携EGFP的人低氧诱导因子-1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携EGFP的人低氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor 1 alpha,HIF-1α)腺病毒表达载体,为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础.方法 采用分子克隆技术,以Kpn Ⅰ、Apa Ⅰ双酶切pcDNA3.1( )-HIF1α质粒获得HIF-1α cDNA,克隆到质粒pEGFP-C1,以Nhe Ⅰ、Apa Ⅰ双酶切得到EGFP-HIF-1α cDNA,重组到穿梭质粒pShuttle2,再以PI-Sce Ⅰ和I-Ceu Ⅰ双酶切重组穿梭质粒,获得含有EGFP-HIF-1α cDNA的表达盒,与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-EGFP-HIF-1α腺病毒质粒,脂质体法转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察结果,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-EGFP-HIF-1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定.结果 经酶切鉴定及PCR证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×109nfu/ml.结论 成功构建重组腺病毒Adeno-EGFP-HIF-1α,为冠心病的HIF-1α基因治疗研究奠定更直观的基础.     

pcDNA3．1^＋-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定

目的 克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3-1^ -HIF-1α。方法 以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板，进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，获得HIF-1α的cDNA，克隆入T载体，测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3．1^ ，酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3．1^ -HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞，RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果 扩增出HIF-1αcDNA全长，测序结果与Genbank记载完全一致，成功克隆入真核表达载体pcDNA3．1^ ；建立了稳定的细胞株HEK293／pcDNA3．1^ -HIF-1α。结论 成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3．1^ -HIF-1α并证明其能在真核细胞内表达。     

pcDNA3.1+-HIF-1α载体的构建和初步表达鉴定

目的克隆和构建带人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因真核表达载体pcDNA3.1 -HIF-1α。方法以大肠癌细胞株HT29的总RNA为模板,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),获得HIF-1α的cDNA,克隆入T载体,测序证实后克隆入真核表达载体pcDNA3.1 ,酶切鉴定重组子。将构建好的pcDNA3.1 -HIF-1α用脂质体法转入HEK293细胞,RT-PCR鉴定重组质粒的表达。结果扩增出HIF-1αcDNA全长,测序结果与Genbank记载完全一致,成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1 ;建立了稳定的细胞株HEK293/pcDNA3.1 -HIF-1α。结论成功克隆和构建带人HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3.1 -HIF-1α,并证明其能在真核细胞内表达。     

人低氧诱导因子1α真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒及其在人肝癌细胞(HepG2)中的表达。方法:从HepG2细胞中提取总RNA,通过RT-PCR逆转录,获得HIF-1α的cDNA,双酶切后构建真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证碱基序列。用脂质体法将质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α转染至HepG2,以免疫荧光和Western Blot法分别对转染细胞进行HIF-1α表达分析。结果:扩增出HIF-1α全长cDNA,构建真核表达质粒,测序结果正确。经检测的质粒转染至HepG2细胞后,HIF-1α蛋白水平高于转染空载细胞。结论:成功构建人HIF-1α基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α,并证明其能在HepG2细胞内表达。     

突变低氧诱导因子1α基因真核表达载体的构建和表达

目的构建人低氧诱导因子-1α（HIF-1α）真核表达载体pcDNA3．1^＋-HIF-1α的两种突变体pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564A1a和pcDNA3.1^＋-HIF-1α-564A1a-803Ala，并检测它们在人肺微血管内皮细胞（HMVECs）中的表达。方法用定点突变的方法将pcDNA3．1^＋-HIF-1α的HIF-1α第564位脯氨酸（Pro）密码子CCC突变为丙氨酸（Ala）密码子GCC，构建成单个突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564Ala。在第一次突变的基础上，仍然用定点突变的方法将pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564Ala的HIF-1α-564Ala第803位天冬酰胺（Asn）密码子ATT突变为丙氨酸（Ala）密码子GCT，构建成双个点突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564Ala-803Ala。将3种HIF-1α表达载体用脂质体法分别转入HMVECs．以RT-PCR、免疫荧光法和Western blotting法分别对转染细胞进行表达分析。结果测序证实，定点突变成功，构建成重组真核表达载体pcDNA3．1^＋-HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1^＋-HIF-1α-564Ala-803Ala；3种载体均能表达相应的蛋白和mRNA。但转化突变HIF-1α表达载体的细胞蛋白量比空白细胞和转化无突变HIF-1α载体的细胞显著增加。结论成功构建能够在HMVECs中表达的单个和双个点突变的HIF-1α基因的真核表达载体。     

氧浓度和钙离子对野生型及突变型低氧诱导因子-1α基因真核表达的影响

目的 对已构建的突变型人低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)真核表达载体pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala(单突变)和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala(双突变)进行进一步的功能鉴定.方法 将pcDNA3.1+/HIF-1α、pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala分别用脂质体法短暂转染人胚肾上皮细胞(human embryo kidney 293,HEK293);Western blotting法检测正常氧、低氧无钙离子或有钙离子条件下各组转染细胞HIF-1α蛋白水平:RT-PCR法检测正常氧条件各组转染细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达.结果 正常氧条件下,转染突变体的细胞较转染野生型HIF-1α载体的细胞HIF-1α蛋白和VEGFmRNA水平增高;低氧条件下,转染野生型HIF-1α载体的HEK293细胞HIF-1α蛋白水平增高:Ca~(2+)刺激减少低氧时转染野生型HIF-1α载体细胞HIF-1α蛋白水平,但对转染突变体细胞HIF-1α蛋白水平无明显影响.结论 pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala两种突变体产物在蛋白水平上具耐氧和耐蛋白酶降解的特性.

Abstract：

Objective To study the effects of oxygen and calcium on the expression of eukaryotic vectors harboring wild-type or mutated hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)in HEK293 cells.Methods HEK293 cells were transiently transfected with pcDNA3.1+/HIF-1α,pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala and pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala via lipofectin.Western blotting were used to detect HIF-1α protein after normoxic or hypoxic exposure of the transfected HEK293 cells in the presence or absence of Ca~(2+).The levels of vascular endothelial growth factor(VEGF)mRNA in the transfected cells in normoxic condition was detected using RT-PCR.Results The levels of HIF-1α protein and VEGF mRNA increased in HEK293 cells transfected with the vectors harboring mutated HIF-1α, but not in the cells transfected with wild-type HIF-1α vectors in normoxia.Hyooxia increased the levels of HIF-1α protein in the cells transfected with wild-type HIF-1α vectors,which was inhibited by the application of Ca~(2+). Ca~(2+) showed no inhibitory effect on HIF-1α levels in HEK293 cells transfected with the vectors containing mutated HIF-1α. Conclusion The protein products of pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala and pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala in HEK293 cells enhance the cell tolerance to oxygen and protease.     

SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的：构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白（SIRPα-GFP）真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法：将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论：成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。     

RNAi沉默Fas受体表达的腺病毒载体构建

目的：利用pEGFP6-1和pGenesil—1质粒构建针对小鼠Fas的2个短发卡状RNA（shorthairpinRNA,shRNA）串联表达的载体pEGFP6-1—siFasl＋siFas2,进一步通过BDAdeno—X系统构建腺病毒表达Fas—shRNA载体。方法：设计表达2个短发卡状RNA结构的互补DNA序列分别克隆至质粒载体pEGFP6-1和pGenesil—1中,酶切pEGFP6-1—siFasl大片段和酶切pGenesil—1—siFas2小片段,经T4DNAI,igase连接得到pEGFP6-1—siFasl＋siFas2重组质粒。双酶切重组质粒和pshuttle2穿梭质粒。经T4DNA连接酶连接得到pShuttle2-siFasl＋siFas2质粒。双酶切重组穿梭质粒,连接酶切产物和腺病毒转化感受态E.coil DH5a,PCR筛选鉴定阳性克隆,进一步线性化重组腺病毒pAdeno—siFasl＋siFas2质粒,经脂质体转染HEK293A细胞;收细胞进行裂解收病毒。结果：构建的重组质粒载体经酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致;重组腺病毒载体经酶切鉴定和PCR分析正确：经HEK293A细胞包装成功,能够表达绿色荧光蛋白。结论：成功构建Fas—shRNA腺病毒串联表达载体。     

人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

目的: 构建人突变型低氧诱导因子1(HIF-1)α腺病毒表达载体,研究人突变型HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用. 方法: 采用分子克隆技术,由pcDNA3.1( )-HIF1α(突变型)质粒获得突变型HIF1α cDNA,克隆到穿梭质粒pShuttle2,以PI-Sce I和I-Ceu I双酶切重组穿梭质粒,获得含有突变型HIF1α cDNA的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-HIF1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定. 结果: 经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×1012 pfu/L. 结论: 成功构建重组腺病毒Adeno-HIF1α(突变型),为冠心病的突变型HIF1α基因治疗研究奠定基础.     

先天性长QT综合征KCNQ1基因真核表达载体的构建及表达

目的　在原核表达载体pSP6 4 KCNQ1的基础上 ,构建KCNQ1的真核表达载体。方法　先将pSP6 4 KC NQ1通过限制性酶切得到KCNQ1cDNA ,将后者克隆入 pEGFP N1中 ,构建中间过渡载体 pEGFP KCNQ1;将pEGFP KCNQ1和 pIRES EGFP分别用NheⅠ和EcoRⅠ双酶切 ,把KCNQ1cDNA克隆到 pIRES EGFP ,即构建了pIRES EGFP KCNQ1。然后利用Effectene转染试剂介导将pIRES EGFP KCNQ1转染HEK2 93细胞。 结果　在原核表达载体 pSP6 4 KCNQ1的基础上 ,获得了KCNQ1的真核表达载体 pIRES EGFP KCNQ1,并使其在HEK 2 93细胞中成功表达。结论　该法可成功构建、表达KCNQ1的真核表达载体 ,为进一步的功能研究奠定了基础。     

人HIF-1α真核表达载体质粒的建立和鉴定

目的:建立低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒.方法:从人胎肝细胞中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成HIF-1α cDNA,与T载体连接后转化感受态细胞TOP10,测序正确后克隆入pcDNA3真核表达载体,酶切鉴定重组子.结果:获得人HIF-1α真核表达载体质粒,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确.结论:成功克隆和建立人HIF-1α基因真核表达质粒,为进一步研究HIF-1α对风湿性疾病的靶向治疗奠定了基础.     

HPC2真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达的HPC2真核表达载体，并分析其在HEK293细胞中的表达。方法 从重组pcDNA3／HPC2载体上将HPC2cDNA序列亚克隆至带有flag标记的真核表达载体pcDNA3-flag上，经PCR、酶切和测序鉴定，将重组质粒pcDNA3-flag／HPC2用脂质体瞬时转染HEK293细胞，细胞裂解后，用Western blot分析并观察HPC2在HEK293细胞中的表达情况。结果 PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-flag／HPC2构建正确，并可在HEK293细胞内高效表达。结论 成功构建了pcDNA3-flag／HPC2真核表达载体，该载体能在哺乳动物细胞中有效表达，为进一步研究HPC2的功能提供了重要的实验材料。     

晚期糖基化终末产物受体真核表达载体的构建与表达

目的 构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体.方法 采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定.以RAGE/pcDNA3重组质粒为模板,运用突变方法在RAGE氨基末端信号肽后插入HA序列.利用Western blotting在HEK 293细胞中对经过测序鉴定的HA-RAGE\pcDNA3重组质粒的表达进行了检测.结果 RAGE/pcDNA3重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,HA-RAGE\pcDNA3重组质粒可在HEK 293细胞中表达.结论 成功构建了带HA标签的RAGE真核细胞表达载体,该载体能在真核细胞中表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导途径中的作用提供了一个重要的工具.     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DehaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法从pcDNA3-DeltaNp73α—HA中酶切出DehaNp73α基因，并插入pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒；pAdTrack-CMV—DehaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli．BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒，PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒；并在293T细胞中反复扩增；增强离心法转染树突状细胞，Western blot检测目的蛋白的表达。结果经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒；Western blot检测出预期相对分子质量为67×10^3的特异条带。结论成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组病毒。     

辐射敏感性新基因UHRF1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建UHRF1的真核表达载体,并验证其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的表达。方法采用RT-PCR方法,从乳腺癌细胞MCF-7的总cDNA中扩增出2.3kb的UHRF1基因的cDNA片段,经限制性内切酶KpnⅠ与XhoⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组质粒pcDNA3（＋）-UHRF1,利用限制性内切酶双酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;构建成功的重组质粒,经脂质体Lipofactamin2000介导转染MDA-MB-231细胞,G418筛选阳性克隆,以RT-PCR和Western blot检测UHRF1的mRNA和蛋白的表达。结果获得全长约为2.3kb的UHRF1基因片段;重组质粒经限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ酶切、电泳后显示2.3kb的UHRF1目的片段和5.4kb的pcDNA3载体片段,即UHRF1基因的cDNA已正确克隆到真核细胞表达载体pcDNA3中;UHRF1转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后的RT-PCR和Western blot的结果显示：UHRF1的mRNA和蛋白水平均呈现高表达。结论成功构建UHRF1基因的真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.     

优化密码沙眼衣原体主要外膜蛋白基因的设计合成与表达

目的：设计合成优化密码沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP）基因，克隆构建优化密码MOMP(HuMOMP)基因的真核表达质粒及EGFP—HuMOMP融合基因表达质粒。方法：利用软件分析比较鼠肺炎沙眼衣原体(MoPn)与人类等哺乳动物基因组密码子使用的差异，根据所得数据对MOMP基因进行优化设计与合成。双酶切pUC—HuMOMP质粒，游离HuMOMP片段，定向克隆入pcDNA3的相应位点，构建重组真核表达质粒pcDNA3-HuMOMP；双酶切游离pcDNA3-HuMOMP中的HuMOMP片段，定向克隆入pEGFP—Cl的相应位点，构建重组真核表达质粒pEGFP—HuMOMP；pEGFP-HuMOMP质粒体外脂质体转染COS—1细胞，24h后观察荧光蛋白的表达。结果：合成的HuMOMP基因全长1125bp，经DNA测序无误。酶切鉴定pcDNA3-HuMOMP及pEGFP—HuMOMP质粒获得预期分子量DNA片段：EGFP—HuMOMP融合基因在COS—1细胞中获得明显表达，表达产物定位于胞浆。结论：设计合成的优化密码HuMOMP基因能够在哺乳动物细胞中成功表达。     

乙肝病毒X基因真核表达载体pEGFP-X的构建及其表达

目的：构建pEGFP—X真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法：从质粒pcDNA3．1（＋）-X酶切获HBVX基因片段,克隆至pEGFP—N1;用酶切、PCR和测序鉴定pEGFP—X载体;用脂质体法,将重组载体（pEGFP—X）和空载体（pEGFP-N1）瞬时转染肝癌细胞细胞株BEL-7402;分别用RT—PCR、荧光显微镜鉴定HBVX和EGFP基因表达。结果：鉴定证实pEGFP-X载体构建成功;该质粒瞬时转染的BEL-7402有HBVX基因表达,并发绿色荧光。结论：构建的pEGFP—X真核载体能在BEL-7402中表达,绿色荧光蛋白示踪利于表达HBVX基因稳定细胞株的筛选,并为探讨HBVX基因在HCC中的致瘤机理提供实验模型奠定基础。     

甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立

目的构建小鼠甲状旁腺素受体(PTHR)及其突变受体(DSEL)全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素(PTH)模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1(+),二者分别由DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切,经T4DNA Ligase连接的方法将PTHR、DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(+)中,采用测序方法及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL及空质粒pcDNA3.1(+)分别转染至HEK293细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,、RT-PCR及ELISA检测转染细胞PTHR、DSEL的表达情况。结果重组质粒经基因测序及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL构建正确。重组体经脂质体法转染HEK293 48 h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,ELISA检测到PTHR、DSEL基因在重组质粒表达载体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL转染的HEK293中成功表达。RT-PCR方法检测到PTHR、DSEL基因在转录水平的表达。ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293中,加入甲状旁腺激素刺激后,PLC、cAMP蛋白表达量远高于空质粒pcDNA3.1(+)转染的HEK293中PLC、cAMP的表达。结论成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL的HEK293细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础。     

HPC2真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的HPC2真核表达载体,并分析其在HEK293细胞中的表达。方法从重组pcDNA3/HPC2载体上将HPC2cDNA序列亚克隆至带有flag标记的真核表达载体pcDNA3-flag上,经PCR、酶切和测序鉴定,将重组质粒pcDNA3-flag/HPC2用脂质体瞬时转染HEK293细胞,细胞裂解后,用Westernblot分析并观察HPC2在HEK293细胞中的表达情况。结果PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-flag/HPC2构建正确,并可在HEK293细胞内高效表达。结论成功构建了pcDNA3-flag/HPC2真核表达载体,该载体能在哺乳动物细胞中有效表达,为进一步研究HPC2的功能提供了重要的实验材料。