含信号肽的Mtb8.4/hIL12嵌合基因真核表达质粒的构建及在COS-7细胞中的表达

[目的]克隆结核分枝杆菌含信号肽的Mtb8.4（MS）/hIL12嵌合基因,导入真核表达载体pCI-neo,并在COS-7细胞中进行表达。[方法]首先以pcDNA3.1（＋）-含信号肽的Mtb8.4（pMS）为模板,经聚合酶链反应（PCR）扩增出MS-linker基因,与pCI-neo载体进行连接重组,构建成pCI-neo-MS-linker（pMSL）重组质粒,然后以pORF-hIL12质粒为模板,经PCR扩增出hIL-12基因,将hIL-12基因与pMSL质粒进行连接重组,构建成MS/hIL12嵌合基因真核表达质粒,用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列测定等多种分子生物学方法进行鉴定;重组嵌合质粒转染COS-7细胞后,用RT-PCR方法鉴定MS/hIL12嵌合基因在转录水平的表达情况。[结果]MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒经证实构建成功;转染COS-7细胞后,MS/hIL12嵌合基因在转录水平成功表达。[结论]MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒的成功构建及在COS-7细胞中的成功表达,为进一步研究其免疫保护效果及制备结核病MS/hIL12嵌合基因疫苗奠定了基础。     

结核杆菌含信号肽的Mtb8．4真核表达质粒的构建及鉴定

目的 对结核杆菌新抗原一带信号肽的Mtb8．4(MS)进行基因克隆，构建其真核表达质粒并加以鉴定。方法 采用聚合酶链反应(PCR)从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中扩增出带信号肽的Mtb8．4(MS)目的基因，经HindⅢ和EeoR Ⅰ消化后，与pcDNA3.1( )载体进行连接重组。结果 pcDNA3．1( )-MS真核表达质粒构建完成后，用限制性内切酶消化、PCR及DNA测序等多种方法进行鉴定，证实其构建成功。结论pcDNA3．1( )-MS真核表达质粒的成功构建，为进一步研究该质粒的免疫保护效果，了解信号肽序列在MS蛋白表达和分泌过程中所起的作用及制备相应的结核病DNA疫苗奠定了基础。     

结核杆菌含信号肽的Mtb8.4真核表达质粒的构建及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆结核杆菌含信号肽的Mtb8．4(MS)基因，导入真核表达载体pcDNA3．1( )，构建成重组质粒pcDNA3．1( )-MS，并在真核细胞中进行表达。方法：提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR圹增，获得含信号肽的Mtb8．4(MS)基因后，与pcDNA3．1( )载体进行连接重组，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定；重组质粒转染COS-7细胞48h后，用RT—PCR方法鉴定MS在转录水平的表达情况。结果：pcDNA3．1( )-MS真核表达载体构建成功；转染COS-7细胞后，MS在转录水平成功表达。结论：pcDNA3．1( )-MS真核表达质粒的构建以及MS在COS-7细胞中的成功表达，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3．1( )-MSDNA疫苗奠定了基础。     

HBV S基因与HCV C基因嵌合真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建含HBV S基因及HCV C基因的嵌合基因真核表达质粒，为HBV和HCV嵌合基因疫苗研究奠定基础。方法：PCR扩增分别获得HBV preS1 preS2、preS2 S、S基因片段及HCV C基因片段，以pcDNA3．1( )为载体，构建同时含HBV preSl preS2 S、preS2 S或S基因与HCV C区基因的嵌合真核表达质粒S1S2SCpcDNA3．1、S2SCpcDNA3．1、SCpcDNA3．1。结果：经酶切鉴定及测序分析，所构建的嵌合表达质粒均连接正确，与预计一致。结论：嵌合基因真核表达质粒的成功构建，将为观察嵌合基因免疫及HBV、HCV基因疫苗的研究提供实验基础。     

白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3．1／SAP2的构建

目的构建白假丝酵母菌天冬氨酸蛋白酶真核表达质粒pcDNA3．1／SAP2．为以其作为基因疫苗进行免疫动物实验奠定物质基础。方法从白假丝酵母菌中提取基因组DNA，以其为模板采用聚合酶链反应（PCR）法获取SAP2基因，将真核表达质粒pcDNA3．1（＋）myc-HisC和SAP2基因行EcoRI和XhoI双酶切，琼脂糖凝胶纯化，连接酶切产物，转化TOP10感受态细菌，筛选菌落和测序鉴定。结果经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计相同，并定向插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）myc-HisC，电泳获得预期的SAP2条带,测序证实为正确的SAP2序列。结论利用真核表达质粒pcDNA3．1（＋）myc-HisC可以方便而高效地构建pcDNA3．1／SAP2重组质粒，该质粒能直接激活抗原提呈细胞，可以使重组质粒具有较强的免疫原性和免疫反应性。     

鸭乙型肝炎病毒聚合酶结合模拟肽真核表达载体的构建

目的：构建与鸭乙型肝炎病毒聚合酶(DHBV P)特异性结合的模拟肽的重组真核表达质粒，为进一步将重组质粒转染原代培养鸭肝细胞研究模拟肽的作用奠定基础。方法：以噬菌体肽库中筛选出来的能特异性结合DHBV P的模拟肽基因为模板，扩增模拟肽基因片段，并应用基因重组技术构建其真核表达载体pEGFP-N1-模拟肽基因(pEGFP-N1-M)。结果：经鉴定，目的基因片段以正确的方向插入载体pEGFP-N1中，序列正确，对码正确。结论：成功构建了重组真核表达质粒pEGFP-N1-M。     

潜伏活性的人可溶性TNFⅠ型受体融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：采用基因工程技术，将转化生长因子B前体相关蛋白（LAP）通过基质金属蛋白酶（MMP）水解部位与人可溶性TNFI型受体（hsTNFRI）连接，构建pcDNA3，1／LAP-MMP-hs TNFRI融合蛋白真核表达载体，获得LAP-MMP-hsTNFRI融合蛋白。方法：将编码MMP水解部位氨基酸的正反义DNA序列退火形成互补双链后定向克隆插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），得到pcDNA3．1／MMP重组体；将TGF-β1的LAP段和hsTNFRI与MMP水解部位连接，获得pcDNA3．1／LAP-MMP-hsTNFRI真核表达载体。测序鉴定后，脂质体介导重组质粒转染COS-7细胞，通过RT-PCR检测融合基因的表达。结果：酶切及测序结果证实pcDNA3．1／LAP-MMP-hsTNFRI重组载体构建成功，转染后RT-PCR结果表明重组质粒在COS-7细胞中得到有效表达。结论：成功构建了融合蛋白真核表达载体pcDNA3，1／LAP-MMP-hsTNFRI，并获得融合基因的瞬时表达，为进一步研究融合蛋白在子宫内膜异位症中的靶向治疗奠定了实验基础。     

卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒构建与表达

[目的]构建大鼠源卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒,进行表达。[方法]以卡氏肺孢子虫DNA为模板,应用PCR扩增MSG基因片段,连接至pGEM-T Easy载体,再克隆至PCDNA3.1( )载体。构建的重组表达质粒经酶切、PCR鉴定后转染至COS-7细胞,并进行大量增殖。RT-PCR验证转染基因的表达。[结果]重组表达质粒PCDNA3.1( )/MSG经酶切及PCR鉴定结果表明构建成功。RT-PCR结果显示MSG基因片段成功转染至COS-7细胞,并在其中进行基因表达。[结论]成功构建了PCDNA3.1( )/MSG重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究打下基础。     

人类免疫缺陷病毒I型Tat真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人类免疫缺陷病毒Tat基因真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞中的有效表达。方法以含有HIV-1全长基因的质粒pNL4-3为模板,通过PCR扩增HIV-1 Tat第一外显子,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入huh-7细胞。RT-PCR检测其基因转录情况,Western Blot鉴定其是否能够表达相应的目的蛋白质。结果成功扩增了Tat基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1-tat,RT-PCR和Western blot方法证实该质粒能在huh-7真核细胞中有效表达HIV-1 Tat目的蛋白质。结论成功构建了HIV-1 Tat基因的真核表达质粒载体,并在huh-7中表达,为在huh-7细胞模型中研究Tat的功能奠定了基础。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型gD糖蛋白在真核细胞中的表达

目的：构建真核表达质粒pcDNA3／gD，并在体外COS-7细胞中进行表达。方法：体外PCR扩增出gD糖蛋白基因，克隆入真核表达质粒pcDNA3中。PCR、酶切和测序证实插入的gD基因正确后，转染COS-7细胞，用原位ELISA鉴定表达蛋白。结果：构建了pcDNA3／gD真核表达质粒，经原位ELISA证实，转染，COS-7细胞表达的gD蛋白能和gD单克隆抗体ID3和DL11结合，证明该蛋白具有天然gD蛋白的抗原性。结论：柯建的重组真核表达质粒pcDNA3／gD能够在COS-7细胞中表达。     

人乳头瘤病毒11型L1 DNA疫苗质粒的构建和鉴定

目的:构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)L1DNA疫苗质粒。方法:从尖锐湿疣病变组织中提取DNA制备模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HPV11-L1基因,将L1基因经双酶切后克隆到pcDNA3 1(+)中,测序鉴定。结果:从病变组织中扩增出了全长HPV11-L1基因,并正向插入表达载体pcDNA3 1(+)中,转化JM109扩增后经酶切和测序鉴定,证实克隆成功。结论:HPV11-L1DNA疫苗质粒的构建为今后进行防治尖锐湿疣的动物实验和临床实验奠定了基础。     

人乳头瘤病毒11型E7与共刺激分子CD80嵌合DNA疫苗质粒的构建及鉴定

目的:构建人乳头瘤病毒11型(HPV ll)E7与共刺激分子CDS0嵌合DNA疫苗质粒。方法:从尖锐湿疣病变组织中提取DNA制备模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HPV ll-E7基因,经双酶切后定向克隆到pcDNA3.1(+)中,获得pcDNA3.1(+)/HPV llE7,测序鉴定后,再用PCR方法扩增去除终止密码子的E7基因片段,按上述方法插入质粒pcD-NA3.1(+)/CD80中CD80上游,构建pcDNA3.1(+)/HPV llE7-CD80融合基因真核表达质粒。结果:去除终止子的E7基因片段成功正向插入CD80上游,双向测序分析显示序列无误,pcDNA3.1(+)/HPV llE7-CD80嵌合真核表达质粒构建成功。结论:HPV ll-E7/CD80嵌合DNA疫苗质粒构建成功,为研究该疫苗在尖锐湿疣防治中的作用奠定了基础。     

结核杆菌Edman株Ag85C基因的克隆表达与鉴定

目的克隆人结核杆菌Ag85C基因并在大肠杆菌中表达,研究其对结核病预防和治疗过程中的免疫保护作用。方法设计一对特异性引物,PCR扩增人结核杆菌Edman株Ag85C基因开放阅读框并定向克隆到原核表达载体pQE30,通过酶切、PCR和测序鉴定重组质粒,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组蛋白。结果构建了pQE30-Ag85C重组质粒;在大肠杆菌中表达了一分子量约30kDa的重组蛋白。结论重组质粒pQE30-Ag85C构建成功并在大肠杆菌中高效表达,为Ag85C保护性抗原位点分析和新型疫苗的研制奠定了基础。     

人乳腺珠蛋白基因疫苗的构建及其免疫原性研究

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因重组质粒pcDNA3.1-hMAM,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序后克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM。将重组载体脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA检测目的基因的表达。结果:成功扩增hMAM基因,酶切测序表明,重组质粒含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM基因疫苗构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因的克隆及序列分析

目的 获取淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因(porB)并构建其重组表达质粒。方法 根据porB已知序列，设计合成一对引物，用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出porB基因片段，克隆到原核表达质粒pQE30中，转化大肠埃希菌M15感受态细胞，经酶切和PCR鉴定，然后进行测序。结果 porB基因体外扩增产物大小约为911bp。重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明为正确重组子，测序结果与已知序列基本吻合。结论 成功克隆了淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因，为下一步PorB蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌蛋白质疫苗的研制提供了基本的物质基础：     

结核杆菌HSP65与IL—12多价DNA疫苗的构建

[目的]构建结核杆菌H37RV株HSP65基因与IL-12基因的共表达载体pVIVO2-HSP65-IL-12,并研究其在Vero—E6细胞内表达的可行性,为新一代结核多价DNA疫苗寻找理论依据。[方法]采用PCR技术,从培养的结核杆菌H37RV中抽提HSP65基因,克隆到pVIVO2-MCS上的一个多克隆位点,构建pVIVO2-HSP65,将质粒pORF—IL-12上的IL-12基因经双酶切后,亚克隆到pVIVO2-HSP65上,构建成共表达载体pVIVO2-HSP65-IL-12。并经XbaⅠ／AvrⅡ和NcoⅠ／NheⅠ进行双酶切和测序鉴定;用间接免疫荧光法（IFA）检测HSP65和mIL-12基因在Vero—E6细胞中的表达。[结果]双酶切和测序分析证明HSP65基因和mIL-12基因成功克隆到pVIVO2-MCS上,且方向正确,序列无突变;间接免疫荧光试验结果为阳性。[结论]共表达载体pVIVO2-HSP65-IL-12构建成功,且pVIVO2-HSP65-IL-12可在Vero—E6细胞中获得共表达。     

结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3-Rv3873，并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆至原核载体pGEx-4T-1中，经测序鉴定后，将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建重组子pcDNA3．1-Rv3873，通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100％，限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3．1（＋）中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体，为进—步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。     

重组结核分枝杆菌特异性分泌抗原融合蛋白的活性鉴定及初步应用

目的：融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10，研究其免疫学特性，为结核病的血清学诊断提供物质基础。方法：将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c（＋）中，构建pET32c（＋）-linker。PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因。将CFP10克隆入改建的载体pET32e（＋）的linker前，ESAT-6克隆入linker后，构建CFP10-ESAT-6融合基因；或将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c（＋）的linker前，CFP10克隆入linker后，构建ESAT-6-CFP10融合基因，分别转化大肠杆菌XL1-blue，抽提质粒，酶切鉴定；在大肠杆菌B121中表达，通过Western blot分析其抗原性。结果：两个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c（＋）的linker前或后。重组质粒pET32c（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。融合蛋白在B121菌中高效表达。Western blot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。结论：成功地构建了多抗原基因DNA质粒；pET32e（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10质粒在B121菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白，该蛋白兼具CFP10和ESAT-6两种蛋白的抗原性。本研究为rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白在结核病血清学诊断中应用奠定了基础。     

淋病奈瑟菌孔蛋白PIA真核表达系统的构建及序列分析

目的:构建淋病奈瑟菌孔蛋白PIA(Porin IA)基因的真核表达系统,为淋病DNA疫苗的研究提供材料。方法:PCR技术扩增淋病奈瑟菌捷克标准株的PIA基因片段,将其定向插入真核表达载体pC I-neo多克隆位点中,构建重组表达载体。并用酶切分析、PCR扩增及序列测定方法,对重组载体进行鉴定。结果:淋病奈瑟菌PIA基因被正确克隆到真核表达载体pC I-neo中,测序结果与Genebank中AF090819等菌株序列有99.99%同源性。结论:真核表达系统(pC I-PIA)构建成功。     

沙眼衣原体D型MOMP基因原核表达载体的构建及序列分析

目的:构建沙眼衣原体D型MOMP基因的原核表达载体,为沙眼衣原体基因工程疫苗的研究提供材料。方法:PCR技术扩增D型沙眼衣原体标准株的MOMP基因片段,将其定向插入原核表达载体pRSET多克隆位点中,构建重组表达载体。并用酶切分析、PCR扩增及序列测定方法对重组载体进行鉴定。结果:沙眼衣原体MOMP基因被正确克隆到原核表达载体pRSET-A中,测序结果与Genebank中AF279589等菌株序列有99.99%同源性。结论:原核表达载体pRSET-MOMP构建成功。