实时跟踪荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒DNA的临床意义

目的探讨实时跟踪荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒DNA临床价值。方法对2367例临床血清标本用FQ-PCR方法进行HBV—DNA定量测定，并和ELISA两对半以及ALT结果进行比较。结果HBV—DNA阳性率为60．9％（1442／2367），其中大三阳HBV-DNA检出率为89．04％（845／949）、ALT升高47．84％（454／949）、小三阳HBV—DNA检出率为39．08％（408／1044）、ALT升高33．42％（349／1044）、单HBSAg63．8％（185／290）；单抗HBeHBV—DNA检出率4．54％（1／22）。结论实时跟踪定量检测的荧光定量PCR技术可以检测HBV的真实感染和复制情况是乙型肝炎病毒复制和传染性的直接病原学依据。     

应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法.方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25% Chelex-100,0.5%NP40,TE配制,pH=9.0);56℃孵育30 min;100℃水浴10 min;离心后所得上清即为DNA.电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度.结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1.79±0.03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度.结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR.     

多通道实时荧光定量PCR检测HPVDNA结果分析

目的探讨多通道实时荧光定量PCR检测HPVDNA的效果,并应用于日常检测工作。方法对临床1100例宫颈分泌物标本采用多通道实时荧光定量PCR仪进行8种高危HPVDNA分型及定量检测。8种高危HPV型别为主要高危型HPV16、18、45、31和次要高危型HPV33、52、58、67。结果在1100例标本中排除了14例B球蛋白为阴性的标本,剩余1086例标本总体的内标平均值为3．71×10^6IU／ml。随机重复性试验和对每个型别的各浓度标本进行的重复性试验每次扩增均为阳性,型别符合率为100％。共检测出阳性标本287例,HPV16、HPV18／45、HPV31、次要高危型和合并感染各有46、17、14、146和64例,分别占总阳性标本的16％、6％、5％、51％和22％。所有标本绝对定量值的分布近似于正态分布。结论多通道荧光定量PCR检测HPVDNA灵敏度高、复性好,可用于临床HPV感染的筛查与宫颈病变程度预测以及患者术后疗效观察。     

实时荧光定量PCR 法在检测血浆结核杆菌DNA 的应用

目的:探讨实时荧光定量PCR 法在检测血浆结核杆菌DNA 的应用及价值.方法:以我院确诊为结核病且未经治疗的患者392 例作为实验组,同时选取健康体检人群100 例作为对照组.分别对两组患者取静脉血,并对其血浆中结核分枝杆菌DNA 采用实时荧光定量PCR 法进行检测,同时对实验组患者进行痰涂片检查.结果:对照组患者实时荧光定量PCR 法检测全为阴性;实验组患者采用痰涂片检查,结果显示有80 例为阴性,其实时荧光定量PCR 法检测结果显示,痰涂片阳性的患者全为阳性,其阴性患者中有24 例为阳性,在对阳性患者抗痨治疗后有12 例患者转为阴性.实验组患者MTB DNA 为1.76×109 copies/mL.结论:本实验表明结核患者血浆中存在MTB DNA,采用实时荧光定量PCR 法可有效的对痰涂片阴性以及无痰患者进行诊断,有较好的利益价值.     

应用锁定核酸水解探针实时荧光定量PCR检测烟曲霉

目的 建立检测烟曲霉的锁定核酸(LNA)水解探针实时荧光定量PCR(qPCR)方法.方法 实验菌株来自北京同仁医院临床分离曲霉菌株,均通过形态学和DNA测序方法鉴定到种.实验组:烟曲霉48株;对照组:黄曲霉55株、杂色曲霉16株、构巢曲霉10株、聚多曲霉5株、寄生曲霉1株;l临床标本组:已经纯培养出烟曲霉的冻存临床标本,鼻窦炎鼻窦组织标本20份、肺泡灌洗液1份.提取标本的DNA,LNA水解探针qPCR检测炯曲霉特异性β-微管蛋白基因,评价此方法的分析特异性、扩增效率、线性动态范围和检测限.结果 烟曲霉特异性β-微管蛋白基因LNA水解探针qPCR检测烟曲霉方法的分析特异性为100%,扩增效率为98.2%,线性动态范围6个数量级,检测限2.5pg.结论 烟曲霉特异性β-微管蛋白基因LNA水解探针qPCR法能快速、准确地检测烟曲霉,而且此方法易操作、经济实惠,应用前景广阔.

Abstract：

Objective To evaluate the performance of locked nucleic acid(LNA)probe Real-time polymerase chain reaction(PCR)in the detection of Aspergillus fumigatus(A.fumigatus).Methods All clinically cultured isolates of Aspergillus at our hospital were identified by morphology and DNA sequencing assay.The experimental group consists of A.fumigatus(n=48)while the control group Was made up of A.flavus(n=55),A.versicolor(n=16),A.nidulans(n=10),A.sydowii(n=5)and A.parasiticus (n=1).The clinical samples consisted of A.fumigatus sinusitis tissue(n=20)and bronchoalveolar lavage fluid(n=1).DNA was extracted from all samples.A.fumigatus β-tubulin gene Was targeted with LNA probe Real-time PCR assay.LNA probe Real-time PCR was evaluated with regards to specificity,efficiency,linear dynamic range in PCR amplification and limits of detection.Results All clinical samples were positively amplified.The specificity was 100%and the PCR efficiency 98.2%.Linear dynamic range Was at least six orders of magnitude and the limit of detection 2.5 pg.Conclusion LNA probe Real-time PCR is a promisingly accurate assay of rapidly detecting A.fumigatus practically and cost-efficiently.     

实时荧光PCR技术定量检测乳腺癌患者血浆循环DNA

目的建立一种实时荧光定量PCR方法,并用该方法检测乳腺癌患者血浆循环DNA水平。方法用QIAamp血液DNA抽提试剂盒提取61例乳腺癌患者和25例健康妇女血浆循环DNA,用实时荧光定量PCR技术(SYBR Green I染料法)进行定量,结果用设定临界域值时的循环数的值(Ct值)表示,并对定量结果进行ROC曲线分析。结果:乳腺癌患者Ct值(27.71±1.41)显著低于健康对照(30.37±1.32,P<0.001),说明乳腺癌患者血浆循环DNA水平显著高于健康对照组;ROC曲线下面积为0.921。结论应用实时PCR技术检测乳腺癌患者血浆循环DNA水平有可能成为一种无创性乳腺癌分子诊断方法。     

实时荧光定量PCR法检测肾移植术后BK病毒感染及意义

目的检测肾移植患者术后BK病毒DNA并探讨其临床应用价值。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)对86例同种异体肾移植患者术后血液及尿液标本进行BK病毒DNA检测。结果 86例肾移植患者中,尿BK病毒DNA阳性12例(14.0%),血液BK病毒DNA阳性6例(7.0%)。BK病毒DNA血、尿均为阳性5例患者中有4例经肾脏穿刺病理活检确证为BK病毒相关性肾病(BKVAN)。结论尿液BK病毒检测能够早期发现BK病毒感染,结合血液BK病毒检测为早期诊断、治疗并预防肾移植术后BKVAN提供重要的依据。     

荧光定量PCR检测手足口病患者血浆循环DNA及其临床意义

目的：利用实时荧光定量PCR技术检测手足口病患者血浆循环DNA水平。方法分别收集健康人和手足口病患者的血浆样本,用实时荧光定量PCR方法检测样本中的血浆循环DNA。结果手足口病患者的血浆循环DNA的CT值为（23.58±1.18）,显著低于健康对照组的（35.66±1.32）（P<0.001）。结论实时荧光定量PCR技术检测血浆循环DNA可以作为诊断手足口病的一种方法。     

鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品的构建

目的: 构建检测鼻咽癌患者血浆EB病毒(人疱疹病毒4型)DNA的荧光定量PCR标准品。方法: 用EB病毒基因高度保守序列设计特异的引物和荧光探针,常规PCR法扩增目的片段,将纯化的PCR产物与PMD-18T载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后用PCR初筛和测序分析证实目的片段克隆成功,提取重组质粒DNA,纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定重组质粒拷贝浓度,并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。结果: PCR初筛及测序分析均证实EB病毒DNA重组到PMD-18T载体上。结论: 本试验成功克隆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品。     

实时荧光PCR定量检测丙型肝炎病毒核酸的临床价值

目的探讨实时荧光PCR定量检测丙型肝炎病毒核酸（HCV-RNA）的临床价值。方法采用实时荧光PCR技术对180例可疑丙型肝炎病毒（HCV）感染患者的血清行HCV-RNA定量检测,同时采用酶联免疫法检测抗-HCV含量,酶法检测ALT水平,分析HCV-RNA定量与后两者的相关性。结果180例患者中HCV-RNA阳性率为46．7％,抗-HCV阳性率为49．4％,ALT异常率为46．7％;HCV-RNA阳性患者中抗-HCV阳性率及ALT异常率与HCV-RNA阴性患者差异均有统计学意义（均P〈0．01）;HCV-RNA含量与抗．HCV滴度、ALT异常率及水平之间呈正相关。结论实时荧光PCR定量检测HCV-RNA的临床价值较大,结合抗．HCV及ALT柃测有利于提高丙型肝炎的诊断水平。     

两种HBV—DNA核酸提取法对荧光定量PCR结果的影响

目的比较免核酸提取法与煮沸裂解法对HBV—DNA提取后荧光定量PCR检测结果的影响。方法用两种前处理方法不同的试剂盒检测7．0×102～7．0×107IU／ml的HBV—DNA阳性标准品和84例临床小三阳患者血清,对结果进行重复性、相关性分析。并计算两种方法对低浓度HBV—DNA值的阳性检出率。结果阳性标准品HBV—DNA浓度大于103IU／ml样本的均值两种方法比较,相关性良好（线性相关,r=0．993）,CV比较发现,免核酸提取比煮沸裂解的CV要小。临床小三阳患者84例HBV—DNA浓度在1酽～103IU／ml的标本,免核酸提取法阳性检出率为25％高于煮沸裂解法的11．9％（P=0．015）。结论免核酸提取法操作简单,结果稳定可靠,线性范围宽,有益于乙肝病毒感染窗口期的早期诊断。     

实时荧光定量PCR检测精子线粒体DNA的提取效率

目的：测定宝生物工程有限（大连）公司和上海杰美基因医药科技有限公司两种试剂盒精子线粒体DNA提取的效率,以及核基因组DNA的残留。方法：CASA法计数精子数量,试剂盒提取线粒体DNA,TaqMan法荧光实时定量PCR,利用标准曲线测定线粒体基因Cox-I片段、核基因β-actin片段的拷贝数,计算出精子线粒体DNA的提取效率和核基因组DNA的残留。结果：两种试剂盒精子线粒体DNA提取效率分别是：0.44%±0.03%和6.19%±0.17%。核基因组DNA的残留率分别为4.71%±0.76%和38.1%±1.97%。结论：后者线粒体DNA提取效率高一个数量级,但核基因组DNA的残留率也高一个数量级。     

HCV-RNA实时荧光定量的临床价值

目的评价实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-RT-PCR)检测丙型肝炎病毒(HCV-RNA)在临床中的应用价值。方法用RFQ-RT-PCR检测325例肝炎病人标本,并同时采用ELISA检测抗-HCV,了解样本中HCV-RNA含量与抗-HCV的相关性。结果325份标本中有15例HCV-RNA含量高于1000拷贝/ml,18例抗-HCV阳性。经统计分析,两者有明显的相关性。结论RFQ-RT-PCR技术检测HCV-RNA特异性强,灵敏度高,具有良好的应用价值。     

应用荧光探针定量PCR检测生殖单纯疱疹病毒Ⅱ型的临床应用

目的:探讨荧光探针定量PCR检测生殖单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSVⅡ)在临床上的应用。方法:采用荧光探针定量聚合酶链反应(FQ-PCR)对93例临床诊断为生殖器单纯疱疹病毒感染者检测。结果:检出56例HSVⅡ阳性,阳性率60.22%。结论:FQ-PCR在检测生殖单纯疱疹病毒Ⅱ型的临床应用中具有快捷、特异性强的优点。     

荧光定量PCR检测病毒性心肌炎患者血浆循环DNA及其临床意义

目的:利用实时荧光定量PCR技术来检测病毒性心肌炎患者血浆循环DNA水平。方法:分别收集健康人和病毒性心肌炎患者的血浆样本,用实时荧光定量PCR方法检测样本中的血浆循环DNA。结果:病毒性心肌炎患者的血浆循环DNA的CT值为25.22±1.26,明显低于健康人30.66±1.52,有显著性差异(P<0.01)。结论:实时荧光定量PCR技术检测血浆循环DNA可以成为诊断病毒性心肌炎的一种方法。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测对结核病的诊断价值

目的 探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)(Gene-xpert)检测对结核病的诊断价值.方法 随机选取我中心在2019年4月至2020年2月就诊的结核病患者共100例作为研究对象,将给予涂片抗酸染色法视为对照组,将给予实时荧光定量PCR检测视为研究组,研究观察2组患者的检出率、灵敏度和特异度、实时荧光定量PCR检测...     

实时荧光定量PCR检测丙型肝炎病毒

目的探讨实时荧光定量PCR（FQ—PCR）技术检测丙型肝炎病毒（HCV）RNA载量与抗-HCV及丙氨酸氨基转移酶（ALT）异常的相关性。方法用FQ—PCR检测115份疑似HCV感染的病人血清HCV—RNA，ELISA法检测抗-HCV，全自动生化分析仪测定ALT。结果以80拷贝／ml血清为标准，115份标本中HCV—RNA阳性率为54．8％（63／115）；抗-HCV阳性率为53．9％（62／115）；ALT异常率为40．9％（47/115）。HCV—RNA载量与抗-HCV（＋）例数呈正相关（r=0．986，P〈0．01）。HCV—RNA载量与ALT异常例数（r=0．94，P〈0．01）、含量（r=0．624，P〈0．01）呈正相关。结论HCV—RNA载量升高，抗-HCV阳性率相应增加，ALT高于正常值（40U／L）的异常率和浓度也增高，均呈正相关。FQ—PCR法可作为临床检测丙型肝炎的确诊方法之一。     

实时荧光定量RT-PCR检测肝细胞肝癌中B-myb的表达及其临床意义

目的 建立B-myb mRNA表达量检测的实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)系统,检测肝细胞肝癌(HCC)中B-myb的表达并分析其临床意义.方法 用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测70例HCC患者癌组织、癌旁肝组织及18例正常肝组织中B-myb mRNA的表达情况.结果 B-myb mRNA在肝癌组织(0.0375±0.0168)及癌旁肝组织(0.0353±0.0128)中的表达水平明显高于在正常肝组织(0.0265±0.0099)中的表达水平(P＜0.05),而在肝癌组织及癌旁肝组织中的表达水平差异无统计学意义(P＞0.05).B-myb在人肝癌组织中的表达与临床分期、肝外转移及术后复发明显有关,而与门静脉癌栓、肿瘤个数、肿瘤直径、血清AFP水平及分化程度无明显关系.结论 该方法克服了传统PCR只能定性检测而不能定量检测的缺点,为研究B-myb在HCC中的表达提供了定量方法.B-myb可能与肝癌的发生、发展有关.     

实时荧光定量PCR与酶联定量PCR技术在 HBV-DNA载量检测中的比较研究

目的:比较实时荧光定量PCR(RQ-PCR)与酶联定量PCR(ELQ-PCR)技术在检测HBV感染血清HBV-DNA载量的灵敏度,精确性.为乙型肝炎临床抗病毒治疗和评价药物疗效提供可靠的依据.方法:应用RQ-PCR方法检测212例(4组)HBV感染者血清,ELQ-PCR方法检测228例(4组)HBV感染者血清.结果:RQ-PCR和ELQ-PCR方法检测HBV-DNA,其阳性检出率分别为HBsAg,HBeAg,HBcAb-IgG( )组100%和82.61%;HBsAg,HBeAb,HBcAb-IgG( )组90.63%和73.21%;HBsAg,HBcIgG,HBcAb-IgM( )组80.00%和57.58%;HBsAg,HB-cAb-IgG( )组70.15%和51.43%.HBV-DNA载量的阳性检出率,经统计学处理有显著性差异(P＜0.05).结论:RQ-CPR方法检测HBV-DNA载量在实时监测,节时快速,高灵敏,高精确度等方面都更优于ELQ-PCR.     

实时荧光定量PCR技术应用于核酸定量检测的研究进展及展望

聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物学等领域得到广泛的应用。近年来出现的核酸定量PCR技术尤其是实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RQ--PCR）技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，本文就此技术的研究进展及其在核酸定量检测中的应用做一综述。