运用内标校准法提高表面增强激光解吸电离飞行时间质谱检测中的重复性

表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)具有高灵敏度、高通量、高效率等优点,是近年来疾病蛋白组学研究的先进技术 [1],但该技术检测结果 的重复性较差.因此,建立SELDI-TOF-MS检测流程的标准化至关重要 [2].我们将色谱分析常用的内标法 [3-4]引入SELDI-TOF-MS技术,采用合成多肽分子作为内标物,建立内标校准法以校准SELDI-TOF-MS质谱图的横坐标和纵坐标,以提高该方法 检测蛋白质分子最和丰度的重复性.现报告如下.     

引起血流感染常见的革兰氏阴性杆菌蛋白指纹图谱的建立

目的建立引起血流感染的临床常见革兰氏阴性杆菌的蛋白指纹图谱,为血流感染快速诊断奠定基础。方法在血培养分析仪报阳后8小时内抽取报阳血培养基3 ml,经离心、红细胞裂解液溶解红细胞及无菌去离水洗涤后,留取细菌悬液,应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrome-try,SELDI-TOF-MS)和Au蛋白芯片检测细菌蛋白,采用Ciphergen Proteinchip软件自动采集数据。每个标本重复测定4次评价SELDI-TOF-MS检测细菌蛋白的重复性。结果在分子量5～20 kD范围内不同种细菌具有不同的蛋白指纹图谱;同种细菌具有相似的蛋白指纹图谱,主要蛋白峰分子量的变异系数<0.1%;同一株细菌蛋白指纹图谱具有很好的重复性,主要蛋白峰分子量的变异系数<0.05%。结论在分子量5～20 kD范围内不同种细菌具有特征性蛋白指纹图谱,为血流感染病原菌的快速鉴定提供了新思路。     

同位素稀释液相色谱串联质谱法测定血清总甘油

目的 建立同位素稀释液相色谱串联质谱测定血清总甘油的方法.方法 以[13C3]-甘油作内标,用氢氧化钾异丙醇溶液水解血清甘油酯为游离甘油,将游离甘油转化为苯甲酸酯,用同位素稀释液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)分离检测,用标准曲线法定量.结果 甘油/内标峰面积比与甘油浓度(0.565～4.517 mmol/L)线性相关系数大于0.999 9;测定不同浓度血清总甘油批内变异系数(CV)平均为0.52%(范围0.21%～2.62%),总CV平均为1.15%(范围0.62%～2.00%);分析国际和国家标准物质,测定值与认证值的偏倚小于1%(-0.20%～1.06%).结论 建立同位素稀释液相色谱串联质谱测定血清总甘油方法,方法特异、精密、准确,可望用作血清总甘油测定参考方法.     

改良比色法在全自动生化分析仪加样重复性与准确度校准中的应用

目的探讨采用改良传统比色法,实现全自动生化分析仪样本、试剂加注重复性和准确度的测量。方法在生化分析仪开放通道设置不同方法对标准物质BW 2025-1按照特定比例进行稀释并测定吸光度,计算所测吸光度的变异系数和误差,校准样本和试剂加注的重复性和准确度。结果测试项目吸光度变异系数均小于2%,表明加样重复性符合要求;测试项目误差均在±5%范围内,表明加样准确度符合要求。结论通过对传统比色法进行改良,可实现全自动生化分析仪试剂与样本加注重复性和准确度的校准,该方法简单,便于操作,受影响因素少,可行性强。     

SELDI-TOF-MS蛋白芯片技术在胃癌早期诊断中的应用

目的 建立胃癌早期患者的血清差异表达蛋白诊断模型,构建用于胃癌早期诊断的敏感和特异的新方法.方法 采用PBSⅡ/C 型蛋白质指纹图谱仪及金芯片检测45例早期胃癌患者及80例健康对照人群血清蛋白质图谱,用Biomarker Wizard 3.1 软件分析所得数据,筛选胃癌差异表达蛋白.通过人工神经网络数学模型(ANN)选择最佳差异表达组合建立并验证胃癌的诊断模型.内标物质加入血清样本,校准和消除操作条件波动对分析结果的影响,提高实验的准确度.最后,应用SPSS13.0软件绘制胃癌诊断模型的受试者工作特征曲线(ROC curve),评价诊断模型的准确度.结果 在质荷比为2 000～20 000范围内共检测到有显著差异的蛋白质峰(t检验,P<0.01)28个.经ANN反复训练筛选其中5个差异蛋白(质荷比分别为2 545.3±3.6,2 942.7±4.3,3 135.5±2.8,4 130.6±2.1,8 691.4±1.3)组成胃癌人工神经网络诊断模型,对胃癌的诊断灵敏度为95.0%,特异度97.5%,阳性预测值为95.0%,阴性预测值97.5%,诊断准确度为96.67%.绘制ROC曲线,曲线下面积为0.972,表明该诊断模型准确性较高.结论 该研究建立的诊断模型对胃癌的诊断准确度较高.SELDI-TOF-MS蛋白芯片技术在胃癌的早期诊断和血清肿瘤标志物的筛选方面具有一定价值,值得进一步深入研究.     

应用SELDI-TOF-MS技术诊断2型糖尿病肾病

目的比较2型糖尿病(T2DM)肾病和对照人群血清蛋白质指纹图谱的差异,建立T2DM肾病诊断模型,探讨此技术对该病诊断的价值。方法采用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术检测51例T2DM肾病患者和66例对照人群血清,获得蛋白质指纹图谱。结合人工神经网络软件建立诊断模型并进行验证。结果在相对分子量2 000~30 000范围内共检测到175个蛋白峰,其中有17个蛋白峰明显表达差异(P<0.01)。筛选其中质荷比(m/z)分别为5 420、5 782、6 472、6 666、10 277和11 770的6个蛋白峰作为标志蛋白建立人工神经网络诊断模型。利用该模型对T2DM肾病进行盲法预测,结果表明其对该病的诊断敏感性和特异性分别为81.0%和96.2%。结论利用SELDI-TOF-MS和生物信息学技术建立了敏感性和特异性均较高的T2DM肾病诊断模型,为该病诊断提供了新途径。     

串联质谱法快速检测干血滤纸片酰基肉碱含量

目的 建立一种串联质谱法对干血滤纸片中的酰基肉碱进行快速分析,以用于脂肪酸代谢障碍性疾病和有机酸血症诊断及治疗效果的监测.方法 取8种不同浓度的酰基肉碱的干血滤纸片(直径5 mm),用甲醇(含已知浓度的相应酰基肉碱同位素内标)对其进行萃取,不进行衍生化,萃取物过滤后直接进入ESI+-MS/MS上机分析测定;采用多反应监测模式(MRM),以标准品制作标准曲线,同位素内标法定量建立分析方法,进行回收试验、精密度试验、干扰试验及准确度试验.结果 各标准曲线相关系数r2>0.994.低浓度各种酰基肉碱回收率为85 %～103.5%,准确度在91.8%～110.0%;中浓度各种酰基肉碱回收率为85%～96%,准确度在87.6%～110.1%;高浓度酰基肉碱回收率为94%～100.1%,准确度在95.7%～110.1%.实测值与加入浓度之间的相关系数(r)为:0.997～1.000.各种酰基肉碱批内变异系数(CV)1%～10%和批间变异系数(CV)5%～13%.内标液保存1～21天的检测均值均在CDC提供的参考范围内,而批内CV%均＜10%.263例0～6岁健康儿童血滤纸片中酰基肉碱浓度因受年龄因素影响,按不同年龄组划分各种肉碱参考范围.结论 非衍生化串联质谱法分析干血滤纸片中的酰基肉碱含量,样本前处理简单,能够达到较高的精确度和准确度,无常规串联质谱中的衍生化、氮吹和复溶等步骤,大大节省了的标本处理时间,是一项简便、快捷、准确的检测方法,可以用于脂肪酸代谢障碍性疾病和有机酸血症诊断及治疗效果监测.     

利用SELDI-TOF-MS快速鉴定鲍曼不动杆菌的研究

目的利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术快速鉴定鲍曼不动杆菌。方法收集临床分离鉴定的鲍曼不动杆菌60株及对照菌160株,将其所有菌株分成训练组和验证组。运用SELDI-TOF-MS技术检测鲍曼不动杆菌和对照菌的蛋白表达,筛选鲍曼不动杆菌特征性蛋白。用Ciphergen Proteinchip软件自动采集数据,结果经BioMarker Wizard和Bio Marker Pattern分析建立分类树模型。利用该模型对20株鲍曼不动杆菌和51株非鲍曼不动杆菌进行盲法验证。结果在相对分子量3000～30000 Da范围内共检测到72个蛋白峰,其中具有统计学差异的蛋白峰有56个(P 0. 01)。Bio Marker Pattern软件判别分析,择优选出质荷比(M/Z)为1 6737. 8和5763. 61的蛋白质峰建立鲍曼不动杆菌分类树模型。盲法验证结果表明SELDI-TOF-MS对鲍曼不动杆菌诊断的灵敏性和特异性分别为85%(17/20)、100%(51/51)。结论利用SELDI-TOF-MS可快速鉴定鲍曼不动杆菌。     

利用SELDI技术检测大鼠肝纤维化组织的实验研究

目的初步建立表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF/MS)技术检测大鼠肝纤维化组织样本的方法。方法采用SELDI技术及弱阳离子交换表面蛋白芯片(CM10)对组织样本进行分析,从组织样本制备、组织裂解液选择、上样浓度控制、重复性验证等方面进行实验条件的优化,并对大鼠肝纤维化组和对照组肝组织各4例进行差异蛋白分析。结果液氮研磨法结合含两性电解液和蛋白酶抑制剂的裂解液处理样本,以及组织蛋白样本浓度为5μg/μl时,芯片检测得到的蛋白峰强度和蛋白数量最优;对两组样本重复检测3次,蛋白丰度的平均变异系数(CV值)分别为0.105和0.155;两组样本共检测到292个蛋白峰,其中差异表达蛋白54个,在肝纤维化组中表达上调16个,表达下调38个。结论初步建立了SELDI技术检测组织样本的方法,并初步筛选出大鼠肝纤维化差异表达蛋白。     

唾液蛋白指纹图谱在乳腺癌诊断中的应用

目的:检测乳腺癌患者唾液蛋白质,筛选特异的蛋白质标记物,构建用于乳腺癌早期诊断的唾液蛋白质指纹图谱模型。方法:应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术测定91例唾液标本(其中乳腺癌47例,健康人44例)的蛋白质质谱,建立乳腺癌诊断模型。结果:乳腺癌患者与健康对照样本检测到311个蛋白质峰,其中32个蛋白质峰在两组间差异有统计学意义。获得分子量为4849.31,5224.96,3439.02和3559.89Da4个蛋白质组成的模板,可将乳腺癌与正常人正确分组,47例乳腺癌有37例被准确诊断,34例健康人被准确排除,灵敏度78.7%(37/47);特异度为77.2%(34/44)。结论:表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术建立乳腺癌癌唾液蛋白质指纹图谱模型为早期筛查及诊断乳腺癌提供了一种特异性强、敏感性高的新方法,值得进一步研究和应用。