动态浊度法检测23价肺炎链球菌多糖疫苗细菌内毒素的方法确认和应用

 目的  对动态浊度法检测23价肺炎链球菌多糖疫苗（23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine,PPV23）细菌内毒素进行方法学确认并加以应用。 方法   按照《中华人民共和国药典》2010版三部中的动态浊度法操作,配制系列稀释的细菌内毒素标准品,验证动态浊度法的线性、准确度、重复性和中间精密度。根据2012年和2013年连续20批PPV23成品的细菌内毒素检测结果,分析PPV23对动态浊度法的影响。 结果   动态浊度法的标准曲线具有可靠性,细菌内毒素标准品的回收率为90%~129%,变异系数为6.2%~12.4%,均符合规定的标准,且操作人员（F=4.80,P=0.06）和时间（F=1.01,P=0.34）变化对检测结果没有影响。2012年和2013年各连续20批PPV23成品的细菌内毒素检测结果保持稳定,细菌内毒素均值分别为0.165和0.355 EU/ml,PPV23对动态浊度法没有影响（F=0.00,P=0.97）。 结论   动态浊度法有效可行,可用于PPV23细菌内毒素检测。     

23价肺炎链球菌多糖疫苗和13价肺炎链球菌结合疫苗在成年人中的应用

 肺炎链球菌是引起全球不同年龄人群,尤其是幼儿和老年人肺炎、败血症和脑膜炎等严重疾病的重要病原菌,由肺炎链球菌导致的这些疾病可以通过疫苗进行预防。在将肺炎链球菌疫苗纳入国家免疫计划的国家,儿童肺炎链球菌病的发病率以及疫苗型肺炎链球菌的携带率大大降低,且可在未免疫人群中产生间接保护作用。此文对23价肺炎链球菌多糖疫苗和13价肺炎链球菌结合疫苗在成年人中的应用进行探讨。     

9V型精制多糖在肺炎球菌多糖含量检测中的应用

目的:挑选特定的9V型肺炎球菌精制多糖应用于9V型肺炎球菌多糖含量检测,探讨其作为标准多糖使用的可行性。方法:对选定批次的9V型肺炎球菌精制多糖进行单型多糖质量指标成分测定,并以其作为标准多糖进行准确度、精密度和线性研究。结果:批号为STD1213的9V型肺炎球菌精制多糖在半年内物理性状无变化,各质量指标均合格、良好、稳定。使用该多糖进行定量检测是准确的、精密的,线性良好。结论:此批精制多糖质量和稳定性均良好,具有作为9V型标准多糖使用的可能性。应用9V型标准多糖进行定量检测为进一步完善肺炎球菌多糖含量检测体系奠定了基础。     

火箭免疫电泳法定量检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗中C群脑膜炎球菌多糖含量的方法学验证

目的 验证用火箭免疫电泳法(rocket immunoelectrophoresis,R1E)检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗(tetravalent serogroup A／C／W135／Y meningDcoccal polysaccharide vaccine,MPV4)中C群多糖含量的可靠性。方法 以系列浓度的C群多糖溶液为标准,采用RlE对MPV4中C群多糖含量迸行重复测定。结果 最佳线性范围为30～86 mg／L,相关系数(r)均大于0.985;MPV4与C群多糖参比品的剂量反应曲线之间具有良好的平行性;在精密度试验中,试验内CV为6.08％～8.07％,试验间Cy为7.24％～9.19％;A、W135和Y群多糖及乳糖不引起非特异性免疫反应。结论 本法的线性、精密度和专属性均符合验证要求,可作为定量检测MPV4中C群多糖含量的方法。     

检测脑膜炎球菌多糖疫苗Y群多糖含量和分子大小的双抗体夹心ELISA法的建立和初步应用

目的建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗（groupsA，C，Y，W135meningococ—calpolysaccharidevaccine，MPV4）Y群多糖含量的双抗体夹心ELISA法。方法采用杂交瘤技术制备抗Y群多糖单克隆抗体，并通过过碘酸钠法用辣根过氧化物酶标记单克隆抗体。分别以抗Y群多糖不同位点的单克隆抗体作为包被抗体和酶标二抗，通过优化反应条件来建立双抗体夹心ELISA法，同时进行方法学验证。结果建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好，未检出与A、C、W135群多糖的交叉反应。Y群多糖在2．5～20．0ng／ml范围的剂量反应曲线呈现最佳线性关系，相关系数〉0．99。该法的试验内和试验间准确度较好，精密度较佳，定量限度为4ng／ml。采用该法测定3批MPV4Y群多糖显示，Y群多糖的含量、多糖分子大小‰值和回收率的结果均与先前的检定结果一致，符合暂行质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4Y群多糖的关键质量指标测定。     

5型肺炎球菌结合物原液中游离多糖分离方法的建立及验证

目的:建立和验证有效分离5型肺炎球菌结合物原液(结合物原液)中游离多糖的方法,以供测定游离多糖含量。方法:通过游离多糖添加回收率试验以及氯化钠浓度对咔唑-硫酸法吸光度值影响试验,选择结合物原液中游离多糖和多糖-蛋白结合物分离时最佳的氯化钠浓度;通过蛋白回收率试验筛选出该条件下所能沉降蛋白质的浓度范围;比较标准曲线经脱氧...     

A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量测定方法的建立

目的  建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌（meningococcus,Men）多糖疫苗（groups A,C,Y,W135 menignococcal polysaccharide vaccine,MPV4）多糖含量的火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophoresis,RIE)法。方法  分别用A、C、Y、W135群Men菌液、A、C、Y、W135群Men菌液加佐剂、A、C、Y、W135群Men多糖-牛白蛋白结合物免疫家兔,制备特异性抗血清。将制备的抗血清以一定的比例加入琼脂糖凝胶制成平板,并将纯化的多糖作为定量参考品加入抗原孔进行RIE。以多糖含量和对应的RIE峰高作标准曲线并建立直线回归方程。采用优化的RIE法测定MPV4多糖含量和分子大小。结果  菌液加佐剂制备的抗血清效价较理想。在确定的电泳条件下,建立的RIE法制备的标准曲线呈现良好的线性关系,相关系数值均大于0.98。该法特异性较好,未检出各多糖间的交叉反应。采用该法测定3批MPV4多糖含量、分子大小及回收率的结果均与先前的检定结果相符,均符合质控标准。结论  建立的RIE法可作为MPV4多糖抗原含量的测定方法。     

4种血清型肺炎球菌免疫血清的制备及质控研究

目的:自制6A型、6B型、19A型、19F型肺炎球菌免疫血清并检测其质量,为肺炎球菌疫苗多糖含量的测定提供优质检验试剂。方法:(1)制备6A型、6B型、19A型、19F型肺炎球菌免疫血清：用6A型、6B型、19A型、19F型肺炎球菌菌株制备免疫原,按照免疫程序接种日本大耳白兔,将符合规定的免疫血清分装保存。(2)检测6A型、6B型、19A型、19F型肺炎球菌免疫血清：采用速率散射比浊法和ELISA法进行检测。通过外标法确定肺炎球菌免疫血清工作浓度,利用交叉反应对免疫血清进行特异性分析,将初步筛查出有交叉反应的免疫血清进行吸收后利用血清交叉实验进行再次筛查;使用ELISA法对自制与丹麦国家血清研究所(Statens Serum Institut, SSI)生产的肺炎球菌免疫血清的抗体滴度进行检测并对比;最后筛查出与C多糖具有交叉反应的免疫血清并进行吸收。结果:初步筛查出6A型、6B型免疫血清有交叉反应,19A型、19F型免疫血清有交叉反应,经吸收后成功去除交叉反应且反应曲线范围(多糖含量为0.75～2.0μg·mL^-1)线性良好(r>0.985),利用ELIS...     

13价肺炎球菌结合疫苗在小鼠中的安全性及免疫原性评价

目的 评价13价肺炎球菌结合疫苗(13-valent penumococcal conjugate vaccine,PCV-13)在小鼠中的安全性及免疫原性.方法 将90只小鼠按简单随机法分为3组,分别免疫PCV-13、市售7价肺炎球菌结合疫苗(PCV-7)及生理盐水.于0、14、28 d分别进行3次皮下注射,观察免疫后小鼠的体重及状态变化至35 d.每组小鼠随机取10只在第14天进行眼眶采血,其余20只在第35天采血.采血后分离的血清于-40℃以下保存.用ELISA检测小鼠血清抗各型肺炎链球菌荚膜多糖IgG抗体水平.结果 PCV-13免疫小鼠的体重增加未受到抑制,且未观察到其他不良反应,疫苗的安全性良好.3针免疫后,PCV-13免疫小鼠的抗各型多糖抗体滴度都有上升,表明PCV-13具有良好的免疫原性.PCV-13与市售PCV-7对共同的7个血清型的免疫原性相同(t=0.004,P＞ 0.05).结论 PCV-13在小鼠中具有良好的安全性和免疫原性,这为该疫苗的临床前研究提供了一定的理论依据.     

HPLC测定肺炎球菌多糖疫苗中的苯酚

目的 采用HPLC法测定肺炎球菌多糖疫苗中苯酚的含量。方法 采用Capcell PAK C₁₈ MGⅡ色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),流动相为0.2 mol·L^-1硫酸盐缓冲液-乙腈(74:26),流速1.0 mL·min^-1,检测波长270 nm,柱温30℃,进样量20μL,按峰面积外标法计算苯酚的含量。结果 0.3183～1.5914×10³μg·mL^-1苯酚与峰面积的线性关系良好(r=0.9999),定量限和检测限分别为0.064、0.0128 ng; 9份加标供试品溶液的平均回收率为99.38%,RSD=0.61%。结论 所用方法操作简便、准确、稳定性好、专属性强,可用于肺炎球菌多糖疫苗中苯酚的准确定量。     

测定脑膜炎球菌疫苗C群多糖的双抗体夹心ELISA法的建立

目的 建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗(groups A,C,Y,W135 meningococcal polysaccharide vaccine,MPV4)C群多糖含量的双抗体夹心ELISA法.  方法 制备抗C群多糖多克隆抗体,所得的多克隆抗体经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化后,用过碘酸钠法对其标记辣根过氧化物酶.分别将抗C群多糖多克隆抗体作为包被抗体和酶标二抗,建立双抗体夹心ELISA法,优化反应条件,对C群多糖进行特异性定量测定.  结果 建立的双抗体夹心ELISA法特异性较好,未检出与A、Y、W135群多糖的交叉反应.C群多糖在2.5～20.0 ng/ml质量浓度范围的剂量反应曲线线性最佳,相关系数大于0.99.该法的准确度和精密度均较好,试验内和试验间变异系数和多糖回收率分别为0.6％ ～9.1％和87.5％ ～ 100.0％,定量限度为4.0 ng/ml.采用该法测定3批MPV4显示,C群多糖含量及多糖分子大小KD值和回收率的测定结果均与先前的测定结果一致,均符合暂行质量标准.  结论 建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4 C群多糖的关键质量指标测定.     

23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的研制

目的  研制23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗。方法  大罐培养1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、和33F型肺炎链球菌并进行各型荚膜多糖的纯化,制备23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗。 结果  经检定各型精制多糖主要质量指标均符合《欧洲药典》（2005 年版）要求。 结论  已建立起成熟的细菌培养和多糖纯化工艺。     

检测精制肺炎链球菌多糖中甲基戊糖方法的验证

目的 建立检测精制肺炎链球菌多糖中甲基戊糖的方法,并进行方法学验证.方法 将经硫酸和加热处理的精制肺炎链球菌多糖与半胱氨酸盐酸盐进行反应,分别在396 nm和430 nm波长下检测合成的化合物的吸光度值,并根据差值计算甲基戊糖含量.对建立的甲基戊糖测定法进行准确度、专属性、精密度、线性和耐用性验证.结果 该法的准确度良好,甲基戊糖加样回收率为90.2％～108.9％.该法具有较好的重复性和中间精密度,相对标准偏差分别为≤4.6％和1.2％～5.2％,均符合规定的要求.在甲基戊糖质量浓度为2～22 mg/L的检测范围,该法的标准曲线呈现良好的线性,决定系数＞0.99000.该法的专属性较好,精制肺炎链球菌多糖溶液中含有10～50 g/L乙酸钠不会对检测结果产生影响.结论 建立的甲基戊糖测定法可准确定量甲基戊糖含量,可用于对精制肺炎链球菌多糖中甲基戊糖的质量控制.     

抗肿瘤单克隆抗体药物研究进展

抗肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体(单抗)可以有效治疗肿瘤.这些单抗药物可通过直接作用于肿瘤细胞、改变机体免疫应答、运送药物和重新激发机体免疫等机制来抗击肿瘤.此文就单抗治疗肿瘤的作用靶点、机制、代表性药物和新策略进行综述.