MDR1 shRNA表达质粒的构建

目的构建由pSIREN—RetroQ-ZsGreeen载体介导、表达MDR1短发卡RNA（shorthairpinRNA,shRNA）的重组质粒。方法分别针对MDR1基因的两个不同位点,按BamHI＋Sense＋Loop＋Antisense＋终止信号＋EcoRI结构合成编码shRNA的DNA序列及其反义序列,退火连接及磷酸化形成双链后,将其依次导入pSIREN—RetroQ—ZsGreeen载体,构建成能产生MDR1shRNA的质粒,并进行序列分析。结果重组质粒（pSIREN—RetroQ-ZsGreeen—A和pSIREN—RetroQ—ZsGreeen—B）经酶切与测序证实两段寡核苷酸片段成功插入到预计位点,序列完全一致,无任何碱基突变。结论MDR1shRNA的表达载体pSIREN—RetroQ—ZsGreeen—A和pSIREN—Ret—roQ—ZsGreeen-B成功构建,为进一步研究肿瘤多药耐药逆转奠定了实验基础。     

pcDU6质粒载体介导的表达TGF-β1 sh RNA的质粒构建

【目的】用pcDU6质粒载体构建介导转化生长因子β1(TGF-β1)短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)表达的质粒。【方法】针对TGF-β1的以GGCC开始的21碱基大小的片段,分引设计2对寡核苷酸,形成双链后将其依次连入带有U6启动子的pcDNA3．1(一)载体(命名为pcDU6),两对DNA双链通过BamH Ⅰ酶切位点连接后形成中间由6个碱基序列间隔的反向互补序列．构建成TGF-β1短发夹RNA的产生质粒。【结果】经酶切、连接后构建成的质粒称之为pcDU6-A1-A2和pcDU6-B1-B2,经酶切与测序讧买构建成功．无任何碱基突变。【结论】成功构建了能表达TGF-β1 shRNA的质粒载体pcDU6-A1-A2和pcDU6-B1-B2,可能为临床防治长期腹膜透析病人的腹膜纤维化提供高效的方法。     

靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体的构建

目的:利用pGenesil-1质粒构建靶向survivin基因的2个短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体。方法:设计2对shRNA,GC比在40%～55%之间,进而应用BLAST软件进行同源性剔除,保证所得shRNA序列靶向survivin基因,分别克隆至带有U6启动子的质粒pGenesil-1中,构建质粒表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。双酶切重组质粒进行酶切鉴定。结果:成功构建靶向survivin基因的2个shRNA质粒表达载体,经双酶切鉴定及质粒测序结果完全符合设计要求。结论:经鉴定设计的2条shRNA已成功连接于质粒上,可以应用于进一步RNA干扰试验。     

Bmi-1 shRNA慢病毒表达载体的构建及稳转U266细胞株的建立

本研究构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立U266-li稳定细胞株,为下一步Bmi-1的功能研究及应用RNAi技术治疗打下基础。设计、合成1对针对Bmi-1 mRNA的shRNA序列,退火后连接到pLVTHM干扰载体上,与psPAX2、PMD2G共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染U266细胞,建立稳定细胞株;应用实时PCR和Western blot技术分别检测U266稳定细胞中Bmi-1及P14 mRNA和蛋白水平的表达,并与对照组进行比较。结果表明,成功构建了针对Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,病毒滴度为5×107 TU/ml;建立稳定转染的U266细胞株。有效干扰验证显示,shBmi-1能明显降低Bmi-1的mRNA及蛋白水平,而P14的mRNA及蛋白水平则都上调,其差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建Bmi-1基因的shRNA慢病毒表达载体,建立稳定干扰Bmi-1表达的U266细胞株。     

转化生长因子β1基因克隆及重组真核表达质粒的构建

背景：通过基因转移方法研究某一外源性基因在细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段，与病毒载体相比，应用DcDNA4．0-TGF-β1真核表达质粒的转染方法无遗传毒性和细胞毒性，有更高的安全性。目的：通过克隆转化生长因子β1基因，观察构建重组转化生长因子β1基因真核表达质粒的可行性。设计、时间及地点：以细胞为观察对象的体外实验，于200703／2008—02在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。材料：2月龄清洁级健康SD大鼠，雌雄不拘，用于分离细胞中RNA。方法：从大鼠骨髓细胞中分离提取转化生长因子B1的mRNA，反转录聚合酶链反应扩增后，克隆入pGEM—T载体，PCR鉴定重组子；酶切下目的基因转化生长因子B1，再亚克隆入载体pcDNA4．0质粒，酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA序列分析。主要观察指标：TGF-β1 cDNA、pGEM—T—TGF-β1和重组子pcDNA4．0-TGF—β1的表达。结果：经过反转录一聚合酶链反应扩增得到TGF-β1 cDNA条带；PCR扩增鉴定得到pGEM—T—TGF-β1。酶切鉴定得到亚克隆重组子pcDNA4．0-TGF-β1，经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致。结论：成功克隆大鼠转化生长因子β1基因，并构建出重组转化生长因子β1真核表达载体。     

血管内皮生长因子质粒载体的构建

[目的]构建携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒.[方法]采用PCR 技术,以pIRES2-VEGF质粒为模板扩增VEGF基因全长,采用PCR产物的粘端克隆法,将VEGF定向克隆入EGFP的多克隆位点,构建pIRES2-EGFP-VEGF重组质粒,酶切、PCR及序列分析鉴定.[结果]PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF正确连接至EGFP的多克隆位点.[结论]成功构建了携带人VEGF及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,为进一步研究VEGF基因治疗缺血性心血管疾病奠定了实验基础.     

切割瘢痕组织的TIMP－1核酶计算机辅助设计及体外表达载体的构建

目的设计能特异性切割人类瘢痕组织中TIMP－1mRNA的核酶,为解决增生性瘢痕问题寻找新的基因治疗的途径。方法根据Symons的"锤头结构",以人TIMP－1的mRNA为靶RNA,用计算机对其可能成为核酶切割位点的部位进行分析以寻找最佳切点;对底物、核酶及嵌入U6snRNA后核酶的二级结构进行预测;依据分子生物学的克隆技术构建其体外高效表达载体。结果针对第123、299和353位点设计了3个核酶,均能与底物切点两翼碱基结合形成锤头结构,嵌入U6snRNA后,核酶与底物的结合能量变化不大。成功构建了核酶的高效表达载体。结论计算机辅助设计是研究核酶过程中不可或缺的重要步骤;核酶嵌入U6snRNA可能是解决目前核酶研究中存在问题的较好途径;TIMP－1mRNA上第123、299、353位可能是核酶的最佳切割位点。     

MicroRNA-125a质粒表达载体的构建及其表达活性

背景:pSuper是一种非编码RNA的真核表达载体,可在细胞质内表达miRNA前体,经过细胞自身的Dicer酶切后形成miRNA成熟体,其过程能够完全模仿细胞内源性miRNA形成过程。因此,利用pSuper表达载体构建一种肝癌抑制性miRNA:miR-125a的表达载体,为下一步研究其抗癌机制奠定了基础。目的:构建miR-125a的真核表达质粒pSuper-miR-125a,并验证其表达miR-125a的效率和特异性。方法:PCR扩增miR-125a前体(Pre-miR-125a)的目的片段,将其T-A克隆入pMD18-T过渡质粒载体,限制性内切酶切下目的片段,连接入pSuper质粒表达载体得到pSuper-miR-125a重组质粒;将重组质粒转染Hela细胞,miRNA定量PCR检测重组质粒表达miR-125a的效率和特异性。结果与结论:成功将miR-125a前体(Pre-miR-125a)片段克隆入真核表达质粒pSuper H1启动子下游,获得pSuper-miR-125a重组表达质粒,转染该质粒进入Hela细胞后能够在细胞内高效和特异的表达miR-125a,进一步证明pSuper真核表达质粒适合miRNA的表达研究。     

MicroRNA-125a质粒表达载体的构建及其表达活性

背景：pSuper是一种非编码RNA的真核表达载体,可在细胞质内表达miRNA前体,经过细胞自身的Dicer酶切后形成miRNA成熟体,其过程能够完全模仿细胞内源性miRNA形成过程。因此,利用pSuper表达载体构建一种肝癌抑制性miRNA：miR-125a的表达载体,为下一步研究其抗癌机制奠定了基础。目的：构建miR-125a的真核表达质粒pSuper-miR-125a,并验证其表达miR-125a的效率和特异性。方法：PCR扩增miR-125a前体（Pre-miR-125a）的目的片段,将其T-A克隆入pMD18-T过渡质粒载体,限制性内切酶切下目的片段,连接入pSuper质粒表达载体得到pSuper-miR-125a重组质粒;将重组质粒转染Hela细胞,miRNA定量PCR检测重组质粒表达miR-125a的效率和特异性。结果与结论：成功将miR-125a前体（Pre-miR-125a）片段克隆入真核表达质粒pSuper H1启动子下游,获得pSuper-miR-125a重组表达质粒,转染该质粒进入Hela细胞后能够在细胞内高效和特异的表达miR-125a,进一步证明pSuper真核表达质粒适合miRNA的表达研究。     

结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白ESAT6基因，并构建重组表达质粒。方法 根据Genbank中ESAT6基因序列，针对其编码区合成引物，采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因，并连接到T载体，然后定向克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 经双内切酶消化所切下的片段，大小与预计相符；测序结果证实基因序列正确，符合表达框架。结论 成功构建了重组原核表达质粒pGEX-ESAT6。     

针对表皮生长因子受体基因RNA干扰质粒表达载体的构建

目的:表皮生长因子受体(EGFR)是一种酪氨酸激酶跨膜受体,人类的多种恶性肿瘤的发生与表皮生长因子受体过度表达有关。EGFR已成为阳性表达肿瘤的重要治疗靶标。在哺乳动物细胞中,RNA干扰是通过与目的基因特异互补的21-23个硷基的小双链RNA来抑制该基因的表达。有研究表明表达小发夹RNA的载体能诱导产生更好的RNA干扰效果。本实验通过向pSIREN-Shuttle质粒插入一段可被转录成小发夹RNA的双链寡核苷酸序列(其中含有于EGFR基因序列相同的19nt序列)重构了RNAi质粒表达载体。通过细胞转染评价该载体对人鼻咽癌细胞株(HNE1)EGFR基因的mRNA表达抑制效果。结果显示HNE1细胞的EGFR基因mRNA被明显抑制。提示shRNA质粒表达载体介导对EGFR基因的RNA干扰可能是鼻咽癌干预治疗的一种有效手段。     

抑制cyclin D1基因小发夹RNA(shRNA)表达质粒的构建

目的:通过构建抑制cyclin D1基因小发夹RNA(shRNA)真核表达载体系统,为肿瘤基因治疗提供实验依据。方法:利用基因重组技术构建靶向cyclin D1RNA干扰(RNAi)表达质粒,双酶切鉴定电泳及测序分析构建的质粒是否成功;Western Blot分析转染前后K562细胞cyclin D1蛋白表达的变化。结果:体外合成的64个碱基成功插入到预计位点,并且与设计序列完全一致;Western Blot分析结果显示转染所构建的质粒能明显下调K562细胞cyclin D1基因表达。结论:质粒的成功构建为研究其抑制cyclin D1基因表达,发挥抗肿瘤效应以及与放、化疗联合的协同效应打下基础。     

Gli1表达抑制对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

目的 抑制Glioma-associated oncogene homoglog（GLI）基因在卵巢癌SKOV3细胞中的表达,探讨GLI1表达抑制对SKOV3细胞增殖的影响.方法 构建并筛选GLI1基因的RNAi表达质粒,转染SKOV3细胞,CCK-8法比较转染前后卵巢癌细胞增殖变化,流式细胞仪检测紫杉醇诱导转染前后细胞凋亡比例,流式细胞仪检测转染前后SKOV3的细胞周期情况.Westem blot检测cyclinD、Bcl-2及Capase3蛋白表达的影响.结果 转染48 h后,在SKOV3细胞中Control组、N-Control组、GLI1 shRNA-1组、GLI1 shRNA-2组、GLI1shRNA-3组、GLI1 shRNA-4组的GLI1 mRNA水平分别为1.00±0.00、1.03 ±0.02、0.73±0.07、0.98 ±0.08、0.53±0.08、0.68±0.04,与Control组相比,GLI1 shRNA-1、GLI1 shRNA-3、GLI1 shRNA-4组GLI1 mRNA表达量均下降（P＜0.05）,转染GLI1 shRNA-3的SKOV3细胞中GLI1蛋白表达水平低于GLI1 shRNA-1、GLI1shRNA-2、GLI1 shRNA-4组（P＜0.05）,具有显著的干扰效果.转染GLI1 shRNA-3的SKOV3细胞增殖受到明显抑制（P＜0.05）,在紫杉醇的诱导下细胞凋亡比例明显增加,细胞周期主要阻滞在G1/S期.Western blot检测发现Bcl-2蛋白表达下降（P＜0.05）,Capase3蛋白表达升高（P＜0.05）,细胞周期蛋白CyclinD1蛋白表达下降（P＜0.05）.结论 GLI1 shRNh对SKOV3细胞增殖抑制作用明显,促进细胞凋亡,GLI1信号可通过抑制cyclinD1活化抑制细胞恶性增殖.     

NF-кB活化及WT1、MDR1的表达在急性非淋巴细胞白血病中的临床意义

本研究通过观察初治与难治急性非淋巴细胞白血病中NF-κB活性及WT1、MDR1的表达水平,探讨三者在急性非淋巴细胞白血病疗效中的作用与相互关系,为寻找新的改善难治急性非淋巴细胞白血病疗效的方法提供理论依据.急性非淋巴性白血病患者45例,其中初治组20例(A组),难治组25例(分为B、C两组).以15例单纯缺铁性贫血患者作为对照组.采用凝胶电泳迁移分析(EMSA)法检测各组病人NF-κB的活化水平,用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)法检测各组病人WT1及MDR1的表达水平.结果发现,在对照组未检测到NF-κB活化及WT1和MDR1表达;在初治组中NF-κB的活化水平、WT1和MDR1表达水平均明显低于难治组,而在难治B、C两组中三者无明显区别;各组病人细胞中NF-κB活化水平与WT1及MDR1的表达水平呈正相关.结论NF-κB的活化,WT1、MDR1的高表达可能是急性非淋巴细胞白血病难治的原因之一,急性非淋巴细胞白血病中NF-κB的活化水平与WT1、MDR1的表达呈正相关.     

靶向AATF基因shRNA表达载体的构建及其稳定表达的白血病U937细胞系的建立

本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系。根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303～324、443～464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体（pSA-1、pSA-2、pSA-3）转染人白血病U937细胞系,G418（500 mg/L）有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系;RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达。结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确。稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降（P〈0.05）。结论：成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础。     

靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体质粒,为利用RNA干扰技术探索EZH2基因的作用的研究做准备。方法根据EZH2 mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并连接入pGenesil-2载体,并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中,经测序证明与设计相同。结论成功构建靶向EZH2基因的shRNA真核表达载体,为进一步研究EZH2基因在肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。     

多药耐药基因在白血病细胞中的表达

用ＭＤＲ１基因探针及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术检测６３例白血病细胞ＭＤＲ１ｍＲＮＡ表达水平，发现３５例未治急性白血病阳性表达率为４５％。急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）组ＭＤＲ１表达与免疫分型相关。在２２例可做预后评价的病例中发现ＭＤＲ１基因表达与化疗反应显著相关，化疗缓解率在阳性表达组仅为２５％，而阴性表达组为９０％，这种现象不仅见于急性非淋巴细胞白血病，也见于ＡＬＬ。认为可将ＭＤＲ１ｍＲＮＡ中、高度表达作为化疗耐药指标，检测白血病细胞ＭＤＲ１基因表达可为化疗方案个体化提供依据。     

MeCP2特异性shRNA真核细胞表达质粒的构建与鉴定

目的构建MeCP2特异性SiRNA表达质粒pSilence-MeCP2。方法根据人MeCP2mRNA序列设计作用靶序列,化学合成两条互补的DNA寡核苷酸链,该序列中包含靶序列正义链、反义链,两者间的连接序列及与质粒相匹配的酶切位点序列,连接质粒后转化感受态细胞(E.Coli),使其在大肠杆菌内大量复制,提取质粒,PCR鉴定。结果合成的寡核苷酸序列与要求的序列完全相符,且以正确的方向插入。结论成功构建两个MeCP2特异性SiRNA表达质粒psilence-MeCP2/Ⅰ和psilence-MeCP2/Ⅱ。