SOCS低甲基化在儿童过敏性紫癜Th17/Treg细胞失衡中的作用研究

目的 通过研究细胞因子信号转导抑制因子（SOCS）低甲基化与过敏性紫癜（HSP）患儿Th17/Treg细胞失衡的关系,探讨HSP的免疫发病机制。方法 选取2014年5月至2015年1月32例急性期HSP住院患儿为研究对象,另选取行健康体检的28例儿童作为健康对照组。采用ELISA法检测血浆IL-6水平;流式细胞术检测外周血CD4⁺IL-17A⁺T细胞（Th17细胞）比例、CD4⁺CD25⁺调节性T细胞（Treg）比例和CD4⁺T细胞磷酸化STAT3（pSTAT3）蛋白平均荧光强度（MFI）;实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测CD4⁺T细胞SOCS1、SOCS3基因mRNA表达;高分辨率熔解曲线（HRM）分析法检测外周血单个核细胞SOCS1基因外显子2、SOCS3基因5'端非翻译区（5'-UTR）可能的STAT3结合位点CpG岛甲基化水平。结果 与健康对照组比较,HSP组血浆IL-6浓度、CD4⁺T细胞pSTAT3的MFI显著增加;HSP组Th17细胞比例显著上调,Treg细胞比例显著下调（P < 0.05）。HSP组患儿急性期外周血单个核细胞SOCS1 mRNA和SOCS3 mRNA水平均显著高于健康对照组（P < 0.05）;HSP组SOCS1 mRNA及SOCS3 mRNA表达均与Th17/Treg比值呈负相关（P < 0.05）。HSP组患儿急性期SOCS1基因外显子2、SOCS3基因5'-UTR区可能的STAT结合位点CpG岛呈低甲基化,而健康对照组呈完全去甲基化状态。结论 SOCS1、SOCS3基因低甲基化所致其相对表达不足可能是HSP患儿Th17/Treg失衡的因素之一。     

哮喘儿童细胞因子信号转导抑制因子mRNA表达与Th1/Th2的关系

目的：细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)对JAK-STAT途径的细胞因子如白介素、干扰素等的调节起重要作用,目前SOCS与哮喘的关系仍在研究中。本研究观察SOCS1和SOCS3 mRNA在哮喘儿童外周血单个核细胞（PBMC）中的表达水平与CD4+ T细胞IFN-γ/IL-4平衡及特异性IgE（sIgE）的关系。方法：采集44例4~14岁过敏性哮喘患儿及30例健康儿童PBMC,分别用流式细胞仪分析CD4+ T细胞IFN-γ/IL-4比值,另提取总RNA,采用SYBR Green I逆转录荧光定量PCR的方法检测每组SOCS1和SOCS3 mRNA的表达。结果：哮喘组患儿外周血IFN-γ阳性的CD4+T细胞百分比［（15.7±2.0）%］及IFN-γ/IL-4比值（3.4±1.5）均低于对照组［分别为（19.1±2.7)%、4.8±2.9］;而SOCS1 mRNA（⊿Ct值11.1±1.9）表达显著高于对照组（⊿Ct值12.6±2.8）。两组儿童SOCS1 mRNA表达均与外周血分泌IFN-γ的CD4+ T细胞百分比呈负相关（P<0.05）。SOCS1和SOCS3与sIgE均无相关性。结论：SOCS1 mRNA在哮喘组患儿外周血中高表达,并与Th2占优势的免疫失衡有关。     

不同喂养方式的足月儿3月龄时免疫功能特点分析的前瞻性队列研究

目的 探究足月健康新生儿生后3月龄时的免疫功能特点,并分析其与喂养方式及性别的关系。 方法 前瞻性选取北京及呼和浩特4家医院出生的足月健康新生儿84例为研究对象,生后4月龄内喂养方式不变,根据喂养方式分为母乳喂养组（26例）和奶粉喂养组（58例）。于生后3月龄时采集两组婴儿外周静脉血标本,检测细胞免疫、体液免疫功能及血常规,比较上述实验室指标在不同喂养方式、性别的婴儿中有无显著性差异。 结果 母乳喂养组T细胞第二信号受体CD28表达比例、免疫球蛋白M、中性粒细胞比例及计数均显著低于奶粉喂养组（P<0.05）,CD8⁺T细胞表面激活标记物HLA-DR的计数及比例、淋巴细胞比例显著高于奶粉喂养组（P<0.05）。男婴白细胞计数低于女婴,嗜酸性粒细胞比例高于女婴（P<0.05）。 结论 性别对3月龄足月婴儿淋巴细胞亚群比例无显著影响;不同喂养方式可改变其CD28⁺T细胞（淋巴细胞功能亚群）和HLA-DR⁺T细胞（淋巴细胞激活亚群）表达比例,提示喂养方式对3月龄足月婴儿免疫功能发育过程存在一定影响。     

Th17/Treg细胞比例失衡在儿童原发性免疫性血小板减少症中的意义

目的 探讨Th17/Treg 细胞比例失衡在儿童原发性免疫性血小板减少症(ITP)发病及治疗中的意义。方法 选取2015 年5 月至2015 年8 月确诊为ITP 的32 例患儿作为ITP 组,同期选取22 例健康儿童作为健康对照组,采用流式细胞术分别检测初诊ITP 患儿、丙种球蛋白治疗后的ITP 患儿和健康对照组儿童外周血Th17、Treg 细胞的比例。结果 ITP 患儿治疗前外周血Th17 占CD4⁺T 细胞的比例、Th17/Treg 细胞比值均显著高于治疗后及健康对照组儿童(P<0.05),治疗前Treg 细胞占CD4⁺T 细胞的比例显著低于治疗后及健康对照组儿童(P<0.05);32 例ITP 患儿经治疗后,20 例完全反应,4 例有效,8 例无效,完全反应患儿外周血Th17细胞占CD4⁺T 细胞比例、Th17/Treg 细胞比值显著低于无效患儿(P<0.05)。结论 儿童ITP 中存在Th17/Treg细胞比例失衡,丙种球蛋白可通过调节Th17/Treg 细胞比例变化进而改变患儿细胞免疫功能,治疗过程中检测该比值变化可能对疾病的疗效有一定的预测作用。     

儿童急性ITP Th1/Th2细胞功能状态初步研究

目的探讨急性儿童特发性血小板减少性紫癜(ITP)Th1/Th2细胞功能状态及其在ITP免疫发病机制中的作用。方法采用流式细胞术胞内标记法检测外周血CD4+T细胞IL-4和IFN-γ阳性表达率;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及荧光定量PCR检测外周血CD4+T细胞中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、T-bet、GATA-3、SOCS-1、SOCS-3和TIM-3等Th相关的细胞因子及转录因子mRNA表达。结果①急性ITP患儿Th1细胞阳性率明显低于正常同年龄对照组(3.36%±1.25%vs12.71%±2.29%,P<0.01),Th2细胞比例明显升高(2.63%±1.35%vs0.46%±0.17%,P<0.01),Th1/Th2比值显著降低(1.45±0.57vs34.13±5.76,P<0.01);②急性ITP患儿GATA-3、SOCS-3mRNA表达明显增高,T-bet及SOCS-5表达与同年龄对照组无显著差异(P>0.05),TIM-3表达明显增高(P<0.01);③急性ITP患儿CD4+T细胞高表达Th2类细胞因子IL-4、IL-5、IL-13(P<0.01),Th1类细胞因子IFN-γ与正常对照比较无显著性差异(P>0.05)。结论急性ITP患儿Th2细胞过度活化,可能与ITP免疫功能紊乱有关。     

重症肺炎支原体肺炎患儿肺泡灌洗液中Th1/Th2细胞免疫应答状况的研究

目的：检测重症肺炎支原体肺炎（MPP）患儿肺泡灌洗液(BALF)和血清中干扰素-γ（IFN-γ)、白细胞介素-4（IL-4）,研究Th1/Th2细胞免疫应答的状况及意义,并评价BALF中细胞因子检测在MPP诊治中的临床价值。方法：采用双抗体夹心ELISA检测25例重症MPP患儿BALF和血清中IL-4及IFN-γ的浓度,并设支气管异物组（25例）和MPP轻症组（25例）作为对照。结果：重症MPP患儿BALF中IL-4和IFN-γ水平及IL-4/IFN-γ比值明显高于支气管异物对照组,差异有统计学意义(P<0.01或0.05)。重症MPP患儿血清中IL-4水平及IL-4/IFN-γ比值明显高于支气管异物组和MPP轻症组,差异有统计学意义(P<0.01或0.05)。重症MPP患儿BALF中IL-4水平及IL-4/IFN-γ比值高于血清标本,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：重症MPP患儿存在Th1/Th2失衡, 以Th2反应占优势;BALF中细胞因子的检测较之血清更为敏感,在MPP诊治中具有较高价值。     

缺锌对哮喘大鼠Th1/Th2型细胞因子的影响

目的 探讨缺锌对哮喘大鼠Th1／Th2型细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）的影响。方法 建立缺锌及哮喘模型，SD大鼠32只，体质量45～65g，按体质量随机分为4组，每组8只。A组为缺锌饲料＋卵清蛋白（OVA）激发组；B组为正常锌饲料＋OVA激发组；C组为正常锌饲料配对饲养＋OVA激发组；D组为正常锌饲料＋生理盐水激发组。利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测肺组织IFN-γ和IL-4水平；逆转录PCR（RT-PCR）检测肺组织IFN-γ、IL-4mRNA表达。结果 与D组比较，A～C组大鼠肺组织匀浆IFN-γ水平、IFN-γ mRNA表达均明显减少（P均〈0．05），而IL-4水平、IL-4mRNA表达均明显增加（P均〈0．05）。与B组比较，A组大鼠IFN-γ水平、IFN-γmRNA明显减少（P均〈0．05）；IL-4水平无显著性差异（P〉0．05），IFN-γ／IL-4比例明显减少（P〈0．05）。B与C组比较检测结果均无显著性差异。结论 哮喘大鼠缺锌时其IFN-γ明显减少，而IL-4不受影响，Th1／Th2细胞比例严重失衡，是缺锌时呼吸道炎症反应增加原因之一。     

急性期川崎病γ干扰素组蛋白乙酰化改变及意义初探

目的探讨急性期川崎病(KD)患儿IFN-γ组蛋白乙酰化改变及其在KD免疫发病机制中的作用。方法以2015年2月至2016年6月深圳市儿童医院诊断并住院治疗的KD患儿为KD组,经IVIG治疗后为KD-IVIG组,KD组依冠状动脉有无损伤分为冠状动脉损伤(KD-CAL+)亚组和无冠状动脉损伤(KD-CAL-)亚组,于IVIG治疗前、后取血备检;同期体检的健康儿童为对照组。采用染色质免疫共沉淀法检测外周血CD4+T细胞IFN-γ组蛋白H3乙酰化水平及组蛋白乙酰化酶p300和去乙酰化酶HDAC1/2结合水平;流式细胞术检测外周血CD4+IFN-γ+细胞(Th1)比例及IFN-γ、p STAT4、p STAT5和T-bet蛋白表达水平;实时荧光定量PCR检测CD4+T细胞IFN-γ、IL-2Rα/β、IL-12Rβ1/2、IL-18Rα/β和ITLR4m RNA表达;ELISA检测外周血浆中IL-12、IL-2和IL-18浓度。结果 1KD患儿38例(男20例),年龄1~5.2岁;KD-CAL+亚组16例,KD-CAL-亚组22例。对照组32例(男17例),年龄1.2~4.9岁。KD组和对照组年龄、性别差异无统计学意义。2急性期KD患儿Th1细胞比例、IFN-γm RNA和蛋白表达及其组蛋白乙酰化水平显著高于对照组(P0.05),且KDCAL+亚组高于KD-CAL-亚组(P0.05),经IVIG治疗后明显恢复(P0.05)。3急性期KD患儿CD4+T细胞IFN-γ组蛋白乙酰化酶p300结合水平显著增加(P0.05),HDAC1/2结合水平明显降低(P0.05),p300/HDAC1/2明显高于对照组且与IFN-γ组蛋白H3乙酰化水平呈正相关(r=0.52;P0.05),经IVIG治疗后均有所恢复(P0.05)。其中KD-CAL+亚组p300结合水平及p300/HDAC1/2比值均高于KD-CAL-亚组(P0.05),而HDAC1/2结合水平则低于后者(P0.05)。4急性期KD患儿血浆IL-2、IL-12和IL-18浓度显著增高(P0.05),CD4+T细胞表面受体IL-2Rα/β、IL-12Rβ1/2、IL-18Rα/β和TLR4及其下游信号分子p STAT5、p STAT4、T-bet和My D88表达明显上调(P0.05),且KD-CAL+亚组前述各项均高于KDCAL-亚组(P0.05),经IVIG治疗后均有不同程度恢复(P0.05)。结论 IFN-γ组蛋白过度乙酰化可能是导致急性期KD患儿免疫功能紊乱的重要因素之一。     

Th17细胞研究进展

Th17细胞是一类新型CD4+T细胞,它与Th1、Th2、调节性T细胞一起构成了CD4+T细胞的4个主要亚群.Th17细胞的分化过程需要IL-6和转化生长因子-β、转录因子孤独核受体γt及信号传导和转录激活子3等参与,这一分化过程在细胞和分子水平都受到精细的调节.Th17细胞分泌IL-17、IL-22、IL-6等多种细...     

Th17细胞与CD4~+CD25~+调节性T细胞在儿童过敏性紫癜发病机制中的作用

目的 探讨Th17细胞与CD4+CD25+调节性T细胞在儿童过敏性紫癜(HSP)免疫发病机制中的作用.方法 过敏性紫癜急性期患儿48例,采用流式细胞术检测外周血CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)的比例,采用荧光定量PCR(real-time PCR)检测CD4+ T细胞IL-17A、IL-17F、转录因子ROR-γt、Foxp3及细胞因子IL-6、TGF-β等mRNA表达;同期40例同龄健康儿童作为对照.结果 过敏性紫癜急性期患儿CD4+T细胞高表达IL-17A及IL-17F(P<0.01).Th17细胞转录因子ROR-γt及前炎症细胞因子IL-6 mRNA表达明显增高(P<0.01).CD4+CD25+调节性T细胞比例明显低于正常对照组(P<0.01),其转录因子Foxp3表达亦明显降低(P<0.01).结论 Th17等促炎性T细胞高表达和CD4+CD25+调节性T细胞数量减少导致的免疫抑制效应不足,是导致过敏性紫癜免疫失衡的重要原因,IL-6高表达与此密切相关.     

尘螨变应性哮喘患儿外周血T淋巴细胞中协同刺激分子和细胞因子的异常表达及其意义

目的分析变应原刺激前后变应性哮喘患儿外周血T淋巴细胞表面协同刺激分子及胞内细胞因子表达的变化,探讨CD28家族不同协同刺激信号在变应性哮喘免疫病理机制中的作用。方法选取尘螨变应性哮喘患儿(哮喘组)和健康儿童(健康对照组)各30例,密度梯度离心法分离其外周血单个核细胞,应用免疫荧光标记和流式细胞术检测尘螨刺激前后体外培养的CD4+T淋巴细胞表面协同刺激分子CD28、可诱导共刺激分子(ICOS)和细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的表达,运用细胞内染色技术检测CD4+T淋巴细胞内细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、IL-4和IL-13的表达。并运用统计学方法比较哮喘组和健康对照组之间的差异。结果哮喘组患儿外周血CD4+T淋巴细胞表面CD28和ICOS的表达与健康对照组比较差异均无统计学意义(Pa>0.05),而CTLA-4的表达显著降低(P<0.01);细胞内IFN-γ表达水平显著升高(P<0.000 1),而IL-4和IL-13表达水平无明显变化(Pa>0.05)。经尘螨刺激后,体外培养的哮喘患儿外周血CD4+T淋巴细胞表面ICOS的表达较健康对照组儿童显著上调(P<0.000 1),CD28和CTLA-4的表达则无明显变化(Pa>0.05);细胞内细胞因子IL-4和IL-13的表达显著上调(Pa<0.000 1),而IFN-γ的表达则无明显差异(P>0.05)。结论变应性哮喘患儿外周血存在组成性的CTLA-4的表达下调和细胞因子IFN-γ的表达上调,介导Th1型细胞的异常活化;而变应原尘螨的刺激又介导了ICOS依赖的Th2型细胞的分化,导致Th1/Th2失衡。     

调节性T细胞在小鼠巨细胞病毒感染胚胎成纤维细胞机制中的免疫调控作用

目的 体外研究调节性T细胞（Treg）在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）感染小鼠巨细胞病毒（MCMV）机制中的免疫调节作用。方法 采用尼龙毛柱和MACS Treg磁珠法获得纯化的Treg和去除Treg的T细胞（TdepTreg），建立TdepTreg和添加Treg的T细胞与感染MCMV的MEF（MEFMCMV）体外共培养细胞模型。用蚀斑法检测共培养细胞上清中感染性病毒量；流式细胞术检测共培养体系中Tc1(CD3+CD8+IFN-γ+)，Tc2（CD3+CD8+IL4+），Th1（CD3+CD8-IFN-γ+），Th2（CD3+CD8-IL-4+）细胞比率变化；双抗体夹心ELISA法检测共培养细胞上清中转化生长因子-β（TGF-β）和IL-10蛋白表达水平。结果 TdepTreg与MEFMCMV共培养3 d后上清中感染性病毒量较感染对照组显著降低，同时效应性T细胞各亚群比率较非感染对照组显著增加。向TdepTreg-MEFMCMV体系中添加Treg可增加共培养体系中感染性病毒量，同时Tc1、Tc2和Th1细胞比率显著减少，且均与Treg比率存在剂量相关性；而Th2比率仅在Treg比率增至20%时显著低于感染对照组。添加Treg的共培养体系中IL-10和TGF-β蛋白表达水平随Treg比率增加而增高，与Treg存在正性相关。结论 Treg可通过IL-10、TGF-β等途径抑制效应性T细胞的免疫保护作用，并且由于Treg抑制作用的不均衡性，导致Th1/Th2和Tc1/Tc2平衡失调，创造了一个利于CMV增殖的免疫环境。     

短发夹RNA沉默Tim3分子表达对哮喘小鼠外周血Th1和Th17细胞的影响

目的：建立小鼠支气管哮喘模型,采用T 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（Tim-3）特异短发夹RNA（shRNA）沉默外周血单个核细胞（PBMCs）中Tim-3的表达,探讨Tim-3对辅助性T细胞1 (Th1)和Th17细胞分化的影响。方法：用卵白蛋白(OVA)致敏并激发建立哮喘小鼠模型,分离哮喘小鼠PBMCs,用 Tim-3特异的shRNA 片段沉默哮喘小鼠PBMCs中高表达的Tim-3 基因。Real-time PCR 和 Western blot 检测 Tim-3 的表达,流式细胞分析技术（FACS）检测Th1和Th17的比例;ELISA 检测细胞培养上清液中干扰素 γ（IFN-γ）,白介素-4（IL-4）,和 白介素-17（IL-17）的水平。结果：哮喘组小鼠PBMCs中Tim-3 mRNA表达明显升高; 使用特异Tim-3 shRNA沉默哮喘小鼠PBMCs后,沉默组PBMCs中Th1细胞比例显著升高,Th17细胞比例显著下降,与阴性对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）;沉默组PBMCs培养上清液中IFN-γ明显升高,IL-17明显降低,与阴性对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）, IL- 4水平无明显变化。结论：特异Tim-3 shRNA有效地沉默了Tim-3的表达,Tim-3表达的改变影响了T 细胞的分化。     

Th17细胞与疾病

Th17细胞是一类新型CD4+T细胞,与Th1、Th2、调节性T细胞一起构成了CD4+T细胞的4个主要亚群.IL-17是Thl7细胞最主要的分泌产物,在自身免疫性疾病、某些感染性疾病以及肿瘤中起到重要的调节作用.因此,Th17细胞及其相关因子可能为此类疾病的治疗提供新的靶点和途径.     

Responses of CD4(+) CD25(+) Foxp3(+) and IL-10-secreting type I T regulatory cells to cluster-specific immunotherapy for allergic rhinitis in children

We investigated the effects of cluster specific immunotherapy (SIT) with Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) on CD4(+) CD25(+) Foxp3(+) Treg cells and IL-10-secreting type I T regulatory (Tr1) cells in Der p-sensitized children with allergic rhinitis (AR). We performed a prospective randomized study involving 46 children (aged 8-13 yr), of whom 25 children received Der p-SIT + pharmacotherapy and 21 received only pharmacotherapy, over a period of 1 yr. Prior to and at end of treatment, CD4(+) CD25(+) Foxp3(+) Treg cells and allergen-specific IL-10(+) IL-4(-) , IFN-γ(+) IL-4(-) , and IL-4(+) IFN-γ-CD4(+) T cells were measured by flow cytometry. Similarly, IL-4, IFN-γ, and IL-10 in supernatants from allergen-stimulated peripheral blood mononuclear cell (PBMC) cultures were measured by ELISA, and the suppressive effect of CD4(+) CD25(high) T cells on cell proliferation and cytokine release was estimated from both groups. Allergen-specific serum IgE and IgG4 were also assessed at the beginning and end of treatment by RAST and ELISA, respectively. The levels of allergen-specific Tr1 cells, IgG4, and allergen-induced IL-10 synthesis from PBMC cultures were significantly increased after SIT for 1 yr compared with baseline levels (p < 0.001 for all), with significant correlation between increased levels of Tr1 cells and improvements in nasal symptoms (r = 0.48, p < 0.05). In contrast, the levels of CD4(+) CD25(+) Foxp3(+) T cells, allergen-specific Th1 and Th2 cells, the production of IL-4 and IFN-γ, and the function of CD4(+) CD25(high) T cells were not altered in either group at the end of treatment. These data suggest that the up-regulation of Tr1 cells may play an important role in SIT and be a useful marker of successful SIT in AR patients.