湖北钉螺肝脏细胞原代培养的初步研究

目的 研究湖北钉螺肝脏细胞的原代培养方法，观察肝脏细胞琥珀酸脱氢酶（SDH）和乳酸脱氢酶（LDH） 的活性分布。 方法 解剖湖北钉螺取肝脏，用0.2%（体积比）苯扎溴铵（新洁尔灭）浸泡及含抗生素的生理盐水无菌洗涤、磨碎、过滤，收集肝脏细胞。采用联合法和静置悬浮法接种培养。细胞培养液配方: 50 ml M199溶液、3 mg/ml 水解乳蛋白溶液30 ml(平衡盐溶液配制)及胎牛血清20 ml, 混匀，附加常量抗生素（青霉素100 IU/ml、链霉素100 μg/ml、卡那霉素50 μg/ml），混匀，调节pH值为7.2～7.4。于26.5 ℃ 培养。联合法培养的肝脏细胞分别进行Giemsa、SDH和LDH染色，显微镜观察活细胞与染色细胞形态、SDH和LDH的分布，以及观察静置悬浮法培养的肝脏细胞形态。 结果 联合法培养的肝脏细胞贴壁后形态各异，以圆形、椭圆形为主, 也有三角形和不规则形等。细胞大小约（4～16） μm×（6～20） μm。较小细胞形成细胞簇，细胞核不明显，细胞质丰富、透亮。散在分布的单个细胞稍大，细胞核较大而明显，细胞质较少。培养5～7 d 的肝脏细胞逐渐退化。Giemsa染色将细胞分为两种，一种为细胞质呈蓝色，细胞核紫红色；另一种是细胞质呈紫红色，细胞核呈蓝色。SDH和LDH染色，细胞质出现大小不同、深浅不一的蓝色颗粒。静置悬浮法培养的肝脏细胞不易贴壁，多为圆形，细胞核不明显。细胞较小，约为（4～6） μm×（6～8） μm。培养3 d 均被细菌污染。 结论 联合法更适合湖北钉螺肝脏细胞原代培养，SDH和LDH活性位于肝脏细胞质中。     

湖北钉螺酚氧化酶组织化学定位进一步研究

目的观察酚氧化酶（PO）在日本血吸虫中间宿主湖北钉螺体内的组织学分布。方法湖北钉螺成螺采自芜湖江滩,解剖后取无损伤软体组织整体,用冰冻切片定位法作连续切片,置于含25mmol／L邻苯二酚的磷酸盐缓冲液（pH6．8）中,温箱37℃孵育30rain后系统观察酚氧化酶与底物反应后的产物在螺体内的分布情况。结果光学显微镜下显示在钉螺体内的肝脏、外套膜、头足部、触角、腮叶等处都出现酶组织化学反应的黑色阳性颗粒。结论钉螺体内存在酚氧化酶,其分布于钉螺的肝脏、外套膜、头足部、触角、腮叶等组织。     

改良压碎逸蚴法批量检测感染性钉螺效果观察北大核心CSCD

目的评价改良压碎逸蚴法批量检测感染性钉螺效果。方法将钉螺分为50只、100只、150只、200只、250只、300只、400只、500只和600只9个批量,选择50、100、150、250ml三角烧瓶4组,对投放不同批量钉螺采用改良胜醉逸蚴法接种环取样,观察不同容积烧瓶中感染性钉螺检测符合率。结果静置l5rain取样镜检,每瓶投放碎螺组织50～250只,50、100、150、250ml等4组容积三角烧瓶的尾蚴检出率均为100％,符合率100％;4组三角烧瓶每瓶投螺300～400只,尾蚴检出率依次为0、100％、100％、100％,每瓶投螺500～600只,尾蚴检出率依次为0、0、0、100％。50和250ml两组烧瓶接种环粘取水膜3环尾蚴检出率100％,符合率100％。结论每瓶投放钉螺〈250只,250ml及以下三角烧瓶均可;投放钉螺250～600只,选择250ml三角烧瓶为宜;静置15min接种环取样效果最佳。     

湖北钉螺体内酚氧化酶及其组织学定位

目的 了解湖北钉螺体内是否存在酚氧化酶（P0），并观察其在钉螺体内分布情况。方法 酶组织化学染色法：湖北钉螺成螺（雄螺和雌螺）采自芜湖江滩，解剖后，将软体组织置含25mmol／L邻苯二酚的磷酸盐缓冲液（pH6．8）中，37℃孵育，体视显微镜下观察PO与底物反应后的产物在螺体内的分布情况。荧光组织化学染色法：解剖后的湖北钉螺成螺软体组织置含25mmol／L邻苯二酚的磷酸盐缓冲液（pH6．8）中，37℃孵育30min，吸去邻苯二酚，加入0．05％戊巴比妥钠溶液，5min后置荧光显微镜下观察PO催化产生的荧光物质在螺体内的分布情况。结果 酶组织化学染色法显示钉螺的肝脏初为淡浅灰色，5min时呈现浅灰色，15min时呈现灰色，30min时呈现黑色。荧光组织化学染色法显示钉螺的肝脏表面呈现荧光反应。结论 湖北钉螺体内存在PO，雌、雄螺体内的PO均定位于肝脏。     

血水草生物碱杀螺、灭蚴作用的研究

目的研究血水草生物碱(ECA)杀灭钉螺及日本血吸虫尾蚴的作用。方法观察实验室及现场浸泡杀螺效果;钉螺接触药物上爬情况;浸泡杀螺卵效果;浸杀尾蚴防护血吸虫感染的作用。结果浸泡72h钉螺死亡率100％的血水草生物碱溶液的浓度及温度分别为:1.25mg/L,30℃;2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L均为25℃。水温 26℃～28℃现场灭螺10mg/L,72h钉螺死亡率84％;20 mg/L,72h死亡率达92％。5mg/L溶液螺卵浸泡72h孵出率为0％～10％。5mg/L ECA溶液明显抑制钉螺上爬,20mg/L时钉螺静止不动。结论血水草有杀灭钉螺、螺卵及日本血吸虫尾蚴的作用,是一种有研究前景的植物杀螺、灭蚴剂。     

茶树籽对钉螺软体体表的影响

目的 :了解钉螺体表经茶树籽浸液作用后的损害状况。方法 :应用扫描电镜比较观察正常钉螺与感染钉螺受茶树籽作用后的体表病损。结果 :浸渍过茶树籽的钉螺头部体表出现大块组织脱落缺损及变形,足部体表增厚 ,出现皱褶变化和大量细胞浸润 ,外套膜前端边缘变粗糙 ,皱褶间有缺损及细胞浸润 ,整个边缘比正常的肿大 ,复盖肝脏部位的内脏囊外形由于较深陷的沟回出现 ,可见凹凸相间的皱褶。结论 :茶树籽浸液能损伤钉螺软体体表结构。     

泽漆乙醇提取物灭螺机理初步研究

目的观察泽漆对钉螺软体组织糖原的影响,以探讨其灭螺机制。方法采用系统分离法分离泽漆极性部位,按照WHO推荐的"杀螺剂实验室终筛方法"中浸泡方法进行浸杀灭螺试验;蒽酮比色法测定经泽漆乙醇提取物处理后钉螺软体组织的糖原含量变化。结果钉螺经泽漆乙醇提取物400、800 mg/L作用48 h,钉螺死亡率分别为50.43%、77.50%;作用96 h,钉螺死亡率均达100%。钉螺体内糖原含量随药物浓度的增大而逐步降低,800 mg/L时糖原下降最明显,较对照组含量下降69.49%。结论泽漆乙醇提取物能够显著降低钉螺体内的糖原含量,具有较好的灭螺效果。     

胶原酶I消化联合筛网过滤法用于人与小鼠着床窗口期子宫内膜原代培养的效果比较

目的 观察胶原酶I消化联合筛网过滤法用于人和小鼠着床窗口期子宫内膜原代培养的可行性及效果.方法 分别以人排卵后5～7d及妊娠第4天为人和小鼠子宫内膜着床窗口期,无菌操作取子宫内膜组织,用胶原酶I消化、筛网过滤后行原代细胞培养并鉴定,观察培养细胞的形态及纯度.结果 人和小鼠原代培养成功率分别为80％、83％(P＞0.05),失败原因包括标本污染及细胞数少;人和小鼠原代培养上皮细胞纯度比较无显著差异,但前者分离的细胞包括上皮细胞和基质细胞两种.结论 胶原酶I消化联合筛网过滤法可为人和小鼠胚胎植入及子宫内膜容受性等进一步研究提供体外培养模型,但取材方法及培养细胞种类有异.     

杀虫丁杀螺效果因素的研究

目的 研究杀虫丁杀螺效果的影响因素。方法 不同温度、作用时间、药液pH值、批号、阳光曝晒及不同类型钉螺条件下杀虫丁浸杀法杀螺试验;不同湿度的泥土的喷洒法杀螺试验。结果 25℃1 d 2mg/L的钉螺死亡率为56．67％,25℃ 2d mg/L或25℃ 3d 1mg/L的钉螺死亡率为96．62％－100．0％ ;偏碱性溶液和泥土含水量大等有利于杀虫丁杀灭钉螺;不同类型钉螺和不同批号药品对杀虫丁杀螺效果影响较小;阳光曝晒则降低杀虫丁的杀螺效果。结论 杀虫丁灭螺的适宜条件是25℃2d 2mg/L或25℃3d 1mg/L以上杀螺效果较好,喷洒25℃含水量大于40％杀螺效果较好。     

湖北钉螺中枢神经节的解剖方法

采用手术止血钳破损螺壳的方法获得湖北钉螺软体组织后,于解剖镜下分离软体组织得到中枢神经节。该法为研究灭螺药物或各种生物与理化因素对湖北钉螺中枢神经节的影响奠定了基础。     

钉螺软体组织蛋白水解酶的初步分析

目的分析钉螺软体组织中的蛋白水解酶。方法以明胶作底物,利用明胶-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离钉螺软体组织蛋白质,于不同缓冲液和酶抑制剂中进行孵育,分析和鉴定其中的蛋白水解酶。结果钉螺软体组织中存在降解明胶的蛋白水解酶,其最适pH值为碱性。金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸二钠(EDTA)可抑制其活性。电泳分离获得有活性的酶蛋白。结论钉螺软体组织中存在被EDTA抑制的蛋白水解酶。     

氯硝柳胺及EDTA对不同螺龄湖北钉螺酚氧化酶活性的影响

目的 探讨氯硝柳胺及EDTA对不同螺龄湖北钉螺酚氧化酶（PO）活性的影响。方法 将不同螺龄湖北钉螺（即成螺、幼螺、螺卵）软体匀浆、离心获取粗制酶液,再依次通过盐析、透析及凝胶过滤层析而获取部分纯化的酚氧化酶酶液。以邻苯二酚作为底物,检测不同浓度氯硝柳胺及EDTA对不同螺龄湖北钉螺PO活性的影响。结果 随着氯硝柳胺和EDTA浓度的增大,不同螺龄湖北钉螺PO活性均逐渐降低。结论 氯硝柳胺和EDTA对不同螺龄湖北钉螺PO活性均有抑制作用。     

湖北钉螺多态微卫星DNA位点筛选和特征初步分析

目的分离湖北钉螺的微卫星DNA序列,筛选多态的微卫星DNA位点并分析其特征。方法应用湖北钉螺基因组DNA的酶切片段与生物素标记的(AAT)17、(GA)25、(CCT)17、(CA)25等10个寡核苷酸探针杂交,富集、浓缩、克隆并测序,构建微卫星DNA库。挑选合适的微卫星DNA位点设计并合成引物,扩增钉螺样本经聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选多态性。结果获得湖北钉螺微卫星DNA序列205条,GenBank注册登记号GU204044～GU204248,其中完整重复序列74条,占36.10%;非完整重复序列102条,占49.76%;复合重复序列29条,占14.15%。设计合成的20对微卫星DNA位点引物中,经鉴定显示13个位点具有多态性。结论分离建立了湖北钉螺微卫星DNA序列库,为湖北钉螺群体遗传、种群溯源等相关研究提供了分子标志。     

Primary porcine hepatocytes with portal vein serum cultured on microcarriers or in spheroidal aggregates

AIM:To develop a culture mode providing durable biomaterials with high yields and activities used in bioartificial liver.METHODS:Hepatocytes were isolated from a whole pig liver by Seglen s method of orthotopic perfusion with collagenase. In culture on microcarriers, primary porcine hepatocytes were inoculated at a concentration of 5center dot10(7)/mL into the static culture systems containing 2g/L Cytodex-3, then supplemented with 100mL/L fetal calf serum (FCS) or 100mL/L porcine portal vein serum (PPVS) respectively. In spheroidal aggregate culture hepatocytes were inoculated into 100mL siliconized flasks at a concentration of 5.0center dot10(6)/mL.RESULTS:In culture on microcarriers hepatocytes tended to aggregate on Cytodex-3 obviously after being inoculated. Typical multi-cellular aggregated spheroids could be found in the two systems 24h-48h after hepatocytes were cultured. The morphological charact-eristics and synthetic functions were maintained for 5wk in FCS culture system and 8wk in PPVS culture system. In spheroidal aggregate culture about 80%-90% isolated hepatocytes became aggregated spheroids 24h after cultured in suspension and mean diameter of the spheroids was 100&mgr;m. The relationship among the hepatocytes resembled that in the liver in vivo. Synthetic functions of albumin and urea of the spheroids were twice those of hepatocytes cultured on monolayers.CONCLUSION:As high-yields and high-activity modes of culture on microcarriers or in spheroidal aggregate culture with portal vein serum are promising to provide biomaterials for bioartificial liver (BAL) efficiently.     

间接免疫酶染法检测日本血吸虫与湖北钉螺相同抗原的研究

用日本血吸虫成虫及湖北钉螺冰冻切片作抗原,采用间接免疫酶染法分别检测兔抗钉螺免疫血清和感染血清。结果表明日本血吸虫雌雄成虫、钉螺头足部、肝脏分别出现阳性反应。提示:日本血吸虫与其中间宿主湖北钉螺之间确实存在相同的抗原成分,     

间接免疫酶染法检测日本血吸虫与湖北钉螺相同...

Adult Schistosoma japonicum worms and Oncomelania hupensis hupensis tissue sections were employed as antigens in the studies of anti-O. h. hupensis rabbit serum and anti-S. japonicum adult worm rabbit serum by indirect immunoperoxidase assay. The result indicated that the most prominent peroxidase reaction was presented in the adult worm sections and the head-foot and liver sections of O. h. hupensis. These suggested the possible presence of antigenic homology between Schistosoma japonicum and Oncomelania hupenis hupensis. (Figs. 1-7).     

湖沼地区钉螺分布动态性的初步证据

目的研究湖沼地区钉螺分布的规律,为正确认识钉螺的生态学提供依据。方法从安徽省贵池区秋浦河沿岸随机抽取4块滩地作为研究现场,按《血吸虫病防治手册》推荐的查螺方法调查钉螺,并记录线框号。所有钉螺带回实验室用水测法判别死活,并记录活螺数。计算4块滩地的中位数、95%可信区间(95%CI)等描述性统计指标,并分别用负二项分布、对数正态分布、指数分布和Weibull分布拟合钉螺数据以分析钉螺的分布规律。结果4块滩地钉螺的分布均为正偏态分布,钉螺密度(只/0.1m2)的中位数分别为9.0、15.0、41.5和22.0,95%CI分别为(0,41)、(0,68)、(0,170)和(4,73),聚集性指数分别为1.12、1.25、1.37和2.31。谷潭湖滩既符合负二项分布,又近似指数分布,秋浦河外滩近似指数分布,菜籽湖滩可能近似指数分布,欧阳湖滩近似Weibull分布。结论湖沼地区钉螺的分布不是简单的负二项分布,可能是动态变化的过程。