运用酵母双杂交系统筛选与埃博拉病毒GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白

目的 运用酵母双杂交技术从人肝cDNA文库中筛选出与埃博拉病毒(EBOV)GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白,用于研究GP、VP30、NP、L蛋白在EBOV传染病中的生物学功能.方法 利用重组PCR技术构建诱饵质粒pGBKT7-GP、pGBKT7-VP30、pGBKT7-NP、pGBKT7-L,将诱饵菌株与人肝cDNA文库菌株进行杂交筛选,对筛选到的阳性克隆进行DNA测序和生物信息学分析,然后再利用酵母回复性实验进一步验证,排除假阳性结果.结果 成功构建了诱饵质粒pGBKT7-GP、pGBKT7-VP30、pGBKT7-NP、pGBKT7-L,筛选出6个可能与GP、VP30、NP、L蛋白有相互作用的宿主蛋白,分别是COMMD1、ALB、PSMD8、APOA2、CYP2E1、HP.酵母回复性实验进一步说明了COMMD1和APOA2与NP蛋白可能存在相互作用.结论 酵母双杂交筛选出多个可能与EBOV的GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的捕获蛋白,为研究EBOV的致病机制提供了参考.     

HLH缺失型Id2候选相互作用蛋白

目的:筛选可以与螺旋-环-螺旋(HLH)结构域缺失的Id2相互作用的蛋白.方法:用重叠延伸PCR方法将Id2中的HLH结构域缺失,并插入到pGBKT7载体,构建 BD∶ Id2-DBM-δHLH融合诱饵质粒;构建MCF-7细胞的ds cDNA文库;采用共转化方法进行Id2-DBM-δHLH相互作用蛋白的酵母双杂交筛选,采用PCR方法扩增阳性克隆中的AD∶ cDNA序列并测序;将获得的AD∶ cDNA质粒分别与BD∶ Id2-DBM-δHLH诱饵质粒共转化酵母进行配对验证.结果:酵母双杂交方法共筛选到19个阳性克隆,PCR方法在这19个克隆中共扩增到28条片段,序列测定证实含18个不同的基因,对其中的13个进行配对验证后证实了其中8个与HLH缺失型Id2相互作用,这8个基因分别是:UXT、VIM、KRT7、FHL2、SEI1、PCBP1、SIVA和LSM2.结论:本研究首次利用HLH缺失型Id2作为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选识别了一族新的Id2相互作用蛋白,为进一步研究Id2的功能调控以及非HLH依赖的功能活性奠定基础.     

大鼠肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与筛选

目的构建脂多糖(LPS)和地塞米松(Dex)作用后的肺泡巨噬细胞(AMs)酵母双杂交cDNA文库,探寻炎症条件下与糖皮质激素受体(GR)相互作用的蛋白质分子。方法用LPS(10mg/ml)和Dex(10-5mol/L)作用于原代培养的肺泡巨噬细胞4h后,从肺泡巨噬细胞中提取总RNA,再以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的双链cDNA,后者纯化后,与线性质粒pGADT7-Rec共转化感受态酵母菌AH109,二者在酵母细胞中同源重组成环形的有复制活性的cDNA文库质粒,收集在缺亮氨酸(Leu)培养板上筛选出所有克隆,即为AMs酵母双杂交文库菌。进而通过诱饵质粒pGBKT7-GR转化构建成功的文库菌,筛选与GR相互作用的蛋白分子。结果构建了具有基因多样性和库容量足够大的AMscDNA文库,共获得1.07×106个转化子,插入的双链cDNA片段的长度在0.3~1.5kb之间。筛选文库获得1个真阳性克隆,经测序和同源性比较证实该克隆为BAG-1。结论利用ClontechSMART技术成功构建了肺泡巨噬细胞的酵母双杂交cDNA文库;GR与BAG-1在酵母细胞中存在着相互作用。     

酵母双杂交技术筛选人95D细胞中肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白及其验证

 目的 通过酵母双杂交实验、免疫共沉淀及GST pull down技术筛选并验证肺癌细胞系95D细胞中与肺癌转移相关蛋白1(lung cancer metastasis-related protein 1,LCMR1)相互作用蛋白,为进一步研究LCMR1在肺癌发生发展中的作用提供科学依据。方法 将诱饵质粒pGBKT7-LCMR转化AH109,应用酵母双杂交系统筛选出95D细胞中与LCMR1相互作用的候选克隆;应用反复划线法、X-α-Gal显色法和共转化回复验证法排除假阳性克隆,对真阳性克隆进行测序及生物学分析;构建含Myc标签的LCMR1融合蛋白的重组载体pCMV - Myc-LCMR1载体,以及带flag标签的目标相互作用蛋白载体,共转染细胞,利用免疫共沉淀技术验证LCMR1与相互作用蛋白之前的相互作用;融合蛋白沉降(GST pull- down)法进一步体外验证LCMR1与相互作用蛋白之间的作用。结果 诱饵质粒pGBKT7 -LCMR1与95D细胞cDNA文库共转化AH109,初步获得20个候选克隆;重复划线法后获得16个阳性克隆,X-α-Gal显色法获得12个蓝色阳性克隆,进一步将文库质粒与诱饵质粒共转化酵母菌回复验证,最终获得6个真阳性克隆;成功构建含标签重组载pCMV-Myc-LCMR1、pcDNA3.0-flag-RPL29及pcDNA3.0- flag-GNG5载体,经免疫共沉淀验证LCMR1与RPL29在细胞内有相互作用,与GNG5在细胞内无相互作用;GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29在体外有相互作用,与GNG5在细胞外无相互作用。结论 酵母双杂交技术筛选出95D细胞中相互作用蛋白6个,经免疫共沉淀和GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29体内体外均有相互作用。     

肝细胞内与HBeAg结合的新蛋白编码基因E-36的筛选与克隆

目的　探讨HBeAg在乙型肝炎病毒 (HBV)致病过程中所起的作用。方法　利用酵母双杂交系统 3筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBeAg有相互作用的蛋白的基因。将HBeAg编码基因克隆入酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH10 9并在其内表达 ,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合 ,双重筛选阳性菌落 ,提取质粒并测序。结果　通过行生物信息学分析 ,发现其中有 1个未知基因 ,命名为E 36。结论　根据GenBank中的序列信息设计引物 ,从HepG2细胞中扩增出E 36新基因的完整序列并克隆到另一酵母表达载体pGADT7中 ,并用体外免疫共沉淀方法再次验证了HBeAg与E 36新蛋白之间有结合作用 ,为HBeAg的功能研究提供了新线索。     

人前列腺癌cDNA文库的构建和筛选

目的:PC1基因是与前列腺癌相关的新基因,在雄激素非依赖和转移的前列腺癌晚期细胞系C42中高表达。为了进一步研究PC1基因的功能及作用机制,构建C42细胞的cDNA文库,寻找与前列腺癌相关基因PC1相互作用的蛋白。方法:从前列腺癌细胞系C42中提取总RNA,进而分离poly(A)+RNA,用poly(A)+RNA进行反转录并以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增,得到两端具有同源臂的PCR片段,以此同源臂为基础在酵母中实现同源重组。通过文库片段、线性化的pGADT7Rec和诱饵质粒pGBKT7PC1C共转化酵母AH109菌株,在文库构建的同时进行与PC1相互作用蛋白的筛选;或先将文库片段,线性化的pGADT7Rec转化AH109,再利用AH109和Y187两种酵母菌株的接合生殖进行筛选。最后用Far Western印迹方法进一步从体外论证了PC1蛋白可与自身相互作用形成二聚体。结果:构建了具有基因多样性和库容量足够大的人前列腺癌cDNA文库,双链cDNA片段的长度大小范围为250～5000bp。共转化的效率为4.3×105,重组效率为1.9×106,筛选的克隆数为4.3×105。接合法筛选时的接合效率为32%,筛选的克隆数为1.0×106。筛选到4个与PC1蛋白相互作用的阳性克隆。从体外证明了PC1蛋白可形成二聚体。结论:此文库的多样性和库容量均符合筛选需求。可用于前列腺癌相关基因     

hPer1相互作用蛋白的筛选

目的 应用酵母双杂交系统筛选血液中与人体生物钟蛋白Per1相互作用的新蛋白.方法 以人Per1的basic HLH-PAS结构域为诱饵,在人血液cDNA文库中筛选与之相互作用的新蛋白.阳性克隆送测序后用生物信息学分析.结果 酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆.通过测序和生物信息学分析,其中之一能与Per1相互作用的蛋白为LSMD1.结论 通过酵母双杂交系统证明Per1能够与LSMD1发生相互作用.     

人DOC-2氨基端PID结构域酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定

目的：获得人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域（PID）cDNA基因，构建酵母双杂交诱饵载体，并检测对报告基因的激活作用。方法：PCR扩增含人DOC-2编码区的全长cDNA片段，克隆入诱饵载体pGBKT7，再亚克隆得到含PID结构域的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-nDOC2。将重组质粒导入酵母菌AHl09，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果：成功构建人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域（PID）酵母双杂交诱饵载体，该段基因表达的蛋白对酵母菌AH109既无毒性，对报告基因也没有激活作用。结论：我们可利用构建的酵母双杂交诱饵载体来钓取人DOC-2氨基端PID结构域的相互作用蛋白，以利于对DOC-2基因功能进行研究。     

应用酵母双杂交技术筛选和验证与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白

目的 通过酵母双杂交技术筛选与DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位（DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs）磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行验证。方法 通过酵母双杂交技术,以之前构建的pGBKT7-DPC载体为诱饵,在人肝组织酵母文库中筛选与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,对筛选出来的阳性酵母细胞克隆进行PCR鉴定、回转验证以及测序分析;构建诱饵蛋白和阳性克隆蛋白的真核表达载体,分别转染至人胚肾293T细胞中,检测诱饵蛋白和阳性克隆蛋白能否正确表达;最后将阳性克隆蛋白与诱饵蛋白共转染至293T细胞中,通过免疫共沉淀实验检测阳性克隆蛋白与诱饵蛋白之间的相互作用。结果 经过两轮酵母双杂交实验筛选得到12个文库质粒克隆,通过PCR鉴定确定7个插入片段长度互不相同的文库克隆,对7个文库克隆进行回转验证得到3个与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,经测序分析显示分别为MBNL1、SIK2和YY1AP1。成功构建诱饵蛋白和3个阳性克隆蛋白的真核表达载体,且均能够在293T细胞中正确表达。免疫共沉淀实验证实筛选出来的3个阳性克隆蛋白均能够与DNA-PKcs磷酸化簇区域发生相互作用。结论 成功筛选到与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行了验证。     

湿润烧伤膏治疗婴儿湿疹的临床疗效观察

目的观察、探讨湿润烧伤膏(MEBO)治疗婴儿湿疹的临床疗效。方法将84例婴儿湿疹患儿随机分为治疗组(44例)和对照组(40例),治疗组外涂湿润烧伤膏治疗,对照组外涂湿疹膏治疗,连续治疗1周后,观察两组疗效。结果治疗组有效率为97.73%,对照组有效率为82.50%;两组疗效经秩和检验,差异具有统计学意义(P0.05);随访1个月,治疗组未见复发,对照组有2例患儿复发。结论湿润烧伤膏治疗婴儿湿疹疗效好,无毒副作用,安全可靠。     

海马头部浅沟消失对海马硬化诊断价值的探讨

目的　探讨海马头部浅沟消失对海马硬化的诊断价值。方法　对 18例经组织学检查证实的海马硬化患者的MRI检查资料和 18例年龄相匹配的对照组进行回顾性分析 ,观察海马头部浅沟的显示情况、海马头部大小和信号改变。结果　 18例海马硬化患者中 ,16例硬化侧海马头部浅沟消失 ,1例硬化侧海马头部浅沟明显变浅 ,几乎消失 ,1例硬化侧海马头部浅沟存在。硬化侧海马头部均有萎缩 ,并在T2 WI和液体衰减恢复 (FLAIR)成像呈高信号。海马头部浅沟消失对海马硬化诊断的敏感性为 88.9% ,特异性为 10 0 %。结论　海马头部浅沟消失是诊断海马硬化的一个可靠征象 ,结合患侧海马有萎缩性改变和T2 加权成像信号增高 ,可肯定诊断海马硬化。     

Study of age of fusion of hyoid bone

The present study was conducted to determine the age of fusion of greater cornua with the body of hyoid bone. Age of fusion of hyoid bone can help in determining the age of an individual, especially of unknown dead bodies where only skeletal remains are available. A victim of compression of neck will more likely have fracture of hyoid bone if his hyoid bone is fused. Indian authors have reported that the fusion of hyoid bone occurs after 40 years of age. Studies done by foreign workers observed that hyoid bone fused at an earlier age (30-40 years). A total of 170 excised hyoid bones from dead bodies belonging to the age group of 20-65 years were studied. Fusion occurred earlier in females as compared to males by about 5 years. The mean age of unilateral and bilateral fusion in males was 38.25 and 53.16 years, respectively. The mean age of unilateral and bilateral fusion in females was 38.00 and 48.50 years, respectively. All the hyoid bones were fused after the age of 60 years. No significant differences were found between the fusion on right and left side.     

延迟性脾破裂误漏诊原因分析

目的探讨延迟性脾破裂误漏诊原因和预防措施.方法回顾性分析总结12例延迟性脾破裂中的诊断和误漏诊的经验与教训.结果本组延迟性脾破裂的误漏诊5例(41.66%).对多发伤与脾破裂并存可能认识不足,外伤史轻微或伤员隐瞒外伤史,缺乏腹痛-缓解-突然再腹痛的典型病史,缺乏“对冲性脾破裂”力学分析和整体化诊断思路等为其误漏诊的主要原因.结论详细的外伤史和全面系统检查,重视腹以外多发伤掩盖腹内脏器伤及延迟性脾破裂可能.确立外伤-腹内脏器伤-脾破裂整体化诊断思路.不间断地辅以B超检查脾形态学变化和腹内有无积液,腹腔穿刺确定有无血腹、X线胸腹部检查观察左侧胸肋角和膈肌运动情况、必要时CT检查以尽早发现脾包膜下血肿,降低延迟性脾破裂误漏诊率.     

Analysis of the results of the international comparison of activity measurements of a solution of Fe

The results of an international comparison of activity measurements of a solution of ⁵⁵Fe organized by the BIPM in 2005 are reported and analysed. This exercise, which follows the procedures of the CIPM mutual recognition arrangement to update older comparisons, is a renewal of the comparison organized by the BIPM that took place in 1978. A EUROMET comparison was organized in 1996 specifically to compare activity measurements of a ⁵⁵Fe solution by means of liquid-scintillation techniques. Results of these three comparisons are presented and discussed in this paper.

The radionuclide solution was provided by the NPL, which also distributed the samples to the participants. The activity of the ampoules was measured by 16 laboratories using 12 methods producing 25 results. Some general considerations on uncertainty assessments pertaining to the different techniques used are drawn. The outcome of four different estimators is compared from which the presence of at least one outlier can be confirmed. Further measurements should be made to try to reduce the discrepancy between the results. To date the outcome of the present comparison does not show an improvement to that of the 1996 comparison.     

The value of information of duration of pregnancy in establishment of paternity

Summary In order to get an idea of the value of the information on the duration of pregnancy in establishment of paternity, 511 records from 17 lower courts in Sweden were studied.It was found that when a blood group investigation has been performed, only a small number of cases remain where the paternity claim should be rejected by a court of law for the reason that the period of pregnancy has been extremely long or short.It was shown that only very extreme probability values (percentages) should give reason for rejection of paternity claims if a larger risk of error is to be avoided. The risk is somewhat smaller with long pregnancies than with short ones.The results of this study emphasize the difficulties involved in probability assessment in paternity suits.This report was presented at the Seventh International Medical-Legal Seminar, Stockholm 1971.     

消妇炎胶囊辅料的合理性实验研究

目的确定消妇炎胶囊的辅料及用量。方法以浸膏粉的吸湿率和流动性为考察指标,对加入淀粉、糊精及微晶纤维素3种不同辅料后制得的颗粒进行考察,优选出最佳辅料后,再对最佳辅料的不同用量进行考察。结果加入辅料后,颗粒的抗吸湿能力和流动性都明显改善,其中加入淀粉后,分别在6、12、24、48、60 h测得的吸湿率为2.01%、4.03%、5.98%、6.66%、7.31%,休止角为34.61°,均小于糊精与微晶纤维素,表明加入淀粉颗粒质量最好;每80 g浸膏粉中分别加入30、45、60 g淀粉,综合判定45 g较好。结论每80 g浸膏粉加入淀粉45 g为辅料用量参数,制得颗粒的抗吸湿能力和流动性均好,可节约成本。     

超声对观察椎动脉椎骨段走行的诊断意义

目的探讨超声对观察椎动脉椎骨段走行的诊断价值。方法对162例患者(走行异常者经血管造影或MR I等其他检查证实)的双侧椎动脉走行的二维和彩色血流信号等声像图信息进行回顾性分析,对椎动脉椎骨段走行异常作出诊断及分型。结果(1)超声通过二维或彩色多普勒的血流信号可显示椎骨段椎动脉有无、穿入位置和走行形态。(2)超声根据椎骨段椎动脉的有无、穿入位置和在椎骨段中的走行形态可将椎动脉椎骨段走行异常分为缺如0.6%(2/324),走行变异2.7%(9/324),走行弯曲5.5%(18/324)三大类。结论超声能清晰显示椎动脉椎骨段的有无、穿入位置及走行形态,能对椎动脉椎骨段的走行异常作出分型诊断,在形态学上为临床明确椎动脉的病因提供帮助。     

华支睾吸虫病368例B超检查肝脏的临床分析

目的：探讨B超在华支睾吸虫病诊断中的应用价值。方法：采用B起检查368例华支睾吸虫病患者肝胆有无异常。结果：368例华支睾吸虫病患者B超检查，发现肝胆异常者320例，符合疾病的病理、生理改变。结论：B超诊断华支睾吸虫病县有重要的价值。     

武警某院急诊科抗菌药物处方分析

 目的 了解武警某院急诊科抗菌药物的使用情况。方法 提取急诊科2015年下半年的处方,遴选出使用抗菌药物(除去眼膏、外用膏药及中成药)的处方。对抗菌药物处方进行分类统计及分析, 包括使用抗菌药物的种类及比例、使用居前6位的抗菌药物、抗菌药物的联合使用情况等。结果 在2015年下半年急诊处方中有抗菌药物处方3872张,占处方总数的22.3%。使用抗菌药物构成比中,喹诺酮类药物使用频率最高,占42.9%。使用居第一位的药物是左氧氟沙星,占39.8%。单联处方77.86%,二联处方22.14%,无三联处方。结论 2015年下半年我院急诊科抗菌药物使用符合卫生部抗菌药物使用规定,但有些方面还需要进一步改进。