VEGFR-3胞外区基因真核表达载体的构建-与鉴定

目的构建VEGFR-3胞外区基因真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,并在体外进行表达和鉴定。方法采用 RT-PCR技术,扩增C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组质粒pcDNA3.1-VR-3。经限制性酶切鉴定和DNA 序列测定结果证实后,将重组质粒经脂质体法转染COS-7细胞, Western blotting检测其蛋白表达。结果克隆了C57BL/6小鼠胚胎VEGFR-3胞外区cDNA片段,并构建了真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,Western blot 证实目的基因可在COS-7细胞中表达。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1-VR-3,可在真核细胞内正确表达,这为进一步的动物实验奠定了基础。     

bcr-abl基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

 目的　构建慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的真核表达载体,并在哺乳动物细胞COS-7中高效表达。方法　提取慢性粒细胞白血病K562细胞的RNA,经RT-PCR技术扩增得到bcr-abl基因后,将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,并进行PCR和酶切鉴定。鉴定为阳性的克隆,再进一步进行测序分析。将构建成功的真核表达载体转入COS-7细胞中进行瞬时表达。结果　反转录PCR扩增后的产物,经琼脂糖凝胶电泳可以在约874 bp处看见一特异性的条带,序列分析证明扩增产物与Gene Bank中的bcr-abl基因序列相同。将pEGFP- bcr-abl真核表达载体转入COS-7细胞后,经RT-PCR、Western blotting检测证明表达产物正确。结论　成功构建了含有bcr-abl融合基因的真核表达质粒,从而为进一步研究其结构和功能,寻找CML诊疗的新方法奠定了基础。     

bcr-abl基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的真核表达载体,并在哺乳动物细胞COS-7中高效表达.方法 提取慢性粒细胞白血病K562细胞的RNA,经RT-PCR技术扩增得到bcr-abl基因后,将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,并进行PCR和酶切鉴定.鉴定为阳性的克隆,再进一步进行测序分析.将构建成功的真核表达载体转入COS-7细胞中进行瞬时表达.结果 反转录PCR扩增后的产物,经琼脂糖凝胶电泳可以在约874 bp处看见一特异性的条带,序列分析证明扩增产物与GeneBank中的bcr-abl基因序列相同.将pEGFP-bcr-abl真核表达载体转入COS-7细胞后,经RT-PCR、Western blotting检测证明表达产物正确.结论 成功构建了含有bcr-abl融合基因的真核表达质粒,从而为进一步研究其结构和功能,寻找CML诊疗的新方法奠定了基础.     

Mda-7/IL-24基因转染对肝癌细胞生长的影响

目的研究Mda-7/IL-24基因对肝癌细胞系Hep3B生长的影响。方法构建Mda-7/IL-24基因的真核表达载体pcDNA3.1/Mda-7/IL-24,用脂质体介导的基因转染法分别将真核重组体pcD-NA3.1/Mda-7/IL-24和pcDNA3.1空载体质粒导入人肝癌细胞系Hep3B细胞中,经G418筛选获得细胞克隆。通过聚合酶链式反应（PCR）、免疫组织化学等方法检测基因和蛋白的表达、细胞生长增殖情况。结果将pcDNA3.1载体和pcDNA3.1/Mda-7/IL-24重组体转染肝癌细胞系Hep3B中,RT-PCR结果显示pcDNA3.1/Mda-7/IL-24克隆中有680bp的扩增条带,而pcDNA3.1空载体转染的克隆未见的扩增条带,未转染的Hep3B细胞亦未见680bp的条带;转染Mda-7/IL-24的Hep3B细胞与空白质粒载体转染的Hep3B细胞和Hep3B细胞的生长速度相比,后两者生长速度较快。结论将外源性Mda-7/IL-24基因导入Hep3B细胞后,可以抑制细胞生长。     

S100A13 基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

 目的 构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,观察S100A13基因在COS-7细胞中的表达及定位。方法 采用克隆和亚克隆技术构建S100A13基因真核表达载体,脂质体介导转染COS-7细胞,RT-PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果 酶切和测序结果证实重组质粒含有S100A13编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于全胞浆。结论 成功构建了S100A13基因真核表达载体,该基因在COS-7细胞中成功表达,S100A13基因表达定位于全胞浆。     

分泌型核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建分泌型核心蛋白聚糖(decorin)真核表达载体,并在肝癌细胞HepG2中表达,为研究核心蛋白聚糖的抗肿瘤作用奠定基础。方法利用特异性引物,应用PCR技术扩增核心蛋白聚糖全长基因cDNA片段,与pcDNA3.1载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染HepG2,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和westernblot检测其表达。结果获得了约1080bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型核心蛋白聚糖cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中。RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和westernblot方法可见转染组细胞decorin蛋白表达明显增高。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染decorin的HepG2细胞株。     

NOEY2基因对人乳腺癌细胞体外生长的影响

目的：构建NOEY2基因真核表达载体。研究其对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231生长的影响。方法：RT-PCR获得目的基因编码区,经T/A策略克隆后,再亚克隆至pcDNA3,获得真核表达载体。用lipofectAMINE辅助转染MDA-MB-231细胞,经G418长期筛选而获得稳定转染细胞克隆。Western印迹检测NOEY2蛋白水平的表达。通过记录生长曲线和流式细胞分析术观察转染细胞的生长和细胞周期变化。结果：NOEY2真核表达载体pcDNA3/NOEY2-CR构建成功。被稳定转染该载体的MDA-MB-231细胞有明显NOEY2蛋白表达,而对照细胞无表达。NOEY2转染细胞的生长抑制率可达46.3%,在细胞周期改变上可见明显的S期分数和G2/M期分数下降,而G0/G1期比例上升。结论：NOEY2基因转染对体外培养的人乳腺癌细胞生长具有一定的抑制作用。支持其人微言轻一个抑癌基因的推测,本研究为进一步探索NOEY2作为治疗基因的价值创造了条件。     

pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒的构建及在MCF-7乳腺癌细胞中的转染

目的构建pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒, 并进行鉴定。为进一步研究Smad3在抑制乳腺癌生长机制中起到的作用提供实验基础。方法 利用RT-PCR方法从MCF-7乳腺癌细胞中获得cDNA, 应用PCR方法扩增、提取 Smad3的基因片段, 酶切后与pEGFP-C3真核表达载体连接, 构建pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒, 进行测序、酶切鉴定, 表明质粒构建成功。将构建的质粒瞬时转染至MCF-7乳腺癌细胞中, 通过荧光倒置显微镜观察、RT-PCR技术及Westen blot技术鉴定转染是否成功。结果 本实验成功构建了pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒。结论 pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒瞬时转染到MCF-7细胞中, 可使Smad3在基因与蛋白水平的表达显著上调。     

胃癌相关基因GCRG213在真核细胞的定位研究

目的：研究胃癌相关基因GCRG213在真核细胞的定位。方法：采用聚合酶链反应（PCR）技术,从pGEM—T质粒上选择性扩增出包含完整ORF在内的人胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,将目的片段两端分别引入限制性内切酶PstI和BamHI识别位点,克隆至真核表达载体pEGFP-N1。将测序正确的阳性重组子pEGFP—N1-GCRG213采用脂质体瞬时转染COS-7细胞,激光共聚焦技术检测GCRG213基因在真核细胞内的蛋白定位。结果：经测序证实,GCRG213正确克隆入真核表达载体pEGFP—N1,组成阳性重组子pEGFP—N1-GCRG213。测序正确的pEGFP-N1～GCRG213重组子经脂质体转染COS-7细胞,激光共聚焦显微镜观察GCRG213蛋白在胞核和胞质中均有表达。结论：GCRG213蛋白在胞核和胞质中均有表达。     

人抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建与鉴定

[目的]构建人抑癌基因FHIT真核细胞表达载体。[方法]采用PCR方法，从人胎脑组织的总cDNA中扩增出444bp的人FHIT cDNA片段，然后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）B中，用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒；用该表达质粒转染COS-7细胞，Western blot法检测FHIT蛋白的表达情况。[结果]人FHIT基因cDNA以正确方向插入到真核细胞表达载体DcDNA3．1／myc-His（-）B中；转染COS-7细胞后，可见转染细胞有Fhit蛋白的表达。[结论]本实验成功地构建了人抑癌基因FHIT的真核表达质粒pcDNA3．1／myc-His（-）B-FHIT，为研究FHIT基因在肿瘤的发生中的作用提供了有效的工具。     

构建稳定表达病毒相关RNA的真核细胞株及其对抗肿瘤免疫促凋亡分子的影响

目的:构建稳定表达病毒相关RNA（virus-associated RNA,VA RNA）的293F-VA细胞株,并探讨其对靶向HER2阳性肿瘤的免疫促凋亡分子表达水平的影响。方法:采用PCR方法,扩增含VA RNA的功能序列,克隆入PiggyBac转座系统质粒,将VA RNA编码序列转入293F细胞中,经过抗性筛选和流式细胞仪鉴定,得到293F-VA细胞株。将萤光素酶、红色荧光蛋白及免疫促凋亡分子编码质粒分别转入293F-VA细胞株或亲本293F细胞株,通过萤光素酶活力检测和Western Blot实验,比较两种细胞株对外源目的蛋白表达水平的影响。结果:成功构建了PiggyBac-VA质粒。共转染PiggyBac-VA质粒可以明显提高细胞内Fluc蛋白的表达水平（P<0.05）。VA RNA编码序列通过PiggyBac转座系统转入293F细胞中,获得293F-VA细胞株。与293F亲本细胞相比,293F-VA细胞株将萤火虫萤光素酶Fluc蛋白的表达水平提高363.9%（P<0.05）;对海肾萤光素酶Rluc蛋白及红色荧光蛋白mCherry的表达均表现出3倍左右的提高（P<0.05）。293F-VA细胞株不仅能够提高免疫促凋亡分子e23-Fc-Fdt-tBid在细胞内的表达水平,并且显著增加目的蛋白向细胞外分泌的水平,较293F亲本细胞提高4.2倍（P<0.05）。结论:建立了稳定表达VA RNA的细胞株293F-VA,该细胞株能够显著提高抗肿瘤免疫促凋亡分子的表达水平。     

Construction of eukaryotic expression vector with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene

Recombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor(rhGM-CSF)hasbeenwidelyusedinclinicsinceitwasclonedin1985.11]Itisnotonlyaneffectivehematopoiesisgrowthfactor,butalsoacytokinesthatcanstimulatethepowerfullyefficientandpersistentantitumoractivityinallbody.[']Inthisstudy,thehumanGM~CSFgenewasamplifiedbyRT-PCR,andthenreconstructedintoeukaryoticexpressionplasmidtomakeitefficientlyandpersistentlyexpressinmammaliancells.TheseresultsprovidedabasisforstudyofGM-CSFincancergenetherapy…     

脂质体介导pcDNA3.1-IDO转染hepG2细胞的初步研究

目的：建立脂质体介导pcDNA3.1-IDO转染人肝癌细胞株hepG2细胞的转染方法。方法：在大肠杆菌中扩增pcDNA3.1-IDO质粒,通过lipofectamineTM2000转染试剂将pcDNA3.1-IDO转入人肝癌细胞hepG2,同时设置空质粒转染组（pcDNA3.1-hepG2细胞）和空白对照组（hepG2细胞）。分别应用RT-PCR和Western blot方法检测吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）基因及IDO蛋白在hepG2细胞中的表达。结果：经RT-PCR和Western blot检测证实空质粒转染组和空白对照组hepG2细胞无IDO基因及蛋白的表达,而重组质粒组的hepG2细胞均表达IDO基因和蛋白。结论：通过脂质体介导成功地将pcDNA3.1-IDO转染入肝癌细胞株hepG2细胞。这为研究IDO基因奠定了基础。     

吲哚胺2,3-双加氧酶上调人肝癌细胞人类白细胞抗原-G的表达

目的:探讨人类吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）对肝癌细胞人类白细胞抗原-G（humanleucocyte antigen-G,HLA-G）表达的影响。方法:用脂质体lipofectamine^TM2000将pcDNA3.1-IDO重组质粒稳定转染入肝癌SMMC-7721细胞作为实验组（pcDNA3.1-IDO质粒转染组）,同时设置空载体对照组（pcDNA3.1转染组）和空白对照组（未转染组）,用RT-PCR和Western blot鉴定实验组和2个对照组细胞IDO mRNA和蛋白的表达,然后分别给予实验组细胞IDO的抑制剂(2.5 mmol/L 1-D-MD和底物（200μmol/L L-色氨酸）干预48 h,进一步用实时荧光定量PCR和Westernblot检测上述5组细胞中HLA-G mRNA和蛋白的表达水平。结果:RT-PCR和Western blot显示空载体对照组和空白对照组未见IDO表达,而实验组细胞高表达IDO。实时荧光定量PCR和Western blot结果显示,实验组HLA-G mRNA和蛋白表达水平较空载体对照组和空白对照组均明显上调（P均<0.05）,给予1-D-MT和L-色氨酸干预后此效应可逆转。结论:在肝癌SMMC-7721细胞,IDO可以上调HLA-G的表达,色氨酸降解途径参与了此调节过程。     

RASSF1A Suppresses Proliferation of Cervical Cancer Cells

Background: This study aimed to explore the effects of ras association domain family 1 A (RASSF1A) onproliferation and apoptosis of human cervical cancer cell line Hela cells. Materials and Methods: RASSF1Awas cloned into the pcDNA3.1(+) vector to generate pcDNA3.1(+)-RASSF1A plasmid for transfection into Helacells. Changes in the proliferation and apoptosis of cultured Hela cells were examined by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium chloride assay and flow cytometry. A protein array was used to analyzethe expression of apoptotic factors. Results: Plasmid pcDNA3.1(+)-RASSF1A was generated and transfectedinto Hela cells to stably express RASSF1A in Hela cells. RASSF1A transfection was effective in inhibiting theproliferation of Hela cells up to 52.4%, as compared to cells transfected with an empty plasmid. RASSF1Aexpression also successfully induced apoptosis in human cervical cells with an apoptosis rate of 20.5%. Moreimportantly, protein array results showed that RASSF1 A transfection induced overexpression of p21 and caspase8, while decreasing the expression of survivin in Hela cells. Conclusions: RASSF1A expression was effective insuppressing the proliferation and increasing apoptosis of Hela cells, and may be a potential therapy for cervicalcancer in clinic.     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2