牵拉力对RPE细胞分泌VEGF影响的实验研究

目的 观察牵拉力诱导下RPE细胞血管内皮生长因子（VEGF）的表达及两者之间的关系。设计 实验研究。研究对象 ARPE-19细胞株。方法 应用Flexcell-5000应力加载系统牵拉3D-RPE模型。根据不同大小牵拉力分为对照组（无牵拉力组）、A组（20% 形变组）、B组（10%形变组）、C组（5%形变组）。各组依照不同的时间点收取样本进行检测。应用实时荧光定量PCR检测各组不同时间点（0、24、48 h）VEGFA mRNA的表达情况， 蛋白印迹法检测（0、24、48 h）VEGFA-165的表达以及ELISA方法检测（0、12、24、36、48 h）细胞上清液中VEGFA的分泌。同时，为了体外定量检测细胞VEGF的促新生血管形成能力，使用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行了体外成管实验（24、48h）。主要指标 VEGFA mRNA相对表达量、VEGFA-165相对表达量、细胞上清液VEGFA分泌量、HUVEC成网数。结果 与对照组比较，A、B和C组在24 h（F=7.99，P=0.009）和48 h（F=75.09，P=0.000）的VEGFA mRNA表达均显著高于对照组，且B组VEGFA mRNA相对表达量在任意时间点均高于A组和C组（P均<0.05）。受牵拉力的三组的VEGFA-165蛋白相对表达量在24 h（F=51.62，P=0.000）和48 h（F=91.69，P=0.000）明显高于对照组。其中，B组VEGFA-165蛋白相对表达量在24 h（0.794±0.045）分别是A组的1.3倍（P=0.012）和C组的1.2倍（P=0.043），且在48 h（1.192±0.042）VEGFA-165蛋白相对表达量分别是A组的1.4倍（P=0.0001）和C组的1.3倍（P=0.0001）。随着时间延长，在24 h（F=131.16，P=0.0001）、36h（F=66.56，P=0.0001）和48 h（F=605.19，P=0.0001）A、B和C组细胞上清液VEGFA浓度明显高于对照组。体外成管实验中，48 h受牵拉力各组成网数均显著高于对照组（F=13.13，P=0.002），而24 h仅B组成网数有明显升高（P=0.029）。结论 牵拉力可诱导RPE细胞VEGF过表达，且具有时间效应和潜在的促新生血管形成的功能。     

抗血管生成作用的VEGFxxxb在缺氧视网膜色素上皮细胞中的表达

背景 缺氧可诱导视网膜色素上皮（RPE）细胞分泌血管内皮生长因子A（VEGF-A）,从而促进脉络膜新生血管（CNV）形成.VEGF-A依选择性剪接方式的不同,可形成具有促血管生成作用的VEGFxxx和具有抗血管生成作用的VEGFxxxb,但后者在常氧和缺氧状态下在人RPE细胞中的表达变化及其作用尚不清楚.目的 从mRNA水平和蛋白水平检测模拟缺氧状态培养的RPE细胞中VEGFmb的表达,研究VEGFxxxb在常氧和缺氧培养的RPE细胞中的表达变化.方法 以人RPE细胞系ARPE-19为研究对象,将150 μmol/L化学诱导剂CoC12加入细胞培养液制备缺氧细胞模型,分别于0h（常氧培养）及缺氧培养3、6、12和24 h收获细胞或细胞上清液,采用逆转录PCR（RT-PCR）法检测细胞内VEGFxxxmRNA和VEGFxxxb mRNA的表达;采用Western blot法检测细胞内总VEGF-A蛋白和VEGFxxxb蛋白的表达;采用ELISA法检测细胞上清中总VEGF-A蛋白和VEGFxxxb蛋白的含量.结果 在常氧及诱导缺氧后,ARPE-19细胞中均可检测到VEGFxxxmRNA和VEGFxxxb mRNA的表达,检测出的VEGFxxxmRNA中同时出现VEGF121、VEGF165和极微弱的VEGF189条带;检出的VEGFxxxb mRNA中可见VEGF165b条带.缺氧培养的细胞中随着缺氧时间的延长,VEGFxxxmRNA显示出表达逐渐增加的趋势,而VEGFxxxb mRNA则显示出表达逐渐减少的趋势.Western blot法可检测到细胞中VEGFxxxb蛋白的表达,尤以VEGF165b表达最强,随缺氧培养时间的延长,VEGF165b蛋白表达逐渐减少.培养的细胞上清中VEGFxxxb蛋白质量浓度由常氧培养时的（166.82±2.55） pg/ml下降至缺氧培养24 h的（125.35±2.10）pg/ml,而总VEGF-A蛋白则由（294.27±11.97） pg/ml上升至（582.26±12.98） pg/ml.细胞中VEGFxxxbb蛋白占总VEGF-A蛋白的比例随缺氧培养时间的延长,由常氧培养条件下的（56.71±1.02）％逐渐下降至缺氧培养24 h的（21.53±0.08）％.结论 ARPE-19细胞在常氧和缺氧培养条件下均可检测到VEGFxxxbb mRNA和蛋白的?     

自噬在高糖条件下视网膜色素上皮细胞表达血管内皮生长因子促进RF/6A细胞血管生成中的作用

目的　研究高糖条件下诱导的人视网膜色素上皮细胞株（ARPE-19）自噬对其表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），及恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞（RF/6A）迁移和管腔形成的影响。方法　根据不同干预将ARPE-19细胞随机分为对照组、高糖组及3-甲基腺嘌呤（3-MA）+高糖组。对照组细胞在无糖DMEM培养基中常规培养24 h，高糖组细胞在DMEM培养基中加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h，3-MA+高糖组细胞先用10 mmol·L^-1 3-MA处理24 h，然后更换培养基再加入30 mmol·L^-1葡萄糖溶液处理24 h。Western blot法检测细胞自噬标志性蛋白微管相关蛋白1 轻链 3（microtubule-related protein 1 light chain 3，LC3）II型和I型的比值(LC3-II/LC3-I)、Beclin-1及细胞中自噬相关基因3（autophagy-related gene 3，Atg3）的蛋白表达。ELISA法检测ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达。比较三组ARPE-19细胞LC3-II/LC3-I、Beclin-1、Atg3及VEGF的蛋白表达量。然后将以上三组ARPE-19细胞上清液分别加入RF/6A细胞培养基中，将RF/6A细胞也按以上方法分组，分别采用Transwell法及Matrigel胶法检测并比较三组RF/6A细胞迁移数及细胞管腔形成数。结果　对照组、高糖组和3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/LC3-I比值分别为0.405±0.095、0.932±0.024和0.635±0.048；Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.205±0.035、0.590±0.120和0.425±0.082；Atg3蛋白相对表达量分别为0.277±0.035、0.539±0.071和0.389±0.019。ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达量三组分别为（44.03±9.08）ng·L^-1、（205.70±17.90）ng·L^-1和（112.52±21.06）ng·L^-1；RF/6A细胞迁移数三组分别为（125.60±6.35）个、（153.60±19.20）个和（67.40±7.95）个；细胞管腔形成数三组分别为（12.22±0.84）个、（18.44±1.68）个和（5.44±0.51）个；整体比较差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与对照组相比，高糖组ARPE-19细胞的LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1及Atg3蛋白相对表达量均明显增加（均为P<0.01），VEGF表达水平均明显升高（P<0.01），RF/6A细胞迁移数和管腔形成数均明显增加（均为P<0.01），3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-II/I比值、Beclin-1和Atg3蛋白相对表达量、VEGF表达量、RF/6A细胞迁移数和细胞管腔形成数均较高糖组明显降低（均为P<0.01）。结论　高糖激活ARPE-19细胞自噬，进而上调VEGF的表达并促进RF/6A细胞迁移和管腔形成，自噬抑制剂3-MA可抑制ARPE-19细胞自噬，并下调VEGF的表达从而抑制RF/6A细胞的血管形成能力。     

视网膜色素上皮细胞 LncRNA MEG3在不同葡萄糖浓度下的表达情况及对VEGF和 TGF-β1表达的影响

目的　探讨长链非编码RNA母系表达基因3（LncRNA MEG3）在不同浓度葡萄糖下表达情况及对血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。 方法　按照不同浓度d-葡萄糖培养ARPE-19细胞,随机分为5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、30 mmol·L^-1d-葡萄糖组。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测各组ARPE-19细胞LncRNA MEG3、VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平。ARPE-19细胞转染PCDNA-MEG3及PCDNA-NC质粒,建立LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞及转染空质粒的ARPE-19细胞。以含30 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM分别培养以下各组ARPE-19细胞:LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞(O组);转染空质粒的ARPE-19细胞（NC组）;加入PBS的正常ARPE-19细胞(G组);同时以含5 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM培养正常ARPE-19细胞（C组）;以上各组细胞培养24 h后,采用RT-qPCR法及Western blot法检测各组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白的相对表达水平。 结果　与5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组和30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与G组和NC组比较,O组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白相对表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论　高糖下调ARPE-19细胞LncRNA MEG3的表达,上调VEGF和 TGF-β1的表达。LncRNA MEG3过表达降低高糖诱导的VEGF和 TGF-β1表达的升高。LncRNA MEG3可能通过抑制VEGF和 TGF-β1的表达调节糖尿病视网膜病变的发展。     

过氧化氢对人视网膜色素上皮细胞内年龄相关性黄斑病变易感因子2表达的影响

目的 研究过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激对人视网膜色素上皮（ARPE-19）细胞内年龄相关性黄斑病变易感因子2（age-related maculopathy susceptibility 2,ARMS2）转录和蛋白水平的影响,初步探讨ARMS2基因在氧化应激中对视网膜色素上皮细胞的作用.方法 实验研究.选用ARPE-19细胞,以浓度为0、100、300、500、700μmol/L的H2O2作用一定时间后,应用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测各浓度组H2O2作用2 h和4 h后ARPE-19细胞生长情况;采用Realtime-PCR（SYBR Green法）和细胞免疫荧光法检测ARMS2的转录及蛋白水平变化.组间比较均采用单因素方差分析,两两比较采用最小显著性差异法,H2O2浓度与细胞活性的关系采用曲线估计分析.结果 五个浓度的H2O2作用ARPE-19细胞4 h后,吸光度值分别为0.531±0.037、0.370±0.017、0.371±0.016、0.330±0.006和0.297±0.012,差异有统计学意义（F=6.782,P=0.007）.曲线估计分析显示H2O2浓度与细胞活性呈高度负相关（r=-0.99.P=0.036）.100～700 μmol/L H2O2作用ARPE-19细胞后,Realtime-PCR结果 Ct值分别为1.154±0.007、1.324±0.022、1.350±0.011、1.280±0.031,差异有统计学意义（F=33.409.P=0.000）;H2O2浓度在300～500 μmol/L范围时,ARMS2基因mRNA表达量达到高峰,之后下降.细胞免疫荧光检测灰度值结果分别为7320±2493、14 300±848、22400±1596、23400±2405、19 200±561,差异有统计学意义（F=22.843,P=0.000）;H2O2浓度在300～500 μmol/L范围时,ARMS2蛋白表达量达到高峰,之后下降.转录和蛋白水平变化趋势一致.结论 H2O2在一定浓度范围内时,可诱导氧化应激,使ARPE-19细胞内ARMS2转录和蛋白水平增加,如果H2O2的浓度超过ARPE-19细胞耐受范围,ARMS2基因表达量下降.     

三氧化二砷对表皮生长因子诱导的视网膜色素上皮细胞增生和迁移的影响

背景 细胞因子失衡所导致的视网膜色素上皮(RPE)细胞的异常增生和迁移是增生性玻璃体视网膜病变( PVR)的主要病理变化之一.三氧化二砷(As2O3)是中国传统中药中的有效成分,可有效抑制肿瘤细胞的增生和迁移.但As2O3对细胞生长因子引起的RPE细胞增生和迁移的影响尚未明确. 目的 探讨As2O3对表皮生长因子(EGF)诱导的ARPE-19细胞增生和迁移的影响.方法 用无血清培养基对RPE细胞系ARPE-19细胞进行培养,将终浓度为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μmol/L的As2O3分别加入到无血清培养基和含10 mg/L EGF的ARPE-19细胞培养液中作用24 h和48 h,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测各培养组ARPE-19细胞活性的吸光度(A)值,以探讨As2O3对细胞的药物毒性作用,并筛选安全、有效的As2O3作用浓度.用10 mg/L EGF加入培养基诱导ARPE-19细胞迁移,分别在培养板中加入0、0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3 作用24 h和48 h,并通过划痕试验和Transwell试验检测As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞迁移的影响.结果 MTT法检测发现不同浓度As2O3组作用24 h和48 h后,无血清培养组细胞A值随As2O3浓度的升高而逐渐下降,总体差异有统计学意义(F浓度=38.269,P=0.000;F时间=0.874,P=0.358).与空白对照组(0μmol/LAs2O3组)比较,0.5～ 5.0 μmol/L As2O3组ARPE-19细胞A值的差异均无统计学意义(P＞0.05).对含10 mg/LEGF组的ARPE-19细胞,药物对细胞A值的影响呈现浓度和时间依赖性(F浓度=152.155,P=0.000;F时间=51.649,P=0.000).与对照组比较,0.5～2.0μmol/L As2O3加入24 h和48 h后,A值的变化差异均无统计学意义(P＞0.05),而0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3加入10 mg/L EGF诱导的ARPE-19细胞中作用24h和48 h后,A值的变化差异均无统计学意义(F浓度=2.215,P=0.126;F时间 =2.230,P=0.155).5.0 ～20.0 μmol/L As2O3作用于EGF诱导的ARPE-19细胞中作用后,细胞A值明显下降,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),5.0～20.0 μmol/L As2O3作用24 h后,对EGF诱导的ARPE-19细胞增生抑制率分别为12％、32％、37％;作用48 h后细胞抑制率分别为39％、44％和53％.划痕试验结果显示,0.5～2.0 μmol/L As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞的横向迁移具有抑制作用.Transwell试验结果表明,0.5～2.0 μmol/L As2O3对10 mg/L EGF诱导的ARPE-19细胞纵向迁移有明显的抑制作用,0.5、1.0、2.0μmol/L As2O3作用12h对ARPE-19细胞的抑制率分别为22％、33％和46％. 结论 As2O3在一定浓度范围内对ARPE-19细胞无毒性作用,2.0 μmol/L以下浓度的As2O3对EGF诱导的ARPE-19细胞增生无明显影响,但可影响细胞的迁移能力,5.0 μmol/L以上浓度的As2O3可明显抑制ARPE-19细胞的增生.     

光诱导对人视网膜色素上皮细胞自噬和凋亡的影响

研究人视网膜色素上皮（RPE）细胞光损伤中自噬与凋亡之间的关系,并探讨自噬抑制剂3甲 基腺嘌呤（3MA）对光诱导下RPE细胞自噬和凋亡的影响。方法：实验研究。将体外培养的人RPE细 胞（ARPE-19）随机分为12 h对照组、12 h模型组、12 h 3MA组以及24 h对照组、24 h模型组、24 h 3MA组。对照组采用锡纸包裹避光培养;模型组接受光照刺激;3MA组中加入3 mmol/ml 3MA后接 受光照刺激,以自制三基色LED（发光二极管）冷光灯作为光源,在（16 500±500）lx光照强度下照 射细胞12 h和24 h。透射电子显微镜观察每组细胞超微结构,流式细胞仪测定细胞存活率,激光共 聚焦结合倒置荧光显微镜定性、定量分析自噬-溶酶体形态及荧光强度,Western blot法检测Beclin 1、 LC3和P62自噬相关蛋白表达量。数据采用单因素方差分析。结果：在光照12 h后,ARPE-19细胞自 噬水平可以抵抗光损伤,降低细胞凋亡率（F=931.53,P<0.001）;光照24 h后细胞自噬水平超过其正 常调节范围,细胞凋亡率升高,差异有统计学意义（F=1156.67,P<0.001）;使用3MA可抑制光诱导 的ARPE-19细胞过度自噬,降低细胞凋亡率（F=2.856,P=0.027）,进而保护细胞以应对光损伤。结论： ARPE-19自噬水平随光照时间而变化;随着光照时间延长,细胞凋亡率升高。抑制细胞的过度自噬 可以保护ARPE-19细胞应对光损伤。     

吲哚美辛对脉络膜黑色素瘤细胞增生活性的影响及作用机制

目的　观察环氧化酶抑制剂吲哚美辛（IN）对脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1增生活性的影响并探讨其作用机制。方法　体外培养OCM-1细胞,采用25、50、100、200、400 μmol/L IN对OCM-1细胞进行干预,应用四氮唑化合物（MTT）法检测不同浓度IN对OCM-1细胞增生活性的影响;侵袭实验检测IN对OCM-1细胞侵袭力的影响;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测IN对OCM-1细胞内血管内皮生长因子（VEGF）及凋亡抑制因子（survivin） mRNA表达的调节作用;免疫荧光化学检测OCM-1细胞内VEGF、survivin蛋白的定位及表达,酶联免疫吸附测定（ELISA）及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测IN对OCM 1细胞内VEGF、survivin蛋白表达的影响。结果　不同浓度IN对OCM 1细胞的增生及侵袭均有明显的抑制作用,其抑制率呈浓度-时间依赖性（MTT: 24 h：F=19.642,P＜0.01;48 h：F=136.597,P＜0.01;72 h：F=582.543,P＜0.01;侵袭实验：F=54.225,P＜0.01）。免疫荧光化学检测结果显示：VEGF、survivin 2种因子在OCM-1细胞内均呈阳性表达且多数表达于细胞胞浆内;RT-PCR检测结果显示：100、200、400 μmol/L IN可抑制OCM-1细胞内survivin mRNA的表达（F=16.679,P＜0.01）,但对细胞内VEGF mRNA的表达无抑制作用。ELISA法测出未用药组、100、400 μmol/L IN作用OCM-1细胞24 h后,细胞内survivin的浓度分别为（787.33±47.37）、（257.00±26.21）、（123.33±8.02） pg/ml;Western blot进一步验证了IN可抑制OCM-1细胞内survivin蛋白的表达,但对VEGF的表达无抑制作用。结论　IN能够抑制OCM-1细胞的增生及侵袭,其机制可能与其下调OCM-1细胞内survivin因子的表达有关。     

PDGF对人RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响

背景研究表明血小板源性生长因子（PDGF）能调节多种细胞中基质金属蛋白酶／基质金属蛋白酶组织抑制剂（MMP／TIMP）的表达和平衡,但视网膜色素上皮（RPE）细胞中MMP／TIMP的表达与PDGF作用剂量和作用时间的关系尚不明确。目的观察PDGF对RPE细胞中MIP-2、MMP-9和TIMP-1表达的影响。方法体外培养人RPE细胞系ARPE-19,将达到70％～80％融合的细胞分为5个组。分别将0、0．1、1、10、50mg／LPDGF加入RPE细胞培养基作用36h,分别采用逆转录PCR（RT—RCR）法和Western blot法检测各组RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及其蛋白的表达。PDGF组采用10mg／LPDGF组PDGF分别刺激RPE细胞24、36和48h,对照组用不含PDGF的培养液培养,采用逆转录PCR（RT—RCR法和Western blot法分别检测RPE细胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA及蛋白的表达。结果随着PDGF质量浓度的增加和刺激时间的延长,RPE细胞生长速度加快,细胞增生明显。PDGF刺激RPE细胞36h,随着PDGF质量浓度的增加,MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA在RPE细胞中表达相对值逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F=79．304,P=0．000;MMP-9 mRNA：F=8．465,P=0．003）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值随着PDGF质量浓度的增加而逐渐增加,各组间差异均有统计学意义（MMP-2：F=26．550,P=0．000;MMP-9：F=80．993,P=0．000）,其中1、10、50mg／LPDGF组RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显高于0mg／L PDGF组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。各质量浓度PDGF组RPE细胞中TIMP-1 mRNA和蛋白表达相对值差异均无统计学意义（F=0．143,P=0．962;F=1．955,P=0．178）。随着10mg／L PDGF刺激RPE细胞时间的延长,RPE细胞中MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表达逐渐增加,差异均有统计学意义（MMP-2 mRNA：F时间=83．250,P=0．002;MMP-9 mRNA：F时间=6．785,P=0．019）;各时间点RPE细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达相对值明显增加,差异均有统计学意义（MMP-2：F时间=11．185,P=0．041;MMP-9：F时间=968．413,P=0．000）。PDGF作用不同时间点对照组与PDGF组间MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白在RPE细胞中的表达差异均有统计学意义（分组：均P=0．000,时间点：P〈0．05）,而各时间点2个组间RPE细胞中TIMP-1表达相对值的差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论PDGF上调PRE细胞中MMP-2和MMP-9的表达,其作用呈剂量和时间依赖性,但对PRE细胞中TIMP-1的表达无明显影响。PDGF导致RPE细胞中MMP／TIMP的平衡失调,从而导致细胞外基质的破坏,促进RPE细胞的迁移。     

缺氧对人视网膜色素上皮细胞G蛋白信号转导调节子5表达的影响及其可能机制

目的探讨缺氧环境下人视网膜色素上皮（RPE）细胞中G蛋白信号转导调节子5（RGS5）表达的可能机制。方法实验研究。在正常培养的人RPE细胞培养基中加入终浓度为200／μmol／L的CoCl：建立细胞化学缺氧模型。按缺氧时间分为0、1、3、6、12和24h6组,观察RGS5和血管内皮生长因子（VEGF）表达的变化;另选取12和24h作观察点,按处理因素分为缺氧对照组和VEGF抑制剂Bevacizumab处理组,Bevacizumab包括25、100和250肛咖l3种浓度,观察特异性抑制VEGF表达对RGS5表达产生的影响。应用免疫荧光染色法、Western blot和RT-PCR分别检测RGS5及其mRNA和VEGF蛋白及其mRNA的表达。采用Student’s t检验进行统计学分析。结果正常条件下,RGS5主要在人RPE细胞胞浆中表达。与VEGF存在相同表达区域。随着缺氧时间的延长,RPE细胞中RGS5蛋白及其mRNA表达逐渐上调,24h时达高峰（0．932±0．104,t=3．106,P=-0．01l;0．742±0．083,t=2．852,P=-0．017）;VEGF蛋白及其mRNA表达12h达高峰（1．022±0．141,t=4．144,P=0．002;0．491_＋0．063,t=5．707,P〈0．01）,24h时有所下降,但仍高于无缺氧的RPE细胞（0．942±0．125,t=3．306,P=0．008;0．425±0．080,t=3．239,P=0．011）。浓度为100和250μg／ml的Bevacizumab有效抑制VEGF蛋白（￡=2．794,P=0．019;t=3．396,P=0．007）和其mRNA（t=2．823,P=0．018;t=9．584,P〈0．01）表达后,RGS5蛋白（t=2．953,P=0．014;t=2．913,P=0．015）和其mRNA（t=3．009,P=-O．013;t=4．243,P=-0．002）表达也随之受到抑制。结论缺氧条件下人RPE细胞RGS5表达上调,并与VEGF表达具有时相关系;抑制VEGF表达后,RGS5表达随之降低。提示RGS5位于VEGF信号通路下游,可能参与缺血缺氧性RPE相关眼病发生的调控。     

质粒介导RNA干扰抑制视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮生长因子表达

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）短发夹RNA（shRNA）表达质粒稳定转染对视网膜母细胞瘤（RB）细胞中VEGF表达的作用。方法构建VEGF shRNA表达质粒p4．1CMV—VEGF shRNA,以脂质体介导其转染两种RB细胞系SO—RB50和HXO—RB44,新霉素筛选结合梯度稀释法获得p4．1CMV—VEGF shRNA阳性RB细胞单克隆,继续培养扩增建立p4．1CMV—VEGF shRNA阳性RB细胞,用荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测RB细胞中VEGF基因的表达,并用酶联免疫吸附（ELISA）法检测RB细胞上清中VEGF蛋白的表达;以与哺乳动物基因组无同源性的shRNA表达质粒p4．1CMV—Neg shRNA作为阴性对照,同时以未做任何处理组作为空白对照。结果成功构建p4．1CMV—VEGF shRNA并获得其表达阳性的RB细胞克隆。阴性对照组和空白对照组SO-RB50细胞的VEGF基因表达量分别为实验组的5．02倍和6．32倍;阴性对照组和空白对照组HXO—RB44细胞分别为实验组的5．70倍和4．86倍。实验组SO—RB50细胞上清中,VEGF蛋白浓度为（187．69±83．89）μg/L,显著低于阴性对照组（822．98±187．98）μg/L和空白对照组（865．76±170．33）μg／L,差异有统计学意义（均P〈0．01）;实验组HXO—RB44细胞上清中,VEGF蛋白浓度为（162．20±66．33）μg／L,与阴性对照组（764．33±164．79）μg／L和空白对照组（828．22±145．94）μg／L比较,差异也有统计学意义（均P〈0．01）。结论VEGF shRNA表达质粒稳定转染可高效抑制RB细胞中VEGF的表达,靶向VEGF的RNA干扰可作为拮抗VEGF并治疗RB的有效手段。（中华服科杂志,2007,43：493-498）     

全反式维甲酸诱导的Cx43基因在RB细胞中的过表达及其对RB生长的抑制作用

背景诱导细胞间隙连接蛋白（＆）基因在瘤细胞中过表达是全反式维甲酸（ATRA）抑制肿瘤细胞生长的重要机制。我们先前的研究已证实,ATRA抑制视网膜母细胞瘤（RB）细胞增生、分化作用的机制与诱导Cx43过表达有关,但药物作用位点及其对在体肿瘤组织生长的影响尚未明确。目的研究ATRA对RB细胞中Cx43基因及其蛋白表达的影响,探讨其作用机制。方法用无水乙醇将ATRA溶解并配制成浓度为1×10^-2mol／L的溶液,使用前再用细胞培养液配制成不同浓度ATRA液。用含体积分数10％热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养液常规培养人RB细胞株HXO—RB44,将1×10^5-×10“和1×10^-2mol／L的ATRA分别加至培养基中,分别于添加后2、4、6d采集细胞,分别采用Westernblot法和逆转录PCR法检测细胞中Cx43蛋白及mRNA的表达变化。选取15只BALB／c裸鼠,将RB细胞悬液1恤l（含5×10^5个细胞）进行裸鼠右眼前房注射,建立裸鼠眼前房RB模型。将造模成功的11只裸鼠随机分为空白对照组、阴性对照组和1X10。mol／LATRA组,阴性对照组和1×10^-5mol／LATRA组裸鼠分别行0．5％无水乙醇的生理盐水或1×10^-5mol／LATRA前房注射,每3天1次,共注射3周,裂隙灯显微镜下观察各组裸鼠肿瘤生长情况;实验结束时摘除实验眼,用苏木精-伊红染色法进行组织病理学检查。结果Westernblot法检测结果显示,随ATRA作用时间的延长,各组Cx43蛋白表达量（Acx43／AGPDH）均逐渐增加,总体比较差异有统计学意义（F时间=71．31,P=0．00;F分组7．66,P=0．00）;药物作用后2d1×10^-5mol／LATRA组、作用后4d1×10^-6mol／LATRA组、作用后6d1×10^-7mol／LATRA组Cx43蛋白表达量均明显高于空白对照组,差异均有统计学意义（t=3．34,P〈0．叭;t=2．33,P〈0．05;t=3．12,P〈0．01）。逆转录PCR检测结果显示,随ATRA作用时间的延长,各组Cx43 m     

NY-ESO-1致敏树突状细胞诱导的细胞毒性T淋巴细胞对视网膜母细胞瘤细胞的特异性

背景目前用细胞免疫的方法治疗视网膜母细胞瘤（RB）成为新的研究热点,肿瘤-睾丸抗原是最具免疫原性的人类肿瘤抗原之一,已用于全身一些肿瘤的免疫治疗,但其对RB治疗作用的研究报道较少。目的探讨肿瘤-睾丸抗原的NewYork—esophageal-1（NY—ESO-1）致敏树突状细胞（DCs）诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对RB细胞株HXO—RB44的杀伤作用。方法用聚合酶链反应（PCR）技术对NY—ESO-1质粒的目的基因片段进行扩增,使用SalⅠ限制酶和EcoRI限制酶进行双酶切,切胶回收DNA片段。将其连接入pDC316质粒,构建pDC316／NY—ESO．1真核表达载体并再进行酶切鉴定。免疫荧光及Western blot法检测NY—ESO-1蛋白在HXO．RB44细胞株中的表达。Ficoll法分离血获得单个核细胞,通过RPMI1640重悬,调整细胞密度为1×10。个／ml,通过重组人集落刺激因子（rhGM—CSF）和重组人白细胞介素4（rhlL-4）诱导培养外周血来源的DCs,通过重组质粒转染DCs,以脂多糖诱导DCs成熟,DCs与淋巴细胞数量比为1：25的比例混合培养HXO．RB44细胞,通过MTT法检测CTL的增生情况。在培养液中同时加入CTL细胞,MTT法检测HXO—RB44细胞的活力。结果重组质粒pDC316／NY—ESO-1的目的片段序列与NY-ESO-J基因序列完全相同,酶切鉴定结果与预期一致。Western blot法以及免疫荧光检测结果显示,NY—ESO．1在细胞株HXO．RB44中呈强阳性表达。经rhGM．CSF和rhlL-4成功诱导出的外周血DCs,重组质粒转染后其表型分子分别是HLA—DR为42．1％,CD80为54．2％,CD83为39．7％,CD86为94．8％。MTT法检测表明,pDC316／NY—ESO-1质粒转染的DCs诱导的CTL组的增生能力强于未转染组,致敏的DCs与淋巴细胞比例为1：100时诱导CTL效果最为显著,与未转染组比较差异有统计学意义（P〈0．05）,CTL对肿瘤细胞的杀伤作用明显强于未转染组和无DCs组,且效靶比为75：1时杀伤率最强,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论NY—ESO-1质粒转染DCs诱导的CTL对RB细胞具有特异性杀伤作用,为RB免疫治疗提供了一种新的方法。     

羊膜对人视网膜色素上皮细胞增生和分化的影响

背景人视网膜色素上皮（RPE）细胞移植治疗视网膜变性性疾病是目前的研究热点之一,许多生物载体可制备RPE细胞单层,但多存在着细胞毒性、稳定性差及免疫反应等问题。目的检测羊膜对人RPE细胞增生和分化的影响,探讨其作为人RPE细胞层载体进行移植的可能性。方法将RPE细胞系ARPE-19细胞株用含质量分数10％胎牛血清的DMEM／F12培养基进行培养和传代,8～12代细胞用于实验。将传代细胞分为2个组,一组细胞接种于去上皮羊膜作为实验组,另一组细胞直接在培养孔内进行培养作为对照组。分别于接种后24、48、72、96h行MTT实验,测定RPE细胞的吸光度（A492）值以评估两组细胞在增生能力方面的不同;培养3周后的细胞层行苏木精-伊红染色,检测细胞在不同培养载体上是否存在形态学方面的区别;分别收集同一孔中生长于羊膜和培养板表面的细胞,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测色素上皮衍生因子（PEDF）、钙黏蛋白（N—cadherin）、β-连环蛋白（β—catenin）以及细胞连接相关蛋白的表达情况;同时收集培养3周时的细胞行透射电子显微镜和扫描电子显微镜检查,比较不同载体培养的ARPE-19细胞在超微结构方面的区别。结果与对照组相比,实验组细胞增生的速度明显变缓,两组细胞增生情况比较差异有统计学意义（F=41．760,P=0．000）。苏木精-伊红染色结果显示,同一培养孔内实验组的细胞密度明显低于对照组,说明羊膜对ARPE-19细胞增生的影响不是通过细胞分泌的可溶性因子的作用。RT—PCR结果显示,实验组细胞连接相关蛋白claudin 1、N—cadherin和PEDF mRNA在培养细胞上的表达水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义（t=15．828,P=0．000;t=6．839,P=0．002;t=14．667,P=0．000）;Connexin 43的表达低于对照组,差异有统计学意义（t=3．358,P=0．024）。超微结构分析发现羊膜载体上的细胞呈典型的多边形RPE细胞表型,分化现象明显,而普通培养板培养的RPE细胞形态主要呈梭形,细胞层厚薄不均。结论去上皮羊膜为载体培养的RPE细胞增生速度变慢,但培养的细胞分化程度较高,提示羊膜可作为RPE细胞体外培养的良好载体,用于制备移植所需功能成熟的RPE细胞片层。     

超声微泡介导Rb94联合野生型p53基因对鼠视网膜母细胞瘤的抑制

背景研究表明,野生型p53（wtp53）和Rb94基因对人视网膜母细胞瘤（RB）的生长均有抑制作用,这2个基因是诱导和维持细胞衰老信号通路中重要的参与基因,因此2个基因联合应用是否对RB的生长抑制效果更好是近来关注的问题。目的观察超声微泡介导Rb94联合wtp53基因转染裸鼠RB后对其凋亡的影响。方法将HXO—Rb44细胞悬液种植至40只雌性SPF级BALB／e裸鼠视网膜下腔建立RB动物模型,造模成功的裸鼠按随机数字表法平均分为模型对照组、wtp53质粒组（含wtp53质粒的微泡悬液）、Rb94质粒组（含Rb94质粒）和wtp53＋Rb94质粒组（联合组）（含wtp53质粒及Rb94质粒）,其中模型对照组不做任何处理,其他3个组造模后第7天均由鼠尾静脉注入含相应基因的微泡悬液后,每天以0．5W／cm^2。超声波辐照眼球4S,间隔24S,循环2次。转染基因超声辐照7d摘除肿瘤组织,利用半定量逆转录PCR（RT—PCR）法检测肿瘤组织中wtp53mRNA及Rb94mRNA的表达;采用Western blot法检测基因转染的肿瘤组织中wtp53及Rb94蛋白的表达;用免疫组织化学法测定肿瘤组织中血管内皮生长因子（VEGF）的表达;采用TUNEL法检测基因转染后肿瘤组织的凋亡情况,计算凋亡指数（AI）。结果HXO-Rb44细胞悬液视网膜下腔注射后移植瘤构建的成功率为80％（32／40）,常规组织病理学检查提示检测样本的细胞异型性明显。基因转染后7d,模型对照组无wtp53mRNA及Rb94mRNA的表达条带;wtp53组wtp53mRNA相对值为0．65±0．07,wtp53＋Rb94组为0．32±0．02,差异有统计学意义（t=11．743,P=0．000）;Rb94组Rb94mRNA相对值为0．42±0．03,wtp53＋Rb94组为0．23±0．03,差异有统计学意义（t=5．041,P=0．001）。wtp53、Rb94或wtp53＋Rb94转染后,各组可见与转染相应的蛋白表达条带,wtp53＋Rb94组可同时检测到wtp53及Rb94蛋白的表达条带,但模型对照组无任何基因反应条带。免疫组织化学染色表明,wtp53＋Rb94组肿瘤细胞中VEGF阳性反应强度明显弱于wtp53组、Rb94组和模型对照组。wtp53＋Rb94组AI为37．35±2．14,明显高于模型对照组的0．46±0．05、wtp53组的5．05±O．80和Rb94组的6．43±1．02,差异均有统计学意义（t=-34．395、-28．206、-26．006,P〈0．01）。结论超声微泡造影剂可介导双基因联合转染RB移植瘤,且Rb94联合wtp53基因对RB细胞的促凋亡作用较单基因转染增强。     

人羊膜上皮细胞培养液抑制角膜新生血管的实验研究

背景 角膜新生血管(CNV)是一种常见的眼部病变,研究其发病机制及其抑制剂是眼科研究的热点和难点. 目的 研究人羊膜上皮细胞(AECs)培养液对CNV的抑制作用及机制. 方法 消化法培养及鉴定人AECs,并收集培养液,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测色素上皮衍生因子(PEDF)和白细胞介素1受体拮抗剂( IL-1Ra)在培养液中的质量浓度.兔角膜上皮细胞分离后分别用无血清DMEM培养基、人AECs培养液、混合培养液(DMEM+人AECs培养液)培养48 h,采用实时定量聚合酶链反应(QRT-PCR)法检测不同培养液培养的角膜上皮细胞中血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达.用含质量分数10％胎牛血清的DMEM培养基培养人脐静脉血管内皮细胞(UVECs),并分别加入无血清DMEM、混合培养液和人AECs培养液,划痕法和细胞计数试剂盒8(CCK8)法检测各组培养液对人UVECs迁移的影响.分别在上述3种培养基中加入终质量浓度为50 μg/L的bFGF,CCK8法检测各培养液中人UVECs的增牛情况.在原子力显微镜(AFM)下观察人AECs培养液对人UVECs超微结构的影响. 结果 人羊膜培养和传代细胞角蛋白免疫组织化学染色阳性证实为人AECs.与无血清DMEM组相比,人AECs培养液组的兔角膜上皮细胞VEGF mRNA(1.00±0.22 vs.2.98±0.46)及bFGF mRNA( 1.00±0.36vs.2.55±0.48)的表达均明显下降,差异均有统计学意义(P=0.001、0.002);培养后不同时间人AECs培养液组人UVECs的增生吸光度(A)值明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05),人UVECs的迁移率下降,差异有统计学意义(P＜0.05).AFM观察见人AECs培养液组的血管内皮细胞膜粗糙、表面颗粒紊乱,细胞间连接及伪足减少.ELISA法检测人AECs培养液中PEDF的质量浓度为(70.41 ±0.68) μg/L,IL-1Ra的质量浓度为(153.56±0.36) ng/L,无血清DMEM组中未检出.结论 人AECs培养液可抑制角膜上皮VEGF及bFGF的表达,抑制血管内皮细胞的增生和迁移,细胞结构和功能改变,这可能是其抑制CNV的机制之一.     

翼状胬肉细胞之间的相互作用

目的探讨翼状胬肉中血管内皮细胞和成纤维细胞之间的相互作用。方法收集翼状胬肉标本,采用血管内皮细胞和成纤维细胞单独培养、条件培养和共同培养的方法构建培养体系,采用ELISA和RT—PCR法检测3种体系培养上清液和细胞中血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）蛋白及mRNA含量的变化。结果单独培养、条件培养和共同培养各组培养上清液中VEGF和bFGF的质量浓度增加,差异均有统计学意义（P〈0．05）;细胞单独培养、条件培养和共同培养三者相比,VEGF和bFGF的mRNA表达升高,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论内皮细胞和成纤维细胞有相互上调作用,2种细胞在翼状胬肉的发生发展过程中相互促进。