脱乙酰化酶抑制剂与去甲基化制剂联合诱导U266细胞凋亡和p16基因重新表达

背景与目的：DNA甲基化调节基因表达与组蛋白脱乙酰化的作用密切相关,针对这两大途径用药,观察对肿瘤细胞的影响是有意义的,本文探讨脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠（sodium phenylbutyrate,SPB)联合去甲基化制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR)处理人骨髓瘤细胞系U266诱导高甲基化失活的p16基因重新表达的可能性及其对细胞生长的影响。方法：通过透射电镜,DNA梯形条带及流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期的变化;RT-PCR和Western blot检测p16表达水平。结果：单用5-Aza-CdR(1μmol/L）或SPB（1mmol/L)及两药联合诱导的细胞凋亡率分别是15.09%,89.19%和85.18%。单用5-Aza-CdR或SPB对细胞G1期无影响,单用SPB使G2/M期细胞比例增高,联合用药发生明显的G1期阻滞,且出现亚G1期峰达50%。单用PB不能诱导U266细胞p16的表达,单用5-Aza-CdR可诱导p16重新表达,两药联合明显增强p16表达水平。结论：PB与5-Aza-CdR协同可显著诱导U266细胞p16重新表达,细胞阻滞在G1期,并使细胞凋亡发生的时相不同于单独用药组。     

食管鳞癌中p16基因启动子区甲基化及其表达

 目的探讨食管鳞癌（ESCC）p16基因甲基化的状况及其表达与食管鳞癌临床病理特征之间的关系。方法采用甲基化特异性PCR方法（MSP）分别检测75例食管癌组织、癌旁组织和切缘组织p16基因启动子区域CpG岛甲基化状态。采用Envision免疫组化法检测食管癌组织及癌旁组织的p16蛋白的表达。结果75例标本中，食管癌组织、癌旁组织和切缘细织p16基因甲基化率分别为41．3％（31／75）、13．3％（10／75）和6．67％（5／75）。癌组织和癌旁组织P16蛋白的阳性表达率分别为29．3％（22／75）和56．7％0（17／30）。31例癌组织p16基因甲基化阳性标本中有2例（6．4％）检测到P16蛋白的表达，而44例癌组织p16基因甲基化阴性标本中有20例（45．5％）检测到P16蛋白的表达。食管癌组织p16基因甲基化率显著高于癌旁组织和切缘组织（P〈0.01），P16蛋白表达与p16基因甲基化呈负相关。p16基因启动子区甲基化与食管癌的组织学分级、肿瘤部位无明显相关，与临床分期、淋巴转移密切相关。结论p16基因甲基化在食管癌发生发展中起着重要作用，食管鳞癌的分期和淋巴结转移与p16基因甲基化之间有密切关系。     

高发区食管癌患者p16基因甲基化及其表达的比较研究

目的:比较p16基因甲基化在食管癌高发区河南林州(北方组)和广东揭阳(南方组)之间的异同,探讨p16基因甲基化在不同气候环境条件下的两地食管鳞癌(ESCC)发生中的作用。方法:采用甲基化特异性PCR方法(MSP)分别检测两地食管癌组织、癌旁组织和切缘组织p16基因启动子区域CpG岛甲基化状态。采用EnVision免疫组化法检测两地食管癌组织及癌旁组织的p16蛋白的表达。结果:南方组75例标本中,食管癌组织、癌旁组织和切缘组织p16基因甲基化率分别为41.3%(31/75)、13.3%(10/75)和6.67%(5/75);癌组织和癌旁组织p16蛋白的阳性表达率分别为29.3%(22/75)和56.7%(17/30);31例p16基因甲基化阳性标本中有2例(6.4%)检测到p16蛋白的表达,而44例p16基因甲基化阴性标本中有20例(45.5%)检测到p16蛋白的表达。北方组65例标本中,食管癌组织、癌旁组织、切缘组织p16基因甲基化率分别为52.3%(34/65)、16.9%(11/65)和7.69%(5/65);食管癌组织和癌旁组织p16蛋白的阳性表达率分别为32.3%(21/65)和66.7%(20/30);34例p16基因甲基化阳性标本中有4例(11.8%)检测到p16蛋白的表达,而31例p16基因甲基化阴性标本中有17例(54.8%)检测到p16基因的表达。两地组内癌组织p16甲基化率均显著高于癌旁组织和切缘组织,p16蛋白表达与p16基因甲基化呈负相关(P<0.01)。两地同类组织比较p16甲基化率和p16蛋白表达率均无显著性差异(P>0.05)。结论:p16基因异常甲基化后功能失活可能是南、北两地食管癌癌变过程的重要事件,在我国南北环境气候条件不同的两地高发区食管癌的发生中均起着重要的作用。本研究为环境因素和p16基因功能之间的生物学关联在食管癌的发生中提供了一定的证据。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂MS-275对人骨髓瘤U266细胞生长的影响及其可能机制

目的 探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)MS-275对人骨髓瘤细胞U266的凋亡抑制基因生存素(survivin)和核因子-κB(NF-κB)表达的影响.方法 台盼蓝拒染法观察MS-275对细胞活力的影响;瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态学变化;流式细胞仪分析细胞周期;Western blot检测survivin、p21、细胞周期依赖激酶4(CDK4)和NF-κB的抑制蛋白(IKB-α)等的表达,以及凋亡信号通路中caspase-3活化及蛋白聚ADP核糖聚合酶(PARP)裂解情况.结果 MS-275抑制U266细胞增殖,阻断细胞周期于G0/G1期,呈时间-剂量依赖性.MS-275作用U266细胞48 h的IC50为1.39μmol/L.2 μmol/L MS-275作用U266细胞24 h后,G0/G1期细胞所占比例为(64.57±4.09)%;作用36 h后,G0/G1期细胞所占比例为(87.20±2.83)%;瑞氏-姬姆萨染色显示,U266细胞形态发生明显变化.Western blot检测表明,MS-275作用U266细胞后,survivin和CDK4表达下降,p21表达增加,IκB-α磷酸化水平受到明显抑制,caspase-3被裂解活化,其底物蛋白PARP发生剪切,细胞发生凋亡.结论 MS-275可诱导人骨髓瘤细胞系U266凋亡,NF-κB信号通路阻断是凋亡发生的机制之一.     

三氧化二砷体外诱导雌激素受体α表达的初步研究

目的本文拟探讨三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）诱导因高甲基化失活的雌激素受体重新表达的可能性。方法以雌激素受体高甲基化失活的人乳腺细胞系MDA-MB-231细胞系为研究对象，经不同浓度As203处理后，采用RT-PCR技术检测ER-α基因mRNA表达。结果经1．0μmol／L、2．0μmol／L和4．0μmol／L．As2O3处理的MDA-MB-231细胞均能扩增出ER-α基因。结论一定浓度的As2O3可通过去甲基化作用诱导MDA—MB-231细胞系重新表达ER-α。     

多发性骨髓瘤p15、p16基因启动子区甲基化的研究

 目的 探讨 ｐ１５、ｐ１６基因启动子区 ＣＰＧ岛甲基化在多发性骨髓瘤发病中的作用。方 法 利用甲基化特异性 ＰＣＲ技术，研究骨髓瘤细胞株（Ｕ２６６、ＬＰ１、ＫＭ３）及多发性骨髓瘤患者 ｐ１５、ｐ１６基因甲基化状态。结果 Ｕ２６６、ＬＰ１细胞 ｐ１５、ｐ１６基因处于完全甲基化状态；ＫＭ３细胞 则为完全未甲基化模式；ＭＭ患者的ｐ１５、ｐ１６基因启动子区甲基化比例分别为 ５２．３８％及 ５７．１４％。 ｐ１５、ｐ１６基因甲基化与 ＭＭ分期无关（Ｐ＞０．０５）。结论 ｐ１５、ｐ１６基因甲基化在多发性骨髓瘤中 较为常见，这可能为多发性骨髓瘤的治疗提供借鉴。     

硼替佐米对人类多发性骨髓瘤细胞系U266细胞抗凋亡蛋白HSP-90的影响

 目的　探讨硼替佐米对人类多发性骨髓瘤（MM）细胞系U266细胞抗凋亡蛋白HSP-90的影响。方法　采用RT-PCR技术研究经不同浓度的硼替佐米作用于U266细胞4 h后其内HSP-90 mRNA表达情况的变化。结果　随着硼替佐米浓度的增加,其MM细胞中HSP-90α的mRNA表达量逐渐增加。由低浓度组到高浓度组（0、50、100、150、200 nmol／L）所对应的HSP-90α的灰度值分别为0.343±0.017、0.505±0.039、0.640±0.029、0.760±0.059、0.963±0.054;两两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05 ）。浓度由低到高组对应HSP-90β的灰度值分别为0.610±0.022、0.765±0.050、0.645±0.052、0.770±0.059、0.790±0.027,而HSP-90β的灰度值 0 nmol／L组与50、150、200 nmol／L组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。50、100 nmol／L浓度组对应的HSP-90β的灰度值不同（P＜0.05）。100 nmol／L组与150、200 nmol／L组对应的HSP-90β的灰度值差异有统计学意义（P＜0.05）。HSP-90β的mRNA表达量增加趋势不很明显,但总体差异仍具统计学意义（P＜0.05）。结论　硼替佐米可以上调HSP-90的分子水平的表达,并且以上调HSP-90α的表达为主。     

甲状腺肿瘤中p16基因甲基化及p16蛋白的表达

目的探讨甲状腺肿瘤细胞中p16基因异常甲基化及p16蛋白的表达。方法采用甲基化敏感的限制性内切酶SmaI消化DNA，PCR扩增p16基因外显子1，分析60例甲状腺肿瘤中p16基因外显子15′CpG岛异常甲基化，采用免疫组化Envision法检测60例甲状腺肿瘤标本细胞中p16蛋白的表达。结果60例甲状腺肿瘤中p16基因外显子。5′CpG岛异常甲基化率为15．0％（9／60）。30例甲状腺癌中为30．0％（9／30）；30例腺瘤中无异常甲基化，组间比较差异有显著性（P〈0．001）。60例甲状腺肿瘤中p16蛋白阳性表达率为46．7％／60）。30例腺瘤中p16蛋白阳性表达率为60．0％（18／30）；30例甲状腺癌中为33．3％（10／30），组间较差异有显著性（P〈0．05）。结论p16基因外显子t5′CpG岛异常甲基化与甲状腺癌的发生、发展有关，其主要机制可能与甲状腺恶性肿瘤中p16基因失活导致P16蛋白表达缺失有关。     

多发性骨髓瘤患者p15、p16基因甲基化及其与预后的相关性

 目的　探讨p15、p16 基因的高甲基化与多发性骨髓瘤（MM）的发病和预后之间的关系。方法　采用巢式甲基特异性PCR法（nMSP）检测47例MM患者p15、p16基因的甲基化状态,并对患者的临床资料及预后因素进行分析。结果　47例MM患者p15、p16 基因的甲基化比例分别为59.57 %（28／47）、 57. 45 %（27／47）,两者同时存在甲基化者23 例（48.94 %）。Ⅱ、Ⅲ期MM患者p15 、p16基因甲基化率明显高于Ⅰ期患者。结论　p16 、p15 基因的高甲基化与MM的发病及预后相关。     

肝癌患者p16基因甲基化与DNMTs表达相关性分析

目的:研究p16基因启动子区域异常甲基化所导致的基因表达异常在肝癌形成过程中的作用,探讨p16基因甲基化与DNMTs(DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B)表达之间的相关性。方法:检测肝癌患者癌组织、癌旁组织和肝硬化组织中p16基因的异常甲基化状态及p16、DNMTs基因mRNA的表达水平;采用甲基化特异性PCR技术检测甲基化状态,荧光定量技术检测mRNA的表达。结果:p16基因在肝癌组织、肝硬化组织和癌旁组织中的甲基化率分别为70.5%(31/44)、37.1%(13/35)和9.1%(4/44),肝癌组织和肝硬化组织中的甲基化改变与癌旁组织比较差异有统计学意义,P<0.01。31例甲基化阳性组织中17例p16基因表达降低或缺失,13例甲基化阴性组织中2例基因表达降低或缺失,甲基化阳性与阴性的p16基因表达水平存在明显差异。癌组织和肝硬化组织中4种DNMT mRNA水平均高于相应癌旁组织。其中DNMT1、DNMT3A和DNMT3BmRNA的表达水平差异有统计学意义,DNMT1:P值分别为0.009和0.020;DNMT3A:P值分别为0.005和0.010;DNMT3B:P值分别为0.039和0.036。DNMT2mRNA的表达水平虽然高于相应癌旁组织,但差异无统计学意义,P值分别为0.120和0.350。DNMT1、DNMT 3A和DNMT3B的表达与p16甲基化有相关性,P值分别为0.013、0.025和0.041。结论:p16基因甲基化是肝癌的早期、频发事件,其改变是其基因表达下降甚至失活的重要原因。DNMTs活性的改变可能促进p16基因的异常甲基化。     

亚砷酸诱导人鼻咽癌细胞中p16基因表达的研究

目的 研究亚砷酸( As2O3)诱导鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)CNE- 2Z细胞株中抑癌基因p16的表达.方法 体外培养的CNE-2Z细胞分别加入不同浓度的亚砷酸,并作用于不同时间.用终浓度为2μmol/L、1 μmol/L、0.5μmol/L的As2O3加入鼻咽癌CNE-2...     

5-氮-2'-脱氧胞嘧啶对U266细胞系P16基因去甲基化作用研究

  目的 探讨5-氮-2'-脱氧胞嘧啶（5-Aza-CdR）诱导骨髓瘤细胞系U266 p16基因 DNA 5′CpG岛去甲基化作用及对U266细胞增生的影响。方法 采用巢式甲基特异性PCR法（n-MSP）、DNA序列分析、RT-PCR、细胞生长曲线、流式细胞仪DNA含量分析法检测5-Aza-CdR对U266细胞 p16基因去甲基化作用及其对U266细胞的生长、增生及细胞周期的影响。结果 （1）5-Aza-CdR能够逆转U266细胞 p16 基因异常甲基化；（2）5-Aza-CdR能激活p16基因沉默的再转录；（3）5-Aza-CdR能下调U266细胞甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B 的表达并呈浓度依赖性；（4）5-Aza-CdR作用的U266细胞被阻滞于G0 ~ G1期。结论 5-Aza-CdR可能通过抑制甲基转移酶直接对p16 基因去甲基化，逆转U266 细胞DNA 异常甲基化，并有效地激活因高甲基化所致p16基因沉默的再转录     

马钱子碱经死亡受体途径诱导人类多发性骨髓瘤U266细胞凋亡

 目的　探讨马钱子碱诱导人类多发性骨髓瘤U266细胞凋亡的机制。方法　通过MTT法、流式细胞仪、RT-PCR法检测及形态学观察马钱子碱诱导人类多发性骨髓瘤U266细胞株凋亡的途径。结果　马钱子碱诱导U266的凋亡呈时间和浓度依赖性,48 h IC50 0.16 mg／ml。Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察到明显的凋亡小体。Rhodamine 123染色后流式细胞仪检测马钱子碱不同浓度下线粒体膜电位的变化,差异无统计学意义（P＞0.05）。RT-PCR检测到马钱子碱作用12、24、48 h后Caspase-3表达量增加,其灰度值（0.2597±0.020）、（0.5488±0.016）、（0.6205±0.006）、（0.6533±0.009）（P＞0.05）;加入Caspase-8与Caspase-9的特异抑制剂z-IETD-fmk、z-LEHD-fmk后检测Caspase-3的表达变化,其灰度值分别为（0.7118±0.006）、（0.2637±0.003）（P＜0.01）;（0.7182±0.004）、（0.7195±0.003）（P＝0.836）,示Caspase-8被激活。结论　在0.4 mg／ml浓度范围内,马钱子碱具有诱导U266细胞凋亡作用,激活Caspase-8经死亡受体途径诱导U266细胞株凋亡。     

亚砷酸对多发性骨髓瘤及p38通路的作用

多发性骨髓瘤（MM）是B细胞分化终末阶段的恶性血液病。尽管新药的研发和应用明显地提高了MM的治疗效果,但是复发、耐药等的频繁发生使得MM仍不可治愈。目前应用亚砷酸治疗MM受到广泛关注。亚砷酸可通过多种分子机制产生抗MM的效应,且其单药及联合方案均得到一定效果。但是,治疗过程中耐药性的产生较大地削减了亚砷酸的治疗效应,而近来研究显示p38通路的活化在亚砷酸引发的骨髓瘤细胞耐药性中发挥至关重要的作用。因此,本文就亚砷酸抗MM机制及p38通路在其中的作用进行综述,以期提高亚砷酸治疗MM的效果,为MM的治疗提供新的思路。     

三氧化二砷诱导骨髓瘤细胞SOCS-1基因去甲基化及其对P—STAT3蛋白表达的影响

目的探讨三氧化二砷（AS2O3）对多发性骨髓瘤（MM）细胞内细胞因子信号转导抑制因子-1（SOCS-1）基因甲基化状态的影响及其对磷酸化的信号转导与转录激活因子-3（P．STA33）表达的影响。方法采用甲基特异性PCR法检测AS2O3作用前后MM细胞株U266和CZ-1细胞内SOCS-1基因的甲基化状态,应用蛋白免疫印迹法检测AS2O3处理前后细胞内P—STAT3蛋白的表达变化,并采用流式细胞技术检测AS2O3作用前后MM细胞增殖和凋亡的变化。结果MM细胞株内SOCS-1基因存在程度不同的甲基化状态,与对照组相比,AS2O3作用后MM细胞内SOCS-1基因甲基化程度明显减弱或消失,P—STAT3蛋白的表达也明显减弱,同时细胞生长受抑,凋亡比率升高。AS2O3浓度分别为0、0．5、1．0、2．0μmol／L时,U266细胞株的总凋亡率分别为0．06％、0．56％、48．96％、61．07％（x2=9．19,P〈0．05）;而CZ-1细胞株的总凋亡率分别为4．20％、40．30％、47．72％、68．49％（X2=8．96,P〈0．05）。结论AS2O3可能通过诱导MM细胞内SOCS-1基因去甲基化作用,进-步抑制细胞增殖信号Janus激酶（JAK）-STAT通路的活化,从而诱导MM细胞的凋亡。     

三氧化二砷诱导骨髓瘤细胞SOCS-1基因-去甲基化及其对P-STAT3蛋白表达的影响

 目的 探讨三氧化二砷（AS₂O₃) 对多发性骨髓瘤 (MM) 细胞内细胞因子信号转导抑制因子-1（SOCS-1）基因甲基化状态的影响及其对磷酸化的信号转导与转录激活因子-3（P-STAT3）表达的影响。方法 采用甲基特异性PCR法检测AS₂O₃作用前后MM细胞株U266和CZ-1细胞内 SOCS-1基因的甲基化状态,应用蛋白免疫印迹法检测AS₂O₃处理前后细胞内P-STAT3蛋白的表达变化,并采用流式细胞技术检测AS₂O₃作用前后MM细胞增殖和凋亡的变化。结果 MM细胞株内SOCS-1基因存在程度不同的甲基化状态,与对照组相比,AS₂O₃作用后MM细胞内SOCS-1基因甲基化程度明显减弱或消失,P-STAT3蛋白的表达也明显减弱,同时细胞生长受抑,凋亡比率升高。AS₂O₃浓度分别为0、0.5、1.0、2.0 μmol/L时,U266细胞株的总凋亡率分别为0.06%、0.56%、48.96%、61.07%（χ²=9.19,P<0.05）;而CZ-1细胞株的总凋亡率分别为4.20%、40.30%、47.72%、68.49%（χ²=8.96,P<0.05）。结论 AS₂O₃可能通过诱导MM细胞内SOCS-1基因去甲基化作用,进一步抑制细胞增殖信号Janus激酶（JAK）-STAT通路的活化,从而诱导MM细胞的凋亡。     

多发性骨髓瘤患者原代细胞与U266细胞株zeste基因增强子同源物2表达升高的初步研究

 目的　探讨多发性骨髓瘤（MM）U266细胞株和MM患者的骨髓单个核细胞（BMMNC）中DNA甲基化相关蛋白zeste基因增强子同源物2（EZH2）的表达,分析DNA甲基化与MM的关系。方法　选取MM U266细胞株及10例MM患者BMMNC（MM-BMMNC）,同时选取10名健康人骨髓提取的单个核细胞（N-BMMNC）。用Western blot法测定细胞EZH2的含量,以目的蛋白EZH2与内参照β-actin 表达量的比值作为EZH2蛋白相对表达水平。结果　与10例N-BMMNC（0.2277±0.1306）比较,EZH2在U266细胞（0.9730±0.1029）和10例MM-BMMNC（0.9220±0.1301）中表达明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论　EZH2在MM U266细胞株及MM-BMMNC中含量明显增多,EZH2与MM的发生和发展机制可能有密切联系。     

三氧化二砷联合5-氟尿嘧啶抗人大肠癌细胞的实验研究

 目的 探讨三氧化二砷（As2O3）与5-氟尿嘧啶（5-Fu）联合应用对人大肠癌细胞株CoLo-320的影响及其作用机制。方法 经不同浓度的As2O3和／或5-Fu处理CoLo-320细胞后，采用MTT法测定细胞的增生抑制效应；AO／EB荧光染色、DNA电泳、电镜、流式细胞术观察细胞凋亡、形态学和细胞周期变化；免疫组织化学法观察凋亡相关基因表达的变化。结果 与As2O3或5-Fu单药作用相比，As2O3与5-Fu联合应用可显著增强抑制CoLo-320细胞增生和诱导细胞凋亡作用，联合用药后细胞S期比例均较各单药使用时下降，癌细胞bcl-2基因表达明显下降，Bax和Fas基因表达显著增强。结论 As2O3与5-Fu联合应用具有显著协同抗大肠癌作用，其机制可能与增强诱导大肠癌细胞凋亡、细胞周期特异性药物与细胞周期调控剂联合增效以及调控凋亡相关基因的表达有关。     

三氧化二砷联合环腺苷酸拟似物诱导骨髓瘤细胞凋亡的实验研究

背景与目的：近年来随着新型药物和免疫疗法的成功应用，多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者的缓解率、缓解深度和无病生存率较以往显著提高，然而仍有相当一部分MM患者属于复发/难治性病例。我们的前期研究发现，环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）拟似物和三氧化二砷（arsenic trioxide，As₂O₃）可以抑制MM细胞增殖并诱导其凋亡，成为MM治疗的新途径。该研究进一步探究As₂O₃单独和联合环腺苷酸拟似物8-对氯苯硫基环腺苷酸［8-(4-chlorophenylthio) adenosine 3’, 5’-cyclic monophosphate，8-CPT-cAMP］对MM细胞的影响及可能作用机制。方法：以不同浓度As₂O₃和8-CPT-cAMP单独和联合处理MM细胞系U266细胞，采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）检测其增殖，应用药物联合指数（combination index，CI）分析两药是否存在协同效应，同时采用流式细胞术检测细胞周期和凋亡率，进一步利用蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞凋亡相关蛋白caspase-3和Bcl-2表达的变化。结果：U266细胞经As₂O₃和8-CPT-cAMP单独或联合处理72和120 h后，联合用药组细胞增殖抑制率分别为（18.01±0.13）%和（28.01±0.14）%，明显高于单独用药组［As₂O₃组为（11.35±0.01）%和（16.01±0.14）%，8-CPTcAMP组为（12.26±0.30）%和（15.43±0.23）%，P均<0.05］；但两药联合处理U266细胞的CI值均大于1。联合用药组72和120 h后U266细胞凋亡率分别达到（22.26±0.13）%和（31.03±0.14）%，显著高于单药组［As₂O₃组为（10.06±0.01）%和（12.35±0.14）%，8-CPT-cAMP组为（13.26±0.30）%和（18.76±0.23）%，P均<0.05］。同时联合用药组U266细胞内caspase-3蛋白剪切活化和Bcl-2表达下降。结论：As₂O₃联合8-CPT-cAMP对MM细胞凋亡诱导效应强于单药，但无协同效应。