蛋白激酶SGK2α在大肠杆菌中的表达纯化及抗体制备

目的 该研究通过SGKα基因的克隆、原核蛋白表达以及纯化,制备抗SGK2α抗体,为进一步研究SGK2α蛋白的生物学功能奠定基础.方法 利用原核表达载体PGEX-4T-3构建重组质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白:以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗SGK2α多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价,免疫印迹法检测抗体的特异性.结果 构建了PGEX-4T-3-SGK2α原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得GST-SGK2α融合蛋白,蛋白纯度在90%以上;利用GST-SGK2α融合蛋白制备多克隆抗体,抗体效价阳性且具有较强的特异性.结论 利用原核表达的GST-SGK2α融合蛋白成功地制备了抗SGK2α多克隆抗体,可用于免疫组织化学和免疫印迹检测以及功能研究.     

BC022687融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化、抗体制备及特异性鉴定

目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定。方法:采用RT-PCR法从18-20g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET-28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性。结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0kU的外源蛋白。Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好。结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础。     

分枝杆菌Ag85B多克隆抗体的研制

目的在原核系统中表达并纯化GST-Ag85B融合蛋白,制备兔抗Ag85B多克隆抗体.方法首先构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒pGEX-Ag85B,将此质粒转入大肠杆菌,诱导表达融合蛋白并加以纯化;然后将纯化的蛋白免疫家兔,提取家兔的抗血清,纯化制备多克隆抗体并进行鉴定.结果成功构建了原核表达质粒pGEX-Ag85B,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并成功纯化,用纯化的GST-Ag85B融合蛋白成功制备了兔抗Ag85多克隆抗体.结论制备的多克隆抗体为进一步的研究奠定了基础.     

人巨细胞病毒US31蛋白特异性抗体的制备及鉴定

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）US31蛋白及其多克隆抗体的制备及鉴定方法。方法：HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至pET21a（+）原核表达载体,构建pET21a（+）/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经Ni-NTA亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的IgG抗体,效价为1:49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论：成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。     

柯萨奇-腺病毒受体基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的利用原核基因工程克隆表达柯萨奇-腺病毒受体(CAR)胞外段,并制备多克隆抗体。方法从HeLa细胞中抽提总RNA,通过RT-PCR获得编码CAR胞外段的cDNA,与pQE31质粒连接,构建表达型重组质粒,测序证实后诱导表达,经Ni-NTA柱亲和纯化后,免疫新西兰兔,ELISA检测抗血清滴度。结果重组质粒转化的大肠杆菌M15经IPTG诱导表达及亲和纯化后得到滴度较高的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot显示其分子量约为26 kd,具有特异的抗原性,主要以包涵体形式存在于菌体中。纯化的融合蛋白免疫新西兰兔后产生的抗体,经ELISA检测抗体滴度>1:32 000。结论CAR胞外段基因的克隆表达和多克隆抗体的制备,为进一步研究该受体在以腺病毒载体为基础的基因治疗中的作用及柯萨奇病毒的致病机制奠定了基础。     

柯萨奇-腺病毒受体基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的利用原核基因工程克隆表达柯萨奇-腺病毒受体(CAR)胞外段,并制备多克隆抗体.方法从HeLa细胞中抽提总RNA,通过RT-PCR获得编码CAR胞外段的cDNA,与pQE31质粒连接,构建表达型重组质粒,测序证实后诱导表达,经NiNTA柱亲和纯化后,免疫新西兰兔,ELISA检测抗血清滴度.结果重组质粒转化的大肠杆菌M15经IPTG诱导表达及亲和纯化后得到滴度较高的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot显示其分子量约为26 kd,具有特异的抗原性,主要以包涵体形式存在于菌体中.纯化的融合蛋白免疫新西兰兔后产生的抗体,经ELISA检测抗体滴度＞l:32 000.结论CAR胞外段基因的克隆表达和多克隆抗体的制备,为进一步研究该受体在以腺病毒载体为基础的基因治疗中的作用及柯萨奇病毒的致病机制奠定了基础.     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的 分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体.方法 应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度;用Western-blot、ELISA法检测纯化后IsG性质及效价.结果 重组NS1蛋白获得分泌表达,其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1:6000.结论 重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础.     

人sCR1克隆、真核和原核表达纯化及其多克隆抗体制备

的：原核表达人sCR1分子胞外区及其多克隆抗体制备。方法：提取人总RNA进行RT—PCR扩增合成cDNA,以cDNA为模板,构建重组表达质粒pET28a—sCR1。转化大肠杆菌中,用IPTG诱导表达重组人sCR1融合蛋白,将其作为免疫原制备兔多抗。采用ELISA法检测抗体效价,经免疫亲和层析法纯化后,进行SDS—PAGE鉴定分析。结果：在原核细胞巾高效表达人sCR1融合蛋白,经纯化复性后作为免疫原,免疫家兔,获得了高效价及特异性的兔抗人sCR1多克隆抗体,可特异地识别人sCR1蛋白。结论：纯化复性后的sCRI融合蛋白作为抗原免疫家兔,有较好的抗原性和免疫原性,成功地制备出兔抗人sCR1多克隆抗体,为进一步大量表达纯化人sCR1融合蛋白与临床免疫学检测方法的建立,也为深入研究sCR1生物学功能奠定了基础。     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.     

人精子蛋白FSCB的表达、纯化和多克隆抗体制备

目的：构建表达重组人精子蛋白FSCB的重组质粒,获得其纯化重组蛋白并制备其多克隆抗体.方法：分别成功构建了表达人精子全长FSCB蛋白和截短FSCB（FSCBt）蛋白的重组菌株BL21,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法和分子筛层析法纯化目的蛋白FSCBt,免疫接种雌性家兔制备多克隆抗体.结果：重组菌成功诱导表达了重组蛋白FSCB和FSCBt,相对表观分子量分别为230000和30000,重组蛋白FSCBt经纯化后纯度达到95%,制备的多克隆抗体效价达到1∶105,Western Blot显示多克隆抗体与重组蛋白FSCB和FSCBt均具有良好的反应性.结论：人精子蛋白FSCB在重组菌株中得到表达,成功制备高效价的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白在人体组织中的表达、分布以及生物学功能奠定了实验基础.     

增强型绿色荧光蛋白原核表达纯化与多克隆抗体的制备

目的：进行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的克隆、原核表达和纯化以及多克隆抗体的制备，为以后纯化EGFP融合蛋白奠定基础。方法：构建pGEX-4T3—EGFP重组质粒，在大肠杆菌BL21中进行原核表达，用亲和层析法纯化GST—EGFP，免疫BAB／c小鼠制备EGFP多克隆抗体。结果：①目的蛋白GST—EGFP表达量为8g／L。②获得纯抗体溶液5m1。浓度为0．4g／L。③EGFP抗体在1：100000稀释度时，Western blot检测条带清晰，背景干净。结论：通过优化诱导条件，利用大肠杆菌可低成本获得大量GST—EGFP。直接使用GST—EGFP融合蛋白免疫BAB／c小鼠，可在较短时间内大量制备EGFP多克隆抗体。     

TDG蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的:表达纯化胸腺嘧啶糖苷酶(TDG)蛋白并制备TDG多克隆抗体.方法:PCR扩增小鼠TDG(mTDG)的基因片段并插入pET28a(+)原核表达载体,表达并纯化His-mTDG融合蛋白.用纯化的His-mTDG蛋白免疫兔子产生抗血清,进一步亲和纯化抗血清制备抗TDG的多克隆抗体,并检测分析制备的抗体在Western blotting和免疫荧光分析中的应用.结果:在低温(20 ℃)和低IPTG浓度(0.2 mmol·L-1)时,His-mTDG融合蛋白大部分在可溶上清部分,用亲和层析法分离纯化了His-mTDG蛋白,并用纯化的蛋白制备了兔抗TDG抗体,结果显示制备的抗体能够特异性地在免疫分析中使用.结论:本研究纯化了条带单一的并且具有生物学活性的TDG融合蛋白,制备了具有良好特异性的兔抗TDG抗体,为进一步研究TDG的性质、结构和功能奠定了基础.     

土曲霉洛伐他汀合成调控基因lovE的克隆与表达

目的 克隆表达土曲霉洛伐他汀合成调控基因lovE,为研究lovE蛋白的生物学功能奠定基础.方法 利用原核表达载体pET21b(+)构建lovE原核表达质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白.结果 构建了pET-lovE原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得6×His-lovE融合蛋白,蛋白纯度...     

结核分枝杆菌重组蛋白CFP-10-ESAT-6-PPE68的表达、纯化与多克隆抗体的制备

目的构建重组质粒pET32a(+)-cfp-10-esat-6-ppe68,得到重组结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白及兔抗结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白的多克隆抗体,为下一步应用于临床结核病的检测奠定基础。方法将结核分枝杆菌cfp-10-esat-6-ppe68基因转入质粒pET32a,将经PCR、酶切、序列测定鉴定为阳性的质粒转入大肠杆菌DE3,IPTG诱导表达重组蛋白,经亲和层析法纯化重组蛋白后用凝血酶切除载体蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体并进行纯化。结果成功构建重组质粒表达体系pET32a(+)-cfp-10-esat-6-ppe68,制得去除载体蛋白的高纯度重组蛋白CFP-10-ESAT-6-PPE68,并成功得到高纯度抗结核分枝杆菌CFP-10-ESAT-6-PPE68蛋白的抗体。结论成功表达结核重组蛋白并制得高纯度多克隆抗体。     

人S-腺苷蛋氨酸脱羧酶α亚基的克隆、表达与纯化

目的：构建人S 腺苷蛋氨酸脱羧酶(SAMDC)的α亚基的原核表达载体，诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化表达的重组蛋白。方法：从大肠癌细胞中提取总RNA，RT PCR方法扩增人SAMDCα亚基的cDNA片段801?bp，经TA克隆及亚克隆方法构建原核表达载体pTriEx 4 SAMDC α。将重组表达质粒转化入E.coli JM109(DE3)中，经IPTG诱导表达，SDS PAGE电泳和Western blot鉴定表达蛋白，并通过6×His•Tag，利用亲和层析法纯化表达的融合蛋白。结果：酶切鉴定和DNA测序显示，人SAMDC α亚基的cDNA片段成功插入表达载体pTriEx 4且方向正确，SDS PAGE电泳显示表达出32kD的外源蛋白。Western blot检测结果显示，表达出的蛋白为6×His•Tag的融合蛋白，且Ni NTA亲和层析法纯化了该重组蛋白。结论：成功构建、表达且纯化了重组SAMDC α亚基，为制备抗SAMDC抗体、研究SAMDC基因与结直肠肿瘤的关系提供了必要的工具。     

人精脒/精胺N1乙酰基转移酶基因的克隆、表达和纯化

目的构建人精脒/精胺N1乙酰基转移酶基因的原核表达载体，诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的重组蛋白。方法从大肠癌组织中提取总RNA，采用RT-PCR法扩增人SSAT基因的cDNA片段，经TA克隆及亚克隆方法构建原核表达载体pTriEx-4-SSAT。将重组表达质粒转化入E.coli JM109 (DE3)中，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定表达蛋白，并通过6His-tag，利用亲和层析法纯化表达的融合蛋白。结果酶切鉴定和DNA测序显示，人SSAT的cDNA片段成功插入表达载体pTriEx-4中，而且方向正确，SDS-PAGE电泳显示表达出20?kD的外源蛋白。Western blot检测结果显示，表达出的蛋白为6His-tag的融合蛋白，而且用Ni-NTA亲和层析法纯化了该重组蛋白。结论成功构建、表达和纯化了重组SSAT蛋白，为制备其抗体及研究该基因与结直肠肿瘤的关系提供了有力的工具。     

MAGE-3基因的表达、纯化及其抗血清的制备

[目的]构建MAGE-3的原核表达质粒,表达、纯化蛋白并制备多克隆抗体.[方法]利用RTPCR方法扩增MAGE-3基因片段,连接入原核表达载体pGEX-4T-1,构建MAGE-3的原核表达质粒pGEXMAGEE-3并测序.将该质粒转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,并通过谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统进行分离纯化.用纯化的融合蛋白GST-MAGE-3免疫新西兰大白兔,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western-blot检测抗体活性.[结果]构建了pGEX-MAGE-3原核表达质粒,含有该质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后表达一相对分子质量约为72×103的蛋白,经GST融合蛋白纯化系统纯化,得到了MAGE-3的重组蛋白GST-MAGE-3.制备了兔抗GST-MAGE-3抗体.Western blot证实该抗体可与GST-MAGE-3蛋白特异性结合.[结论]获得了肿瘤抗原MAGE-3的纯化重组蛋白及其特异的多克隆抗体、为进一步研究MAGE-3抗原在肿瘤免疫治疗中的作用提供了一件检测工具.     

人类DLK1基因的克隆、表达、纯化及抗体制备

目的 构建人类DLK1基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究DLK1基因的功能奠定基础.方法 从GenBank中下载人类DLK1基因全长cDNA序列并针对不合信号肽的编码序列设计引物,应用RT-PCR获得目的片段,重组入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得重组DLK1蛋白免疫大鼠制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体滴度.结果 成功构建了DLK1基因重组表达载体pET-28a-DLK1,表达的重组蛋白纯化经SDS-PAGE鉴定后免疫大鼠,得到了高滴度的多克隆抗体.结论 成功的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备为进一步研究DLK1基因的功能及其在肝肿瘤中的作用提供了基础.     

金黄色葡萄球菌蛋白A Z结构域的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:制备金黄色葡萄球菌蛋白A(Sp A)Z结构域的原核表达蛋白及其多克隆抗体,并对其进行特异性鉴定。方法:3段Sp A-Z结构域经柔性肽(GS)串联连接构成三串联体(Sp A-3Z),经原核密码子优化后全基因合成,克隆至p ET21a(+)载体,构建p ET21a(+)/Sp A-3Z重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western Blot法分析鉴定;纯化的Sp A-3Z重组蛋白免疫日本大耳白兔,并分别于免疫前和免疫后采集血清,用ELISA法检测其多克隆抗体的反应和效价,并用Western Blot法分析多克隆抗体结合天然Sp A的特异性。结果:成功构建了p ET21a(+)/Sp A-3Z重组质粒;该重组质粒在原核表达系统表达并获得纯化的Sp A-3Z重组蛋白,SDS-PAGE电泳显示该蛋白的分子质量约为21 k Da,与理论分子量大小相符;日本大耳白兔经该蛋白免疫后可产生特异性的多克隆血清Ig G抗体,效价可达1:40 000;Western Blot法检测结果显示,在分子质量约42 k Da(天然Sp A蛋白)处出现单一条带,提示兔多克隆血清抗体可识别天然Sp A。结论:Sp A-3Z原核蛋白有较好的免疫原性和抗原性,制备的Sp A-3Z兔多克隆血清抗体Ig G效价高、特异性好,可进一步用于Sp A-Z相关的生物学和免疫学等功能研究。     

斑马鱼ISL1蛋白多克隆抗体的制备

目的为了进一步研究ISL1作为第二生心区心脏前体细胞的分子标志在心脏发育中的功能,需要获得ISL1蛋白并制备其抗体。方法 根据已报道的ISL1基因序列,以斑马鱼mRNA为模板进行PCR扩增得到ISL1部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达载体。将重组质粒进行酶切测序鉴定,然后利用大肠杆菌E．coli BL21对该重组质粒进行表达。经过IPTG诱导,采用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的his-ISL1融合蛋白免疫新西兰大白兔制备ISL1多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体效价。结果获得了ISL1原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗ISL1多克隆抗体。结论本实验为ISL1在斑马鱼心脏发育中的新功能的进一步研究奠定了基础。