锂-匹鲁卡品诱导癫痫持续状态大鼠海马神经元线粒体及细胞核的变化

BACKGROUND： Mitochondrial damage plays a key role in neuronal damage. OBJECTIVE： To observe ultrastructural damage to mitochondria and nuclei, as well as caspase-3 expression, in hippocampal CA3 neurons of lithium-pilocarpine-induced status epilepticus rats. DESIGN, TIME AND SETTING： The neuropathological, randomized, controlled study was performed at the Animal Experimental Center, Shandong University, China in May 2008. MATERIALS： A total of 75 healthy, adult, male, Wistar rats were randomly assigned into model （n = 45） and control （n = 30） groups. Lithium-pilocarpine （Sigma, USA） was used in this study. METHODS： Rats in the model group were intraperitoneally injected with lithium chloride （3 mEq/kg）, and 24 hours later with pilocarpine （45 mg/kg）, to induce seizures for 2 hours. Rats in the control group were intraperitoneally infused with the same volume of saline. Rat hippocampal CA3 tissue was obtained at 3, 12, and 24 hours following status epilepticus. MAIN OUTCOME MEASURES： Neuronal changes were observed under an optical microscope. Ultrastructural changes in mitochondria and nuclei were observed using an electron microscope. caspase-3 mRNA levels were quantified by semiquantitative RT-PCR. RESULTS： After 3 hours of status epilepticus, mitochondria with swollen cristae and ruptured membranes were observed by electron microscopy. Nuclei with marginated chromatin were observed after 24 hours status epilepticus. RT-PCR results demonstrated increased caspase-3 expression at 12 hours, and significantly increased expression at 24 hours following termination of status epilepticus. This was in accordance with acidophilia occurrence, as indicated by hematoxylin-eosin staining, and time of ultrastructural damage to nuclei. CONCLUSION： In lithium-pilocarpine-induced status epilepticus rat models, ultrastructural damage to mitochondria in hippocampal neurons occurred during early stages, followed by increased caspase-3 expression and nuclear changes. These results suggested that mitochondrial damage plays a key role in neuronal damage following status epilepticus.     

癫痫大鼠海马神经元和星形胶质细胞的病理演变

目的　探讨癫痫大鼠海马神经元和星形胶质细胞在点燃后各期的病理特点、时序及机制。方法　针对匹罗卡品癫痫大鼠模型,行Nissl、免疫组化和HE染色,观察海马神经元及星形胶质细胞的病理变化。结果　癫痫持续状态后超急性期（4h）,CA3区神经元呈嗜酸性变性、胞浆深染;急性期（24h）,嗜酸性变性最为显著,神经元固缩、核仁消失、突起断裂,星形胶质细胞水肿;缄默期（7d）,CA3、CA1区及门区神经元大量坏死、脱失,胶质增生肥大,海马构筑紊乱;慢性期（6w）,CA3、CA1区出现胶质瘢痕,遗有形态正常的神经元,且颗粒细胞层增厚。结论　癫痫时海马神经元先于星形胶质细胞发生病理改变,二者均参与癫痫发生。     

米诺环素对癫痫大鼠海马小胶质细胞的抑制作用

目的探讨米诺环素对癫痫大鼠海马小胶质细胞的抑制作用。 方法将40只雄性SD大鼠按随机数字表法分为4组：生理盐水组、青霉素组、米诺环素治疗组和米诺环素预处理组,每组各10只。大鼠腹腔注射青霉素G 740万～760万单位/kg以建立大鼠癫痫模型。免疫荧光组织化学技术检测大鼠造模后第1、3天海马小胶质细胞免疫反应性,Western blotting检测海马肿瘤生长因子-α(TNF-α)蛋白表达情况。 结果(1)癫痫发作可激活小胶质细胞。与青霉素组比较,大鼠癫痫发作后第1、3天米诺环素治疗组、米诺环素预处理组海马小胶质细胞活化、增生受抑制,差异均有统计学意义（P≤0.05）,且米诺环素预处理组抑制性更突出。(2)大鼠癫痫发作后第1、3天青霉索组、米诺环素治疗组、米诺环素预处理组TNF-α蛋白表达水平明显高于生理盐水组,差异均有统计学意义(P≤0.05);与青霉素组比较,米诺环素治疗组、米诺环素预处理组TNF-α蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(P≤0.05),且以米诺环素预处理组更明显。 结论米诺环素可有效抑制癫痫大鼠海马小胶质细胞活化、增生和炎症因子TNF-α的释放。     

APETX2对氯化锂-匹鲁卡品诱导痫性发作大鼠的影响及机制探究

目的 探索APETX2对氯化锂-匹鲁卡品诱导痫性发作大鼠的行为学影响及可能的机制。方法 成年雄性SPF级SD大鼠18只,侧脑室置管后随机分为:癫痫组(9只)、APETx2组(9只),癫痫造模后观察2组癫痫大发作潜伏期及发作强度; APETx2处理原代培养海马神经元,动态观察其对钙成像的影响。结果 APETx2组的SD大鼠癫痫潜伏期延长,大发作程度减轻; APETx2处理原代培养海马神经元钙内流下降。结论 APETx2可抑制氯化锂-匹鲁卡品诱导SD大鼠痫性发作,减少酸诱导海马神经元钙离子浓度增加可能为机制之一。     

二硫代氨基甲酸吡咯烷对实验性脑出血血肿周围脑组织含水量及水通道蛋白-9表达的影响

目的探讨二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)对实验性脑出血血肿周围脑组织含水量和水通道蛋白9(AQP9)表达的影响。方法将128只SD大鼠随机分成正常组、对照组、脑出血组及PDTC组,建立脑出血模型;制模2 h予PDTC组腹腔注射PDTC;通过干湿法和SABC法检测各组大鼠各时点脑组织含水量、AQP9表达。结果(1)脑出血组脑组织含水量出血侧在制模后4 h开始升高,72 h达高峰,持续到120 h后下降;出血对侧在4 h也升高,48 h达高峰;脑组织含水量较对照组明显增加,出血侧更明显(均P<0.01)。(2)脑出血组AQP9表达制模后4 h开始升高,72 h表达最强,120 h降低,较对照组明显增加,出血侧较出血对侧增加更明显(均P<0.01)。(3)PDTC组脑组织含水量和AQP9表达在制模后24 h开始各时间点较脑出血组明显降低(均P<0.01)。结论脑出血后脑组织含水量和AQP9表达均呈平行增加,PDTC干预对出血后脑组织含水量和AQP9表达有平行抑制作用,提示AQP9参与了脑出血后脑水肿的形成。     

EAAT2过表达对匹鲁卡品诱导小鼠癫痫持续状态模型的保护作用

目的 研究兴奋性氨基酸转运体2(EAAT2)过表达对癫痫发作及SE诱导的海马神经元死亡的作用.方法 实验采用野生型或者EAAT2转基因FVB/N小鼠,腹腔注射匹鲁卡品诱导癫痫持续状态(SE).SE后3 d,取脑、固定、切片,进行EAAT2、生长抑素的免疫组化染色以及甲酚紫染色,分别对海马CA1和齿状回门区阳性神经元进行计数.结果 与野生型动物相比,EAAT2在转基因小鼠海马中表达显著增加.野生型小鼠达到SE或者死亡所需的总匹鲁卡品剂量为344±40.3mg/kg,,而EAAT2转基因小鼠达到同等效应所需剂量为657±119.9 mg/kg,显著高于野生型所用剂量(P＜0.05).SE后3 d,野生型小鼠海马CA1区锥体细胞层神经元相对数量为0.56,而转基因动物中为0.9,显著高于野生型动物(P＜0.05).同时,野生型和转基因小鼠癫痫后齿状回门区中间神经元相对数量分别为0.11和0.67,转基因组数量显著高于野生型组(P＜0.05).野生型小鼠癫痫后齿状回门区生长抑素阳性神经元数量为0,但是,在EAAT2转基因小鼠,数量为0.4,显著高于野生型(P＜0.05).结论 EAAT2过表达对SE产生及其诱导的神经元死亡具有显著保护作用.过表达的EAAT2可能通过加强细胞外谷氨酸转运而调控其兴奋毒性.     

氯化锂预处理时间的改变对锂-匹鲁卡品诱导大鼠痫性发作的影响

目的在锂-匹鲁卡品癫痫大鼠模型中探讨氯化锂的预处理时间的最佳变化范围.方法改变氯化锂的预处理时间表,观察其对大鼠痫性发作、潜伏期、痫性发作的程度和致死率的影响,同时行组织学观察.结果当氯化锂预处理时间范围在2～24 h内变化时,大鼠痫性发作率为100%,并且氯化锂的预处理时间与大鼠痫性发作的程度呈线性关联(P＜0.0001);当氯化锂提前48和72 h时,大鼠的痫性发作率下降到40%和0.结论根据试验需要和条件可以选择合适的氯化锂预处理时间(在2～24 h之间)来诱导相应的癫痫大鼠模型.     

单剂量匹罗卡品诱导小鼠癫痫及其海马神经损伤的研究

目的 探索不同剂量匹罗卡品单次腹腔注射对诱发小鼠癫痫及对海马损伤的影响,为癫痫建模提供参考。方法将100只健康的C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、3个不同剂量匹罗卡品(250 mg/kg、290 mg/kg、350 mg/kg)腹腔注射组。比较3组的建模成功率、死亡率,通过免疫组化染色观察神经元和胶质细胞的数量变化,分析海马区组织的病变情况。结果 匹罗卡品250 mg/kg组小鼠的Racine评分4级以上发作率为12%,无死亡; 290 mg/kg组小鼠的4级以上发作率为70%,死亡率为32%; 350 mg/kg组小鼠的4级以上发作率为86%,死亡率为56%。免疫组化染色结果显示:与正常对照组相比,3个不同剂量匹罗卡品组小鼠诱发癫痫后,神经元数量均显著减少,小胶质细胞和星形胶质细胞数量均显著增加;但250 mg/kg组小鼠的活化小胶质细胞数量无显著变化,而其他两组显著增多。结论 匹罗卡品290 mg/kg单次注射诱发小鼠癫痫模型的成功率较高、死亡率较低,且海马区损伤明显,可以作为癫痫小鼠建模的参考方法。     

高糖诱导大鼠海马神经元细胞模型建立及细胞凋亡的影响

目的通过不同葡萄糖浓度和不同作用时间诱导SD大鼠海马神经元,建立稳定的糖尿病脑病细胞模型,探讨高糖对海马神经元凋亡情况的影响。方法 (1)海马神经元的原代培养及纯度鉴定。(2)最适高糖浓度探索:CCK-8法检测海马神经元各组细胞活性。(3)最适浓度下高糖作用时间的探索:Western blot检测海马神经元细胞Bcl-2、Bax的表达情况。(4)最适浓度和作用时间下,流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果 (1)成功培养海马神经元,神经元细胞经鉴定纯度达85%以上。(2) 45 mmol/L组海马神经元存活率均 80%。(3) 45 mmol/L-48 h为最适作用时间组,细胞内Bcl-2表达下降、Bax表达升高(P 0. 01)。(4)最适高糖组细胞凋亡率显著升高(P 0. 01)。结论高糖浓度为45 mmol/L、作用时间48 h为理想的糖尿病脑病细胞模型,且高糖通过影响Bcl-2、Bax的表达导致海马神经元凋亡率升高。     

匹罗卡品致痫大鼠海马calpain活性变化和其对神经元死亡的影响

目的探讨在匹罗卡品致痫的癫痫持续状态（SE）大鼠模型中,钙蛋白酶在大鼠海马组织中的活性,及钙蛋白酶对神经元坏死、凋亡产生的影响。方法雄性成年wistar大鼠,应用匹罗卡品致痫产生SE后60min后终止发作,24h后取材,行HE染色及tunel染色,观察海马神经元的坏死及凋亡情况,以及western blot检测钙蛋白酶1（μ-calpain）的活性。结果癫痫持续状态后24h,海马组织HE染色神经元数量减少,tunel阳性细胞数增加,钙蛋白酶1出现76ku条带。结论大鼠癫痫持续状态后24h,钙蛋白酶1在海马组织神经元活性增加,海马神经元出现坏死及凋亡。钙蛋白酶1与神经元的死亡存在着正相关。     

癫痫持续发作对大鼠海马神经元的影响

目的 研究实验性癫痫大鼠在癫痫发作持续不同时间对海马神经元的影响。方法24只SD大鼠随机分成4组：诱发火鼠瘢痫持续状态（status cpilepticus，SE）〈10、10～30、〉30min组及正常对照组。于电镜下观察各组海马神经元超微结构变化；采用免疫组化方法检测凋亡相关基因bcl-2、bax的蛋白表达及通过流式细胞技术检测细胞凋亡情况。结果SE〈10min组海马神经元所受影响不大．SE10～30min组海马神经元具有明显凋亡特征．SE〉30min组多数海马神经元呈坏死性改变。结论大鼠SE对海马神经元损伤有凋亡和坏死两种不同形式．这与癫痫发作的持续时间密切相关。     

大鼠海马星形胶质细胞对突触可塑性的影响

目的研究星形胶质细胞在神经系统发育成熟过程中对突触可塑性的调控规律.方法取健康初生、幼年和成年大鼠各10只,每只取脑切片,用免疫组织化学方法观察其海马CA1区的S100、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和P38免疫反应产物强度;HE染色法显示神经元胞体.结果初生大鼠海马CA1区中神经元大量存在,但S100、GFAP和P38表达均少,幼鼠的表达增加,但仍显著少于成鼠的表达(P＜0.01).结论大鼠海马CA1区星形胶质细胞增殖与突触出现时间、突触数目增加及功能成熟有关.     

匹罗卡品诱导癫痫大鼠内源性神经干细胞的可塑性改变

目的探讨匹罗卡品诱导癫痫模型的内源性神经干细胞的增殖、迁移,从而研究癫痫发生后的神经发生及可塑性改变.方法氯化锂和匹罗卡品联合诱导大鼠癫痫模型,分为对照组、癫痫发作后3、7、14、28 d组,用免疫组织化学方法动态检测大鼠海马多唾液酸神经细胞粘附分子(polysiolylated neural cell adhesion molecule,PSA-NCAM)及PSA-NCAM/5-溴脱氧尿苷嘧啶(bromodeoxyuridine,BrdU)的表达.结果与对照组比较,海马齿状回(dentate gyrus,DG)PSA-NCAM及PSA-NCAM/BrdU的阳性细胞在癫痫后3 d开始增加(P＜0.05),14 d达到高峰(P＜0.05),28 d后开始下降,但仍高于对照组(P＜0.05).结论癫痫发生后出现神经干细胞的增殖、迁移,也即出现了神经发生和可塑性改变.     

吡咯烷二硫代氨基甲酸酯预防大鼠脑血管痉挛的实验研究

目的　探讨核转录因子κB(NF κB)活性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯 (PDTC)对大鼠脑血管痉挛预防作用。方法　应用NF κB活性抑制剂PDTC行脑池内注射 ,对 12只蛛网膜下腔出血 (SAH)后脑血管痉挛 (CVS)的大鼠进行处理 ,同时 ,以相同数量的正常大鼠、单纯SAH大鼠和用PBS缓冲液替代PDTC进行处理的大鼠作为对照。结果　PDTC能明显抑制SAH后第 3天大鼠基底动脉血管痉挛的程度 ,其血管腔周径为正常时的 81 3 %± 10 9% ,与注血前相比 ,大鼠的脑血流下降了 10 %± 11% ;而未经处理和用PBS缓冲液对照处理的大鼠基底动脉管腔周径分别为正常时的 49 7%± 7 5 %和 48 6%± 7 8% ,其脑血流分别下降了 3 7%± 9%和3 8%± 11%。进一步检测基底动脉壁细胞间粘附分子 1(ICAM 1)的表达发现 ,PDTC可直接抑制ICAM 1在血管壁的表达。结论　血管的炎症反应是参与SAH后CVS形成和发展的重要因素 ,抑制NF κB的活化代表了一种新的治疗急性炎症的模式 ,它为SAH后CVS的治疗又提供了一种新的观念和途径     

匹罗卡品诱发成年大鼠普遍癫痫与难治性癫痫海马神经发生的变化

背景：神经发生包括细胞增殖、迁移、分化和存活等,是人和多数哺乳动物部分脑区产生新生神经元的过程,主要分布在侧脑室下区和海马齿状回。癫痫可导致海马齿状回的神经发生改变,BrdU是目前公认最理想检测未成熟细胞增殖的标记物之一。 目的：观察匹罗卡品诱发成年大鼠癫痫后神经发生的特点,以及普通癫痫与难治性癫痫神经发生的差异。 设计、时间及地点：随机分组,细胞分子生物学实验,于2006-08/2007-06在华中科技大学同济医学院中心实验室及附属协和医院中心实验室完成。 材料：选用健康Sprague-Dawley雄性大鼠100只,随机分为2组,对照组8只,实验组92只,分为普通癫痫组,自发发作组,难治性癫痫组和非耐药组。匹罗卡品为武汉晶美公司产品,兔抗鼠BrdU抗体为美国sigma公司产品,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为武汉博士德公司产品。 方法：对照组大鼠腹腔注射生理盐水;实验组腹腔注射匹罗卡品15mg/kg,最多注射4次,出现癫痫持续状态的大鼠注射水合氯醛终止发作。致癫大鼠癫痫发作终止后6h腹腔注射BrdU,观察自发发作情况。以脑电图、自发发作频率持续时间,无自发发作为普通癫痫组,有自发发作为自发发作组。行卡马西平灌胃2周并记录发作频率,对卡马西平治疗无效,发作频率减少<50%的为难治性癫痫组,治疗有效即发作频率减少>50%为非耐药组。普通癫痫组分别于注射后第1,2,3,7,14,21和28d取鼠脑海马部做冠状连续切片。非耐药组和难治性癫痫组的大鼠,再次行腹腔注射BrdU,每次为50mg/kg,连续注射4次,每次间隔2h,48h后取脑海马部制作石蜡切片。 主要观察指标：脑海马部切片行免疫组化染色,镜下观察不同时间点BrdU阳性细胞的分布、形态和数量及注射匹罗卡品后大鼠癫痫发作状况。 结果：匹罗卡品第1次注射后所有大鼠无癫痫发作,第2次注射发作16只,第3次注射发作42只,第4次注射后发作11只,14只大鼠4次注射仍无癫痫发作,9只大鼠癫痫持续状态后死亡,77只进入结果分析。神经发生主要位于海马颗粒细胞层和齿状回。与对照组比较,普通癫痫组BrdU阳性细胞明显增多（P<0.01）,难治性癫痫组新生细胞较普通癫痫组明显减少（P<0.01）,神经发生减少。癫痫后第2天BrdU 阳性细胞数目开始增加,14-15d达到高峰,1个月后回到初始水平。 结论：与普通癫痫相比,难治性癫痫可导致神经发生减少。     

红藻氨酸诱发大鼠复杂部分性癫痫发作的海马神经元和星形胶质细胞反应及相互关系

目的：观察大鼠癫痫发作后海鸟内神经元与星形胶质细胞反应变化的时空效应及相互关系。方法：以红藻氨酸诱发的大鼠复杂部分性癫痂发作为模型，利用免疫组织化学法，在原位显示癫痫发作后15、30、60、90、120、180min6个时间点海马神经元Fos蛋白及星形胶质细胞内胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达变化、相互关系及分布规律。结果：致痫后15min海马内GFAP表达开始增多，60min达高峰。Fos阳性神经元在癞痴诱发后30min开始出现，120min达高峰。海马内GFAP阳性细胞与Fos阳性神经元分布规律基本一致。结论：在癫痫病理状态下，海马内星形胶质细胞的反应略早于神经元，两者之间分布呈平行关系，它们之间可能存在着复杂的信息通讯，以复合体的形式其同对各种病理生理刺激作出反应。     

电针对实验性癫痫大鼠海马神经元发生的影响

目的研究电针对实验性癫痫(EP)大鼠海马神经元发生的影响,探讨针刺抗癫痫的机制,为临床实践服务。方法以锂-匹罗卡品制备癫痫模型,电针督脉穴位“大椎”与“百会”,采用疏密波,频率为80Hz,电流强度50mA,时间20min。在6d,13d,27d三个时间点分别腹腔注射2次BrdU,每次间隔2h。所有动物均在最后一次注射BrdU后的24h经左心室灌注处死。取脑后,将脑组织入4%多聚甲醛后固定过夜,再入20%蔗糖4℃冰箱沉底。选择海马部位应用恒冷冰冻切片机冠状位连续切片,脑片漂片厚30μm,行免疫细胞化学染色。结果从13d开始,与未经电针处理的EP鼠比较,经电针处理后的EP鼠海马BrdU阳性细胞数明显减少,且差别有显著性意义(P<0.05)。另外,两组间的反复自发性痫性发作(SRSS)次数亦有显著性差异(P<0.05),经电针处理的EP鼠SRSS次数减少。结论电针可减少SRSS次数并抑制神经元的发生。推测电针的抑痫作用是通过抑制SE后的SRSS而减少神经元的发生。     

小胶质细胞和星形胶质细胞及其相互作用对癫痫发生影响的研究进展

癫痫以自发性复发性癫痫发作为特征,导致患者长期生活在不可预测的疾病压力中,严重降低患者的生活质量.目前已有大量的抗癫痫药物用于治疗癫痫,但其仅能控制癫痫发作,而不能阻止癫痫发生.在癫痫发生过程中,小胶质细胞与星形胶质细胞的相互作用可能形成一个前馈的炎症回路,并与癫痫发作相互促进,形成促进癫痫发生和导致癫痫进展的恶性循环...