时间较长; 免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达.结论 运用Ⅳ型胶原黏附结合ESCM培养可以实现人成体表皮干细胞的快速分离和培养.     

人表皮干细胞的快速分离培养及鉴定

目的探讨人表皮干细胞的体外快速分离和培养方法。方法运用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮干细胞。分离的表皮片经表皮干细胞培养基(ESCM)悬浮,接种于IV型胶原包被的培养板中,37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内静置培养10min,留用贴壁细胞;Ⅳ型胶原黏附、分离并富集后继续培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况;检测细胞克隆形成率及克隆维持时间;免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达。以角质形成细胞作为对照。结果组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞,且克隆维持时间较长;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论运用Ⅳ型胶原黏附结合ESCM培养可以实现人成体表皮干细胞的快速分离和培养。     

昆明种系小鼠胚胎干细胞的分离培养及特性鉴定

目的 提高昆明小鼠胚胎干细胞（ES细胞）建株的成功率。方法 收集小鼠3．5d的囊胚培养,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的ES细胞样集落,经两次亚克隆分离培养ES细胞;进行相差显微镜观察、碱性磷酸酶染色和体内外分化能力鉴定。结果 获得两个稳定ES细胞集落,传至第11代。ES细胞呈集落样生长,碱性磷酸酶染色强阳性,体外分化的细胞沿拟胚体外向性生长,形态多样,在体分化可形成来源于3个胚层的组织。结论 两次亚克地获得的细胞具有ES细胞主要的生物学性状,有助于提高昆明小鼠ES细胞建株的能力。     

成体表皮干细胞的分离培养与鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法。方法:运用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况;检测细胞克隆形成率及克隆维持时间;免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达。以角质形成细胞作为对照。结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞组;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及K19均呈阳性表达。结论:成体表皮干细胞在体外得到成功分离与培养。     

大鼠海马神经干细胞的分离、培养及鉴定

目的：探寻出生后1～3d和成年大鼠海马分离、培养并鉴定神经干细胞(NSC)的可行性。方法向培养基添加碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子及其他生长因子，采用单细胞克隆技术，分离出生后1-3d和成年SD大鼠海马组织并分别无血清培养；以免疫细胞化学方法对原代和传代培养形成的克隆细胞，以及其分化后的细胞进行鉴定。结果上述条件下培养可形成悬浮生长的表达巢蛋白的神经球，且具有连续克隆的能力；分化后可得到具有网状联系的、分别呈神经元特异性烯醇化酶阳性和胶质纤维酸性蛋白阳性的神经元及胶质细胞。结论新生及成年SD大鼠海马存在神经干细胞．     

人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法.方法:中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性黏附、分离和角质细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞.倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,检测细胞克隆形成率,免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照.结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及K19均呈阳性表达.结论:运用Ⅳ型胶原黏附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养.     

人牙髓干细胞的体外分离、培养及鉴定

目的 体外分离、培养及鉴定人牙髓干细胞,构建人牙髓干细胞系.方法 采用组织块酶消化法获取原代细胞,通过有限稀释克隆法纯化细胞;流式细胞仪检测细胞表面标记物;分别进行矿化诱导和成脂诱导,观察诱导后细胞矿化结节和脂滴形成情况.结果 原代培养后5～7d有细胞从组织边缘爬出,有限稀释法获得相对纯化均一的牙髓干细胞;流式细胞仪分析细胞表面抗原,CD29、CD90、CD105、CD146、STRO-1表达阳性,CD34及CD45表达阴性;矿化诱导的细胞茜素红染色镜下见矿化结节形成,成脂诱导的细胞油红O染色镜下见脂滴形成.结论 分离所得的细胞具有人牙髓干细胞的生物学特性,成功构建人牙髓干细胞系.     

胰腺干细胞移植研究进展

糖尿病是严重威胁人类健康的疾病，患者出现胰岛β细胞功能障碍，胰岛素抵抗或分泌减少造成糖代谢紊乱。并继发眼、肾、神经、心血管等脏器损害，估计到2025年患者将超过3亿。细胞替代疗法（即补充β细胞的功能，如胰岛移植）是糖尿病治疗的重要方法，它较目前临床常用的胰岛素治疗具有一定的优势，但也存在难以克服的问题：①供体数量严重不足。需12000个胰岛细胞／kg体质量，即2-4个供体才能满足一个受体的需要；②免疫排斥问题，异体取得的胰岛都存在免疫排斥，而且许多免疫抑制剂本身（如糖皮质激素等）也有致糖尿病作用。     

人精原干细胞分离、培养及鉴定

目的 采用两种酶两步法分离培养人睾丸精原干细胞.方法 先后应用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶消化法,Percoll密度梯度离心,差异贴壁法,进行人精原干细胞的分离及培养;采用细胞免疫荧光法进行人精原干细胞的鉴定;流式细胞法对Oct-4标记阳性的细胞进行筛选,并同时检测所获精原干细胞的纯度,建立精原干细胞和支持细胞共培养体系.结果...     

成人血源性间充质干细胞的分离和鉴定

目的建立一种分离、培养扩增成人血源性间充质干细胞(MSCs)的方法进行鉴定,并与骨髓源性MSCs比较生物学特性。方法30名成年志愿者随机平分为二组,一组直接抽静脉血,并细分为全血细胞法组和外周血密度梯度离心法组,同时抽骨髓为骨髓密度梯度离心法组;另一组为血细胞分离机法组。各组进行细胞存活率、集落形成率、形态学、流式表型分析、胶原染色等研究。结果外周血密度梯度离心法分离成人静脉血后培养,贴壁细胞呈梭形,集落形成率为(0.12±0.08)/106单个核细胞,传代扩增到第5代时每份平均细胞数达51.4674×106,表达CD44、CD54、CD105和CD166,不表达CD14、CD34、CD45和CD31,细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原。全血细胞法和血细胞分离机法获得的细胞不能连续多次传代。结论外周血密度梯度离心法比全血细胞法和血细胞分离机法简单,贴壁细胞培养扩增容易,获得的血源性MSCs与骨髓源性MSCs的生物学特性相似。