利用比较基因组学研究河弧菌和霍乱弧菌在阿拉伯糖代谢试验中不同表型的分子遗传基础

目的利用比较基因组学研究河弧菌与霍乱弧菌阿拉伯糖发酵实验差异的分子遗传机制。方法比较河弧菌EF85003和霍乱弧菌N16961在以L-阿拉伯糖或葡萄糖为单一碳源的M9培养基中的生长曲线。对河弧菌EF85003进行基因注释,预测阿拉伯糖操纵子区域,利用比较基因组学两两比较河弧菌EF85003、弗尼斯菌NCTC11218和霍乱弧菌N16961序列。结果河弧菌EF85003可在以L-阿拉伯糖或葡萄糖为单一碳源的M9培养基中生长,而霍乱弧菌N16961仅在以葡萄糖为单一碳源的M9培养基中生长。比较基因组学研究发现河弧菌EF85003序列中VFL-003620基因至VFL-003628基因为阿拉伯糖操纵子区域,而霍乱弧菌N16961全基因组序列中不含完整的阿拉伯糖操纵子。结论河弧菌EF85003基因组上存在阿拉伯糖操纵子区域,霍乱弧菌N16961基因组序列中不含完整的阿拉伯糖操纵子,造成了河弧菌EF85003和霍乱弧菌N16961在阿拉伯糖发酵实验中的不同表型。     

沈阳市副溶血弧菌重复序列PCR分型

目的 探讨重复序列PCR对临床分离株副溶血弧菌进行分型的可行性;从分子水平了解沈阳市流行的副溶血弧菌菌型特征.方法 利用基因外重复回文序列-PCR(PEP-PCR)和肠细菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)对40株临床分离副溶血弧菌基因组DNA进行扩增,对扩增的DNA电泳指纹图谱进行分型分析.结果 40株副溶血弧菌呈现不同程度的基因多态性.基因外重复回文序列-PCR分辨力指数可达到0.953,40株菌株分为16个型,优势菌型为G型,占总菌数的20.0%.肠细菌基因间共有重复序列-PCR分辨力指数为0.5;40株菌株可分为4个型,优势菌型为D型,占总菌数的67.5%.结论 重复序列PCR可以用于副溶血弧菌临床分离株的分子分型研究,其分型敏感程度优于血型分型.     

MPCR检测食品中霍乱弧菌和副溶血性弧菌的研究

目的建立一种快速、敏感的方法,用于检测食品中O1群(EVC)、O139群霍乱弧菌和副溶血性弧菌。方法针对霍乱弧菌O139特异基因(T139)、肠毒素A亚单位基因(ctxA)、毒力协调A亚单位基因(tcpA),副溶血性弧菌热稳定性直接溶血素基因(tdh)为靶序列,建立MPCR检测方法,相应扩增片段依次为417bp、564bp、471bp和202bp。结果用该方法对EVC、O139VC、副溶血性弧菌的标准菌株和野生株,扩增片段出现极好的特异性,而35株非O1非O139群霍乱弧菌、沙门氏菌等未见扩增带。人工污染的罗非鱼、牡蛎、鱼肠和鳃混合物的检出限EVC为22cfug、O139为50cfug、副溶血性弧菌为65cfug,整个实验过程8～10h完成。结论实验结果表明MPCR是敏感、省时、省力的检测方法。     

O139群霍乱弧菌毒力岛区域分子特征分析

目的 比较O139群霍乱弧菌国际标准株M045和O1群E1 Tor型霍乱弧菌国际标准株N16961基因组中毒力岛区域分子特征.方法 从MO45基因组中筛选含有毒力岛上游的VC0815基因及其上游基因片段并克隆到pNEB193中命名为pNEBVC081545,绘制pNEBVC081545的限制性酶切图谱并与N16961同段序列限制性酶切图谱进行比较.在pNEBVC081545中选择VC0815基因上游的一段侧序列进行亚克隆,测序后与N16961同段序列比较.结果 pNEBVC081545限制性酶切图谱中VC0815基因上游序列图谱中第1个碱基位置是限制性内切酶位点为KpnⅠ,第732位为Sal Ⅰ,第819位为Hpa Ⅰ,第1578位为Bgl Ⅱ,第1600位为Hind Ⅱ,第1943位为Xba Ⅰ,第3247位为EcoR Ⅰ,此段序列限制性内切酶图谱与N16961同段序列限制性酶切图谱完全相同.对Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ之间的序列进行亚克隆,并对该段序列测序,测序结果表明该段核酸序列与N16961中同段序列完全相同.结论 O139霍乱弧菌可能是E1 Tor霍乱弧菌O抗原突变而产生的菌群.     

蚌埠市2018年水产品致病性弧菌污染情况检测结果分析

目的 了解蚌埠市水产品中致病性弧菌的污染情况、副溶血弧菌毒力基因携带情况,为食源性疾病防控提供依据.方法 采集蚌埠市农贸市场、超市、饭店水产品样品,依据《2018年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》对水产品中的副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、河弧菌进行分离培养鉴定;采用荧光PCR方法检测副溶血弧菌不耐热溶血素(TLH)、耐热性溶血素(TDH)、耐热相关溶血素(TRH)和TOXR基因.结果 共采集水产品2 00份,检出致病性弧菌93株,阳性数为80份,阳性率为40.0％,其中副溶血弧菌检出率22.5％、霍乱弧菌检出率3.5％、创伤弧菌检出率0.5％、溶藻弧菌检出率17.0％、河弧菌检出率3.0％;全部副溶血弧菌毒力基因均为阴性.结论 5种致病性弧菌在蚌埠市水产品中均有不同程度的污染,其中以副溶血弧菌和溶藻弧菌最为严重.     

用溶血素基因探针检测非01群霍乱弧菌的初步研究

本文应用霍乱弧菌溶血素基因探针对87株从临床急性感染性腹泻患者粪便中分离的致病性弧菌进行了检测,同时以血琼脂平板溶血性检测作为对照。结果表明,该探针只与非01群霍乱弧菌杂交,而不与其它致病性弧菌(副溶血弧菌、拟态弧菌、河弧菌和溶藻弧菌)产生阳性反应。18株非01群霍乱弧菌中有16株(88.9%)具有与霍乱弧菌溶血素同源性基因,另2株用该探针杂交为阴性,但其在血琼脂上显示有溶血性,表明非01群霍乱弧菌存在着不同种的溶血素。应用这种特异性溶血素基因探针,检测到1株蔗糖阴性的非01群霍乱弧菌。     

2016年河南省淡水产品养殖环节4种常见致病性弧菌污染状况监测

目的 了解河南省淡水产品养殖环节4种常见致病性弧菌（霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌和溶藻弧菌）的污染状况,为河南省食源性疾病的预防及溯源提供数据支持。方法 参照2016年国家食品安全风险监测-淡水动物性水产品养殖环节中常见弧菌专项监测工作手册进行样品的采集和检测。结果 从开封市和鹤壁市淡水产品养殖场中分别采集水产品、养殖水体和水底淤泥共计312份,开封市检出73株霍乱弧菌（46.79％）、13株副溶血性弧菌（8.33％）和17株溶藻弧菌（10.90％）,未检出创伤弧菌;鹤壁市检出8株霍乱弧菌（5.13％）,未检出副溶血性弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌。对13株副溶血性弧菌进行3种毒力基因（TLH、TRH和TDH）检测。13株副溶血性弧菌均具有不耐热溶血素基因（TLH）,有12株具有耐热相关直接溶血素基因（TRH）,均未携带耐热直接溶血素（TDH）。对81株霍乱弧菌进行血清分群,O1群霍乱弧菌3株（小川1株、稻叶1株和彦岛1株）,O139群霍乱弧菌5株,非O1/O139群霍乱弧菌73株。81株霍乱弧菌CTXA毒力基因阳性菌株7株,均为非O1/O139群霍乱弧菌。结论 河南省淡水养殖环节主要受霍乱弧菌、副溶血性弧菌和溶藻弧菌的污染,监测的2个地区污染情况存在差异,污染的优势弧菌是霍乱弧菌。     

副溶血弧菌生物膜相关基因突变株的构建

目的 构建副溶血弧菌生物膜相关基因突变株并进行验证.方法 采用PCR方法扩增得到靶基因的上下游同源臂片段,然后以上下游同源臂片段为模板,PCR扩增得到同源臂融合片段.将同源臂融合片段经酶切处理后克隆到自杀质粒pDS132中.通过结合转移的方式将携带有同源臂融合片段的重组质粒转入副溶血弧菌RIMD 2210633中,利用同源重组得到突变株.用PCR方法筛选和鉴定突变株,同时对突变株进行表型分析,从而在分子水平和表型试验上验证突变株是否构建成功.结果 构建得到了分别携带副溶血弧菌生物膜相关基因vbfR、crp、hns、swrZ、swrT、cpsR融合同源臂片段的重组质粒,通过PCR扩增,分别得到了大小为1190、1128、1136、953、1242、1112 bp的片段;用重组质粒构建了相应的突变株(ΔvbfR、Δcrp、△hns、ΔswrZ、ΔswrT和ΔcpsR),进行PCR鉴定时,突变株得到了大小分别为1190、1128、1136、953、1242、1112 bp的扩增产物,比阳性对照分别小610、739、421、542、427、1367 bp;用靶基因内部的引物进行扩增时,无扩增产物;选其中一株突变株Δhns进行生物膜形成能力表型分析,结果表明突变株Δhns生物膜形成量与野生株相比明显增加.结论 构建得到了6株副溶血弧菌生物膜相关基因突变株,并从分子和表型试验上验证了突变株构建正确.     

不同盐分浓度对副溶血弧菌毒力表型的影响

目的研究副溶血弧菌(VP)在不同盐分浓度下毒力表型的变化。方法利用小鼠致死性实验、兔回肠袢实验、Raw264细胞毒性实验和兔红细胞溶血活性实验比较标准强毒株RIMD2210633株在高盐(2%NaCl)和低盐(0.5%NaCl)条件下毒力表型的变化。结果 0.5%NaCl试验组副溶血弧菌的生长速度较2%NaCl试验组有所减慢,而产生的肠积液量、对Raw264细胞的细胞毒性及对兔红细胞的相对溶血活性却显著高于2%NaCl试验组(P<0.05);然而0.5%NaCl试验组菌体的小鼠致死率却低于2%NaCl试验组,两组小鼠存活率分别为80.0%和53.3%。结论在低盐条件下,VP的生长速度下降,肠毒性、Raw264细胞毒性和溶血活性均增强,而小鼠致死毒性反而减弱。     

多位点序列分型技术在深圳副溶血弧菌同源性分析中的应用研究

目的 了解副溶血弧菌临床分离株的毒力基因、血清型及基因分型特征,探讨多位点序列分型(MLST)分型技术对其同源性分析的应用价值。方法 收集深圳地区2007-2014年食物中毒及医院散发病例来源的68株副溶血弧菌菌株,对其进行血清型、毒力基因分析。选择副溶血弧菌MLST数据库提供的7个管家基因,PCR扩增测序后采用BioEdit、eBURST等软件,对本次研究的68株副溶血弧菌进行MLST同源性分析。结果 68株副溶血弧菌共得到7种不同的血清型,优势血清型为O3∶K6(47/68),其余血清型分别为O4∶K8、O5∶K68、O4∶K13等。副溶血弧菌临床分离株94%为tdh+trh-。MIST分型将68株副溶血弧菌分为5个序列型(ST型),ST3为优势序列型(55/68),其余4种ST型中的ST189与ST345构成一个同源复合体CC345,且ST189为ST345的单位点变异型。结论 深圳地区副溶血弧菌所致的腹泻病暴发疫情,其流行菌株ST型别多样化,疾病控制中需警惕非主流ST型别引起暴发可能。     

广州地区小川型霍乱弧菌的脉冲场凝胶电泳分析

目的分析小川型霍乱弧菌的致病相关基因型,探讨广州地区小川型霍乱流行趋势和规律。方法采用多重PCR方法检测小川型菌株的4种致病相关基因,应用脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）对菌株进行分子分型,对PFGE图谱采用分子分型软件BioNumerics Version 4.0进行聚类分析。结果广州地区小川型菌株中存在3种致病相关基因型,即A型、B型和C型,20%感染者分离株为致病相关基因A型,80%环境分离株为致病相关基因C型。25株霍乱弧菌分为14个不同的PFGE型,归为3个聚类群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群）。每一次小川型暴发中分离的菌株PFGE克隆型相同或相近,而散发病例分离株与暴发株的PFGE型有些相同,有的差异较大。环境小川型菌株中存在PFGE克隆型的多样性,部分环境株与感染者分离株具有相近的PFGE型。结论应建立广州地区霍乱菌株的PFGE分子分型数据库,加强霍乱的预防、控制和预警。     

pH值及盐度对副溶血弧菌与霍乱弧菌生长影响的研究

目的研究增菌液pH值及盐度对副溶血弧菌和霍乱弧菌生长的影响,找出副溶血弧菌与霍乱弧菌的最佳生长pH和盐度。方法应用阳性菌株副溶血弧菌和霍乱弧菌,参照国际和国内增菌液的要求,控制增菌液pH值和盐度条件,采用弧菌显色培养基检测副溶血弧菌和霍乱弧菌生长数。结果增菌液pH值7.2、盐度3.2%时最适副溶血弧菌生长,增菌液pH值7.1、盐度1.2%时最适霍乱弧菌生长。结论增菌液pH值和盐度对副溶血弧菌和霍乱弧菌生长有一定影响。     

实时荧光PCR法、胶体金法和培养法检测甲鱼中霍乱弧菌

目的优化水产品甲鱼中霍乱弧菌的检测程序,提高甲鱼中霍乱弧菌检出率。方法用实时荧光PCR、常规细菌培养、胶体金法同时对甲鱼中霍乱弧菌进行检测,并用实时荧光PCR法检测标本中霍乱弧菌ctx基因。结果共检测185份甲鱼样品,其中实时荧光PCR法检出28份霍乱弧菌核酸阳性,阳性率为15.14%;6份ctx基因核酸阳性,阳性率21.43%(6/28)。常规细菌培养法分离出2株菌株,一株为O139群霍乱弧菌,一株为小川型霍乱弧菌,用实时荧光PCR检测这两株纯培养菌株或原始标本,霍乱弧菌ctx基因均为阴性;胶体金法未检出阳性标本。结论对于水产品标本,可先用实时荧光PCR法筛检霍乱弧菌,阳性标本再进行传统细菌分离培养,以提高霍乱弧菌菌株的检出率;同时阳性标本进行霍乱弧菌ctx基因核酸检测,如也为阳性,需提高警惕,加强流行病学上的预防控制措施,及时防范霍乱疫情的发生。     

New qnr gene cassettes associated with superintegron repeats in Vibrio cholerae O1

A novel qnr determinant emerged in ciprofloxacin-resistant Vibrio cholerae O1 from the Amazon region of Brazil. This qnrVC1 was in a typical class 1 integron. Its attC showed 89% identity with V. parahaemolyticus superintegron repeats. Analysis showed V. cholerae O1 carrying qnrVC2 associated with a V. cholerae superintegron repeat.     

多重荧光定量PCR同时检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的方法研究

目的:利用多重荧光定量PCR技术检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌。方法:以溶藻弧菌等17种相关试验菌株做特异性检测;并将标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。结果:与传统的检测方法相比,该方法有很好的特异性且灵敏度高,检测时间短并可节省人力,具有快速方便等优点。结论:适用于样品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和创伤弧菌的快速检测。检测限分别为:霍乱弧菌为280 cfu/ml;副溶血性弧菌为:100 cfu/ml;创伤弧菌为:450 cfu/ml。     

十株产色素非O1群霍乱弧菌的发现与研究

目的研究产色素非Ｏ１群霍乱弧菌在水源水中的分布、生物学性状及其致病性。方法在本地主要饮用水源设点、采样、培养致病性弧菌。分离、鉴定该菌过程中用营养琼脂斜面代替双糖铁琼脂取得良好效果。结果１９９４～１９９７年在水源水中相继检出１０株产色素的革兰阴性弧状菌，经形态学、培养特性、生化学、血清学的系统鉴定，均符合非Ｏ１群霍乱弧菌的定义，动物实验等显示其有较强毒力。结论因该菌在碱性胆盐琼脂、营养琼脂斜面和血琼脂上培育后能产生水溶性褐色色素，故命名为产色素非Ｏ１群霍乱弧菌     

2011年玉林市食品、水体及海、水产品霍乱弧菌监测结果

目的了解玉林市霍乱弧菌污染的动态状况,为制定预防控制策略和措施提供科学依据。方法于2011年5—10月对食品、外环境水体和海(水)产品进行霍乱弧菌的监测。采集市区范围的池塘、江河水、污水处理厂排放的污水,集贸市场的食品、海(水)产品以及部分水产养殖水,进行O1群及O139群霍乱弧菌检测。结果各类标本共检测1 172份,检出霍乱弧菌9份,总阳性率0.8%。其中蛙类47份,阳性率10.6%;鱼类605份,阳性率0.7%;食品63份、在龟类(43份)、蔘藻类(14份)、贝类(69份)、虾类(37份)、江河水(210份)、排污水(61份)、池塘水(18份)、养鱼水(5份)中均未检出。结论该市水产品中有霍乱弧菌存在,应加强监测和加大对市民不吃生鱼虾等的宣传教育,以防止霍乱弧菌引起食源性腹泻。     

霍乱弧菌O1和O139血清型I类整合子的扩增与分布研究

目的扩增霍乱弧菌不同血清型I类整合子基因片段,并分析I类整合子在霍乱弧菌O1和O139血清型中的分布. 方法收集霍乱弧菌O1和O139血清型40株,根据GenBank资料设计PCR引物,扩增霍乱弧菌I类整合子基因片段,并用限制性酶切分析法进行鉴定,分析I类整合子在不同血清型的分布情况. 结果从霍乱弧菌O1和O139血清型中均能扩增约800 bp的基因片段,扩增片段经Pst I酶切后可获得671和127 bp的片段,经HindIII酶切后可获得580、160和58 bp的片段,经HindIII 和Pst I酶切后可获得453、160、127和58 bp的片段,I类整合子在O139血清型霍乱弧菌中分布多于O1血清型. 结论 I类整合子与霍乱散发菌株耐药性的传递、血清型的分布有密切的联系.     

鼠疫菌、副溶血性弧菌及肺炎克雷伯菌CRP蛋白的表达及其DNA结合活性分析

目的表达有活性的鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）、副溶血性弧菌以及肺炎克雷伯菌的cAMP受体蛋白（CRP）并进行DNA体外结合活性分析,为深入研究3种CRP蛋白间的交互转录调控作用奠定基础。方法应用大肠埃希菌pET系统体外表达鼠疫菌201株、副溶血性弧菌5421株以及肺炎克雷伯菌tw518株的CRP蛋白;应用生物信息学对3种CRP蛋白进行同源性比较,并对CRP与靶DNA的结合基序（CRP consensus）进行分析预测;通过体外凝胶阻滞实验（EMSA）和DNaseⅠ足迹实验验证His？CRP与DNA的结合活性。结果成功表达出3种菌有活性的His？CRP融合蛋白,3种CRP蛋白对鼠疫菌pla、副溶血性弧菌toxR及肺炎克雷伯菌kfuA基因均有结合活性。结论 3种CRP蛋白都能直接结合到鼠疫菌pla、副溶血性弧菌toxR及肺炎克雷伯菌kfuA基因的启动子区,说明上述3种CRP蛋白对3种病原菌的重要毒力基因的转录可能具有交互调控作用。