重组腺相关病毒载体介导的小基因SMCKA3999治疗对Duchenne肌营养不良肌力的影响

目的研究重组腺相关病毒载体(rAAV)介导的人dystrophin小基因SMCKA3999对DMD病理、肌力改变的治疗作用.方法将dystrophin小基因SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999病毒,以5×109病毒颗粒多点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌,基因治疗4月后免疫荧光法检测肌膜dystrophin基因表达,治疗5月后采用肌肉离体灌注电刺激测定腓肠肌肌力,观察rAAVSMCKA3999对mdx鼠肌力的疗效.结果rAAVSMCKA3999有效稳定表达并使肌膜缺失的dystrophin恢复,明显改善mdx鼠肌力.结论rAAVSMCKA3999对DMD治疗有效,能显著改善mdx鼠肌肉功能,应用重组腺相关病毒载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999是治疗DMD有希望的方法.     

重组腺相关病毒（rAAV）介导基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良病理和功能的影响

目的　 研究重组腺相关病毒 (rAAV)载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999治疗DMD模型鼠mdx ,从病理和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。方法　以dystrophin小基因SMCK A3999为目的基因 ,将SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999,以 5× 10 10 病毒颗粒单点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌 ,基因治疗后 4个月及 7个月 ,采用免疫荧光、光镜组织病理、肌电图等方法 ,从形态和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效。 结果　rAAVSMCKA3999使肌膜缺失的dys trophin恢复并稳定表达持续 7个月以上 ,肌肉组织病理改变好转 ,肌病肌电图改变明显改善 ,疗效持续 4个月以上。 结论　rAAVSMCKA3999能改善mdx小鼠骨骼肌的病理及功能 ,采用rAAV介导的dystrophin小基因SMC KA3999对Duchenne肌营养不良基因治疗是有希望的治疗方法。     

重组腺相关病毒载体介导的小基因SMCKA3999治疗Duchenne肌营养不良小鼠的研究

目的研究重组腺相关病毒载体(rAAV)介导的人抗肌萎缩蛋白(dystrophin)小基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良(DMD)在病理、肌电图、肌力方面的治疗作用。方法将dystrophin小基因SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAV SMCKA3999病毒,以5×109病毒颗粒多点注射于DMD模型鼠(mdx鼠)腓肠肌,基因治疗4个月后,以免疫荧光双标法检测肌膜dystrophin基因表达,采用Nicolet肌电及诱发电位仪记录mdx鼠肌电图,基因治疗5个月后以肌肉离体灌注电刺激法测定腓肠肌肌力,观察rAAV SMCKA3999对DMD动物模型鼠的治疗作用。结果rAAVSMCKA3999能有效稳定表达,并使肌膜缺失的dystrophin恢复,明显改善DMD肌电图表现,肌力恢复。结论rAAV SMCKA3999对mdx鼠治疗有效,能显著改善其肌肉功能,应用rAAV介导的dystrophin小基因SMCKA3999基因治疗是临床治疗DMD有希望的方法。     

肿瘤血管抑制肽alphastatin重组腺伴随病毒的制备

目的构建并产生肿瘤血管抑制肽alphastatin(Al)重组腺伴随病毒(rAAV)载体。方法将目的基因alphastatin插入载体质粒pSSHG-巨细胞病毒(CMV)的EcoRI和BamHI位点,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-Al。用腺病毒辅助质粒pFG140代替野生型腺病毒,包装质粒pAAV/Ad及已构建的重组腺伴随病毒载体质粒,使用三质粒共转染法转染293细胞,包装得到腺伴随病毒(AAV)-Al。采用氯仿抽提、聚乙二醇沉淀回收纯化,斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果重组病毒rAAV-Al滴度约为2×1012颗粒/ml。结论成功制备了重组病毒rAAV-Al,提供了一种生产足量安全的rAAV-Al简单易行的方法,为肿瘤的基因治疗实验奠定了基础。     

NT4-GFP-Ant重组腺相关病毒载体的构建及病毒包装、滴度测定

目的为使基因治疗时,较大分子的功能蛋白能通过血脑屏障,构建NT4-GFP-Ant重组腺相关病毒载体,包装重组病毒,并测定滴度。为进一步动物实验研究该重组病毒液感染鼻粘膜细胞,在鼻粘膜内表达的大分子融合蛋白沿“鼻-脑”通路人脑的可行性奠定基础。方法将已构建成功的NT4-GFP-Ant融合基因插入病毒载体质粒PSSHG中,构建重组腺相关病毒载体质粒,酶切电泳鉴定。用腺病毒辅助质粒PFG140、包装质粒pAAV/Ad及已构建的重组腺伴随病毒载体质粒,三质粒磷酸钙共沉淀法转染80％融合的293细胞系,包装重组腺病毒（rAAV）。回收病毒、斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果成功构建了重组腺相关病毒质粒PSSHG/NT4-GFP- Ant。包装、回收病毒后斑点杂交方法测定重组病毒滴度为3．36×10^9 PFU/ml。结论成功构建了PSSHG/NT4- GFP-Ant重组腺相关病毒载体,并成功包装了较高浓度的重组病毒。     

利用Helper-Free系统构建cdk5-siRNA腺相关病毒载体并鉴定

目的构建能表达CDK5特异性小干扰RNA(siRNA)(cdk5-siRNA)的重组腺相关病毒(AAV)载体,体外观察其对CDK5基因的沉默作用。方法采用基因克隆技术将合成的特异性cdk5 RNA干扰寡核苷酸序列克隆至AAV Helper-Free System中的表达质粒pAAV-MCS,构建出质粒pAAV-MCS-cdk5-siRNA,通过酶切测序鉴定重组质粒;将该质粒与系统中的控制质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染HEK293细胞,包装得到表达cdk5-siRNA的重组腺相关病毒载体(rAAV-cdk5-siRNA);用斑点杂交法测定重组病毒的滴度,重组病毒感染体外培养的PC12细胞,W estern b lot检测其抑制cdk5表达的效果。结果成功构建并包装出重组腺相关病毒载体rAAV-cdk5-siRNA,病毒滴度达4×1013/m l,重组病毒感染后的PC12细胞cdk5表达明显下调。结论构建的重组腺相关病毒载体rAAV-cdk5-siRNA能明显干扰cdk5的表达,为将其进一步应用于神经变性疾病的治疗研究奠定了基础。     

携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装

背景：细胞分裂周期2(cell division cycle 2, cdc2)在神经变性疾病如阿尔茨海默病的神经元变性过程中扮演了重要角色。以腺相关病毒为载体对cdc2基因进行沉默,可能对神经变性疾病的神经元起保护作用。 目的：包装携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)。 设计、时间及地点：空白对照实验,于2007-10/2008-08在武汉同济医院神经科实验室完成。 材料：Helper Free 腺相关病毒系统(pAAV-MCS-EGFP、p-RC、p-Helper)及AAV-293细胞为Stratagene公司产品。 方法：应用分子生物学方法构建生成pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP表达质粒;用磷酸钙法将该质粒和p-RC、p-Helper质粒共转染AAV-293细胞,包装生成携带cdc2-siRNA的重组腺相关病毒 (rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP)。病毒感染AAV-293细胞后行Western Blot 检测cdc2-siRNA对细胞内cdc2基因的沉默效果,并用斑点杂交方法测定该病毒的滴度。 主要观察指标：pAAV-MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP质粒中插入片段U6-cdc2-siRNA的测序;3质粒pAAV- MCS-U6-cdc2-siRNA-EGFP、p-RC、p-Helper共转染AAV-293细胞; rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP感染AAV-293细胞后cdc2的表达。 结果：①DNA测序证明U6-cdc2-siRNA已成功构建到表达质粒pAAV-MCS-EGFP中。②AAV-293细胞表达绿色荧光蛋白,共转染成功。③包装得到的重组腺相关病毒 (rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP)感染AAV-293细胞后能显著下调 AAV-293细胞cdc2基因的表达量。④rAAV-U6-cdc2-siRNA-EGFP的滴度为1x1012 v.g/mL。 结论：携带cdc2-siRNA重组腺相关病毒的包装获得成功,它具有沉默cdc2基因表达的功能。     

NT-3基因过表达慢病毒载体的构建和包装及鉴定

目的构建神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)基因慢病毒载体,检测其在大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达。方法体外扩增NT-3,将NT-3全长载体GV287-GFP与扩增出的NT-3用AgeI进行酶切,将NT-3全长序列克隆入GV-287-GFP,转化大肠杆菌DHS a感受态细胞,筛选出阳性克隆进行基因测序。重组GV287-EGFP质粒、pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒三质粒共转染至包装细胞293T,培养48 h后收集细胞上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度,并检测慢病毒载体在MSCs的转染效率。荧光显微镜观察转染是否成功,RT-PCR和Western blot检测MSCs细胞中NT-3蛋白的表达。结果测序结果和Western blot检测均证明NT-3慢病毒载体构建正确,且在细胞中正确表达。与辅助质粒共包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染MSCs细胞。包装慢病毒、浓缩病毒悬液的滴度为2×109/ml慢病毒浓缩液。结论成功构建了稳定高效表达NT-3基因的慢病毒载体。     

HSV-1 VP22及microdystrophin基因融合表达重组质粒的构建及其生物学特性的初步研究

目的 构建人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)病毒蛋白22(VP22)及microdystrophin基因融合表达重组质粒,体外研究其表达及HSV-1 VP22介导的蛋白转导特性,为进一步利用此重组质粒治疗Duchenne型肌营养不良症(DMD)奠定基础.方法 从质粒pSINrep5-VP22中PCR扩增HSV-1 VP22全长基因.然后克隆至真核表达载体pAVX1中,构建重组质粒pAVP22:再用Not I酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因,片段回收后定向插入质粒pAVP22中,获得重组质粒pAVP22-MICDYS:然后将重组质粒pAVP2-MICDYS转染至小鼠成纤维细胞3T3细胞.通过RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光检测microdystrophin基因的转录及蛋白表达;最后收集转染后3T3细胞上清,感染人间充质干细胞(MSCs),检测重组蛋白在人MSCs中的表达情况来分析HSV-1 VP22是否可以介导VP22-microdyslrophin融合蛋白的转导.结果 成功构建了含有HSV-1 VP22和microdystrophin基因的重组质粒.并在体外得到了很好表达:同时也证实HSV-1 VP22提高了microdystrophin基因在3T3细胞中的表达效率,并可介导VP22-mizrodystrophin蛋白从3T3细胞到人MSCS间的转导.结论 该重组质粒的构建及体外成功表达和蛋白转导特性的确定为下一步用该重组质粒进行DMD疾病治疗研究奠定了基础.     

通用腺相关病毒载体构建及表达报告基因GFP的研究

目的　构建基因治疗通用型 AAV载体并检测它转导外源基因作用。方法　使用限制性内切酶切出p SSV9int-质粒中的 AAV病毒 Rep和 Cap基因元件后 ,插入了重组腺病毒专用穿梭质粒 -p ACCMVp L p A的含有CMV启动子、多克隆位点 (MCS)和多聚腺苷酸信号 (Poly A)的表达盒 ,构建了重组 AAV通用载体质粒 p SSHG-CMV。在该质粒 MCS插入 GFP基因后 ,我们使用 p SSHG-CMV-GFP、p GF14 0和 p AAV/Ad 3种质粒共转染 2 93包装细胞 ,制备 GFP重组 AAV,应用斑点杂交实验检测重组病毒滴度度 ,并将该病毒感染新生大鼠星形胶质细胞 ,荧光显微镜观察 GFP表达。结果　重组 AAV的滴度在浓缩前可达 2× 10 11,浓缩后可达 2× 10 13 ,表明成功的构建了重组 AAV载体 ,插入外源基因 GFP后 ,在包装病毒和辅助质粒的联合作用下 ,能产生具有感染性的重组AAV。感染了重组 GFP-AAV的大鼠星形胶质细胞表达了明显的 GFP荧光。结论　本文构建的重组 AAV通用载体 p SSHG-CMV,可转导外源基因 ,用于基因治疗的研究     

Vector therapy in family therapy

Summary Family psychiatry has evolved as a new system for the organization of psychiatric practice; it takes the family group rather than the individual as the functional unit.In therapy, as in all other aspects of family psychiatry, the family is the unit. Family Therapy includes all procedures for the treatment of the family and can be divided into Family Psychotherapy and Vector Therapy, the subject of this communication.A vector denotes a quantity which has direction. Force, including emotional force, is a quantity with direction, and therefore can be represented by a vector. Furthermore, as direction is a property of a vector, and direction implies movement, it results in a dynamic situation. The individual can be regarded as an element in the family's field of emotional forces, and both the individual and the family as elements in the community's field of emotional forces.Vector therapy is concerned with evaluating these forces and readjusting their patterning within the life space to produce a more harmonious field of emotional forces within and around the family.

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Zusammenfassung Familienpsychiatrie hat sich als ein neues Organisationssystem der psychiatrischen Praxis entwickelt. Sie nimmt als funktionale Einheit mehr die Familiengruppe als das Individuum.In der Therapie ist die Familie, wie in allen anderen Formen der Familienpsychiatrie, die Einheit. Familientherapie schließt alle Behandlungsverfahren für die Familie ein und kann in Familienpsychotherapie und Vektortherapie, dem Gegenstand dieser Mitteilung werden.Ein Vektor bedeutet eine Quantität mit einer bestimmten Richtung. Kraft, einschließlich emotionaler Kraft, ist eine Quantität mit einer Gerichtetheit und kann daher durch einen Vektor dargestellt werden. Da Gerichtetheit eine Eigenschaft eines Vektors ist und Bewegung einschließt, folgt weiterhin daraus eine dynamische Situation. Der Einzelne kann als ein Element im emotionalen Kräftefeld der Familie gesehen werden und beide — der Einzelne und damit die Familie — als Elemente im emotionalen Kräftefeld der Gemeinde.Vektortherapie befaßt sich mit der Bestimmung dieser Kräfte und ihrer Neuordnung innerhalb des Lebensraumes, um ein harmonischeres Feld der emotionalen Kräfte innerhalb der Familie und um sie herum herzustellen.

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Résumé La psychiatrie de famille est devenue un nouveau système dans l'organisation de la pratique psychiatrique; c'est le groupe familial plutôt que l'individu qui est considéré comme unité fonctionnelle.En thérapie comme dans tous les autres aspects de la psychiatrie de famille, la famille est l'unité. La thérapie de famille comprend tous les modes de traitement de la famille et peut être divisée en psychothérapie de famille et thérapie vectorielle, cette dernière étant le sujet de ce travail.Un vecteur indique une quantité et une direction. La force, y compris la force émotionnelle, est une quantité et une direction; elle peut par conséquent être représentée par un vecteur. De plus, la direction étant une propriété du vecteur et la direction impliquant un mouvement, il en résulte une situation dynamique. L'individu peut être considéré comme un élément dans le champ familial des forces émotionnelles, et l'individu et la famille tous deux comme des éléments dans le champ communautaire des forces émotionnelles. La thérapie vectorielle consiste à évaluer ces forces et à les réajuster afin de créer un champ de forces émotionnelles plus harmonieux au sein et autour de la famille.

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Based on paper given at the International Congress of Psychotherapy, Wiesbaden 1967.     

Vector Symbolic Architectures for Context-Free Grammars

Cognitive Computation - Vector symbolic architectures (VSA) are a viable approach for the hyperdimensional representation of symbolic data, such as documents, syntactic structures, or semantic...     

A Twin Multi-Class Classification Support Vector Machine

Twin support vector machine (TSVM) is a novel machine learning algorithm, which aims at finding two nonparallel planes for each class. In order to do so, one needs to resolve a pair of smaller-sized quadratic programming problems rather than a single large one. Classical TSVM is proposed for the binary classification problem. However, multi-class classification problem is often met in our real world. For this problem, a new multi-class classification algorithm, called Twin-KSVC, is proposed in this paper. It takes the advantages of both TSVM and K-SVCR (support vector classification-regression machine for k-class classification) and evaluates all the training points into a “1-versus-1-versus-rest” structure, so it generates ternary outputs { ?1, 0, +1}. As all the samples are utilized in constructing the classification hyper-plane, our proposed algorithm yields higher classification accuracy in comparison with other two algorithms. Experimental results on eleven benchmark datasets demonstrate the feasibility and validity of our proposed algorithm.     

TWSVR: Regression via Twin Support Vector Machine

Taking motivation from Twin Support Vector Machine (TWSVM) formulation, Peng (2010) attempted to propose Twin Support Vector Regression (TSVR) where the regressor is obtained via solving a pair of quadratic programming problems (QPPs). In this paper we argue that TSVR formulation is not in the true spirit of TWSVM. Further, taking motivation from Bi and Bennett (2003), we propose an alternative approach to find a formulation for Twin Support Vector Regression (TWSVR) which is in the true spirit of TWSVM. We show that our proposed TWSVR can be derived from TWSVM for an appropriately constructed classification problem. To check the efficacy of our proposed TWSVR we compare its performance with TSVR and classical Support Vector Regression(SVR) on various regression datasets.     

Vector short-latency somatosensory-evoked potentials after median nerve stimulation

A new method has been developed for recording short-latency somatosensory-evoked potentials after median nerve stimulation. Negative electrical forces recorded with three orthodiagonal bipolar electrodes in the neck had a direction opposite to that of impulse conduction in the proximal peripheral and cervical somatosensory pathway. Sequential tracings of vectors opposite the electrical forces were made in three-dimensional display, thus reproducing the actual time sequence of electrical events in those structures. Fixed generators such as the subcortical nuclei were also analyzed with this technique, and multiple generators of N13 potential (N13a and N13b) were visualized. This technique may be useful in the functional evaluation of the somatosensory pathway in the cervical cord.     

Lane Boundary Detection Algorithm Based on Vector Fuzzy Connectedness

In most actual autonomous guided vehicles (AGV), path finding and navigational control systems are usually implemented using images captured by cameras mounted on the vehicles. This paper presents and discusses a lane boundary detection technique that is necessary for the task of autonomous driving. In this paper, a new method called vector fuzzy connectedness (VFC) is presented to detect and estimate road lane boundaries. First, a preprocessed technique is used to obtain a skeleton image. Based on the result, the curvatures of the left and right lane boundaries are estimated, and the control points are found by the VFC method. Finally, the non-uniform b-spline (NUBS) interpolation method is introduced to construct the road lane boundaries. The proposed VFC method integrates the vector concept and fuzzy connectedness into the lane boundary detection algorithm. As shown in the example results, the proposed method can extract various road lane shapes and types from real road frames even under complex road environments. For navigation tasks, it is necessary to determine the position of the vehicle relative to the road. These results prove that the proposed detection method can assist in a number of actual AGV assistant applications. In the future, some intelligent techniques will be applied to test the AGV system with obstacle avoidance conditions on real world roads.     

骨髓间质干细胞作为基因载体治疗胶质瘤的研究进展

胶质瘤基因治疗的传统载体及神经干细胞都存在缺陷,近期研究表明骨髓间质干细胞作为胶质瘤治疗的新型载体,具有强大的迁移力、趋瘤性及低免疫原性和免疫调节功能等优点。