恶性疟原虫单克隆抗体保护性机制的实验研究

用体外抑制试验、调理试验和细胞毒试验等方法,对抗恶性疟原虫红内期McAb之功能特性进行了研究。17株McAb中有7株对同步化培养的恶性疟原虫的体外增殖具有明显的抑制作用;抑制强度取决于剂量和作用时间。在McAb—IgG浓度为0.6mg/ml时,上述7株McAb的抑制活性均在94％以上。在6株McAb中,有4株能促进巨噬细胞吞噬疟原虫而发挥调理作用。在7株McAb中,有4株能加强腹腔细胞杀伤和杀死疟原虫而表现出细胞毒活性。结果提示,恶性疟原虫McAb似有“多功能”、“双功能”和”单功能”之分,用“多功能性McAb”纯化的疟疾抗原,在制备疟疾亚单位疫苗方面可能更有意义。     

三株抗恶性疟原虫抑制性单克隆抗体的鉴定

M26-32,是可与不同种人疟及不同种地区恶性疟原虫分离株的红内期发生广泛交叉反应的McAb,(NH_4)_2SO_4提纯的M26-32 100μg/ml可阻断裂殖子入侵红细胞42.8％,50μg/ml可抑制P.f.生长71.2％;可沉淀145、135、102及76kd的恶性疟原虫蛋白;F_6-D_3是抗裂殖子表面抗原的McAb,50μg/ml可阻断76.7％裂殖子入侵红细胞,同一浓度可抑制P.f.生长的44.6％,其抗原分子为185kd蛋白;F_6-C_2是针对裂殖子一端某一结构的MeAb,200μg/ml时,可阻断52.9％裂殖子入侵红细胞,可免疫沉淀82及41kd的蛋白。     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的制备抗恶性疟原虫EBA—175的单克隆抗体（McAb），为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法以恶性疟原虫EBA-175（Ⅱ区F2段）重组抗原免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株．测定其免疫球蛋白亚类及其效价，ELISA、Western blot试验分析其特异性。结果筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4Al、4C3、4H9，6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1，1株为IgG2a，6株McAb的培养上清ELISA效价为1：256～1：512，腹水效价为1：12800-1：25600，间接ELISA显示其中4株McAb 1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合，而只有1F3、4A1、4H9在Western blot试验中识别恶性疟原虫Mr约35000的虫源蛋白。结论获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的 制备抗恶性疟原虫EBA-175的单克隆抗体(McAb),为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法 以恶性疟原虫EBA-175(II区F2段)重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。结果 筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4A1、4C3、4H9,6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1,1株为IgG2a,6株McAb的培养上清ELISA效价为1:256~1:512,腹水效价为1:12800~1:25600,间接ELISA显示其中4株McAb1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合,而只有1F3、4A1、4H9在Westernblot试验中识别恶性疟原虫M_r约35000的虫源蛋白。结论 获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDHp）单克隆抗体（McAb）,并对其特异性进行鉴定,用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westen blotting试验分析其特导性。结果,制备出2A5和 1H10两株能稳定分泌抗LDHp　McAb的杂交瘤细胞株,两株单抗均为IgG2b,2A5和1H10培养上清的ELISA效价分别为1:512和1:256,腹水效价分别为1:25600和1:12800,两株单抗与间日疟、红细胞、弓形虫、日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应,能识别恶性疟原虫的33Kda虫源蛋白。证明制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立

OBJECTIVE: To prepare a monoclonal antibodies (mAbs) against glutamate dehydrogenase (GDH) of Plasmodium falciparum (FCC1/HN strain) and establish colloidal gold-immunochromatographic assay (GICA) for diagnosis of Plasmodium falciparum malaria. METHODS: Recombinant GDH was used to immunize Balb/C mice and the mAbs against GDH were prepared using hybridoma technique followed by identification of IgG isotype and its affinity. Protein-G affinity chromatography was employed to purify the antibodies, which were labeled with colloidal gold for establishment of GICA for Plasmodium falciparum detection. RESULTS: Six mAbs were obtained and identified as IgG1(kappa) of IgG isotypes with affinity constants (Kaff) ranging from 1 x 10(-8) to 2.8 x 10(-10). GICA had a sensitivity of 86.66%; and specificity of 96.43%; for Plasmodium falciparum detection compared with routine microscopic examination. CONCLUSION: The established GICA is rapid and accurate for Plasmodium falciparum detection with such potential utility as for instant diagnosis of Plasmodium falciparum malaria.     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶活性的初步检测

以３－乙酰吡啶（ＡＰＡＤ）作为辅酶而设计的数量酶比色法检测恶性疟原虫乳胶脱氢酶活性。结果显示：ＰＬＤＨ的ＯＤ值随恶性疟原虫率的提高而明显升高,特别是当原虫率达１％以上时,ＰＬＤＨ的ＯＤ值更显著,但在低原虫率（０．４％以下）时,阳性血样与阴性血样ＯＤ值有时错位或不能区别。同时显示,同样的原虫率血样裂殖体（Ｓ）和大滋养体（Ｔ）期比环状体（Ｒ）期ＰＬＤＨ的ＯＤ值明显升高。     

抗人中性粒细胞单克隆抗体的筛选、鉴定和抑制调理吞噬活性的检测

用淋巴细胞分离液梯度离心法,自健康人血液中分离出中性粒细胞,作为颗粒抗原,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得分泌抗细胞膜单克隆抗体(单抗)杂交瘤细胞。用调理吞噬抑制试验,初步筛选出1株分泌抑制补体介导的吞噬功能的单抗杂交瘤细胞。单抗亚类检定结果为IgG_(2a)。     

四个青蒿素生物转化产物抗体外培养恶性疟原虫活性研究

目的：检测四个青蒿素微生物转化产物10β-羟基青蒿素^[1]、去氧基蒿素^[2]、9β-羟基青蒿素^[3]及3β-羟基青蒿素^[4]，对体外培养恶性疟原虫的作用。方法：以青蒿素和氯喹为对照，用体外微量法测定。结果：四个转化产物的抗疟活性比青蒿素均有不同程度的降低，其中10β-羟基青蒿素活性较好。结论：30位、9位、10位的羟基化引起的结构改变均使青蒿素体外抗疟原虫活性有一定的减弱，过氧桥的断裂同样使活性降低。     

抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立

目的 制备抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)的单克隆抗体(McAb),将其标记胶体金,建立一种诊断恶性疟的胶体金免疫层析方法。方法 用基因重组的GDH蛋白免疫Balb/C小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备McAb,测定其免疫球蛋白亚类及其亲和力。用protein-G亲和层析纯化抗体并用胶体金标记,建立胶体金免疫层析方法,选择最佳反应模式对疟疾血样进行检测。结果 筛选出6株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单抗亚类均为IgG₁,亲和常数(κ)介于1×10^-8~2.82×10^-10。以镜检法为参照,建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟的敏感性为86.66%,特异性为96.43%。结论 建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟快速、简便、可靠,有望开发成为恶性疟快速诊断试剂盒。     

用乳酸脱氢酶为靶分子的免疫层析技术检测恶性疟原虫

目的建立一种免疫胶体金层析(GICA)法用于恶性疟原虫的检测。方法采用杂交瘤技术制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)单抗，利用筛选出来的单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条，以镜检和PCR法为对照，用GICA条检测门诊“四热”病人血样，评价其敏感性和特异性，并对其稳定性进行了初步研究。结果筛选出4株抗LDHpf单抗．间接ELISA表明4株单抗仅与恶性疟原虫发生反应，而与间日疟原虫、红细胞蛋白、刚地弓形虫和日本血吸虫不发生交叉反应。Western—blot结果显示4株单抗能识别恶性疟原虫相对分子质量约为33000处的虫源蛋白。以镜检法和PCR法为标准，CICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88.37％和86．67％．DICA与镜检法的符合率均为91．55％。结论GICA检测恶性疟原虫简易快速、灵敏度高，无需特殊仪器设备，有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒。     

HRPII双抗夹心ELISA检测恶性疟原虫体外敏感性研究

目的验证富组蛋白2双抗夹心酶联免疫吸附法（Histidine—Rich Protein 2 Double—Site Sandwich Enzyme—Linked Immunosorbent Assay,HRPII—ELISA）在恶性疟原虫体外敏感性检测中的适用性。方法运用HRPII-ELISA测定氯喹、咯萘啶、青蒿琥酯、蒿甲醚及双氢青蒿素等五种抗疟药物对体外培养的恶性疟原虫氯喹敏感株与氯喹抗性株的体外敏感性,并对所测得的量效曲线（dose-response curves）及50％有效抑制浓度（IC50）与WHO推荐的Rieklnann体外微量法比较。结果HRPH—ELISA法测定的五种药物对恶性疟原虫氯喹敏感株的IC50值依次为4．7nmol/L、2．90nmol／L、3．38nmol／L、4．64nmol／L、2．72nmol／L,对恶性疟原虫氯喹抗性株的IC50值依次为110．4nmol／L、3．85nmol／L、4．39nmol／L、3．90nmol／L、3．27nmol／L;同时,将上述结果与体外微量法所得的结果进行相关性分析,R2=0．96,P〈0．001,两种方法结果基本一致。结论HRPII—ELISA法可用于恶性疟原虫对抗疟药物的体外敏感性检测。     

海南省东方市恶性疟原虫对氯喹敏感性的体外检测

目的：检测海南省东方市东方地区恶性疟原虫对氯喹的敏感性。方法：采用WHO标准的体外微量法。结果：1986--1987年和1999--2001年，分别检测恶性疟患102例和101例，抗性率为63．73％和71．29％。IC50分别为1．08和1．10pmol/μl血，平均完全抑制裂殖体形成的药物浓度为6．19和5．57pmol/μl血。结论：当地恶性疟原虫对氯喹抗性仍然比较严重。     

竞争ELISA法分析恶性疟原虫单克隆抗体的识别表位

目的分析6株恶性疟原虫PfCP-2.9融合抗原的单克隆抗体识别相同或相关表位情况。方法以PfCP-2.9重组蛋白为抗原进行ELISA板包被,用辣根过氧化物酶分别标记6株PfCP-2.9单克隆抗体,并以此作为竞争检测抗体,与这6株未标记的单抗进行相互之间的竞争检测。结果根据竞争ELISA结果可将6株单抗分为2组,2组单抗之间无竞争,而在各组内的单克隆抗体发生相互之间的竞争。结论存在相互竞争的单抗可能识别同一表位或相关表位,研究结果为表明这些单抗识别特性提供信息。     

恶性疟原虫体外培养的同步化方法

本文就恶性疟原虫体外培养的同步化方法加以综述,主要对恶性疟原虫的同步化方法,如传统的浓度分离法、渗透压分离法、Percoll梯度法、温度周期法、阿非迪霉素法,及近几年发展起来的磁性分离法及流式细胞分析仪法进行了介绍.     

恶性疟原虫4个分离株的体外培养

为了筛选在体外培养中能形成成熟配子体的虫株,以建立恶性疟原虫蚊期和红外期实验模型,我们于1990年在云南南部疟疾流行区从4个病人分离出4个恶性疟原虫分离株,暂定名为B-1(Burma-1),FCC-901/YN,FCC-902/YN,FCC-903/YN,并进行了体外培养观察。     

恶性疟原虫红内期的体外培养及其影响因素

液氮内保存的FCC—1株恶性疟原虫红内期用蜡烛缸—平皿法体外连续培养40天。疟原虫复苏后培养的第3天原虫密度开始上升.第11天达到最高峰,其中一皿的红细胞含虫率高达20.56%。影响恶性疟原虫体外培养的有关因素如RPMI—1640培养液,血清和红细胞,本文进行了讨论。     

恶性疟原虫抗药性测定方法及其影响因素

本文就疟原虫抗药性测定方法近几年的研究进展及其在测定中的影响因素加以综述。对抗药性测定方法,如传统的微量测试法和同位素测定法,以及近几年发展起来的利用HRP Ⅱ和LDH酶联免疫法、利用SYBR Green I等标记的荧光法和流式细胞仪法进行了介绍。文内还分析了血清、红细胞压积和原虫起始密度、原虫时期和状态等因素对测定值的影响。