DMD基因内含子的重复序列与内含子不稳定性和基因缺失的关联

【目的】为了研究DMD基因内含子的重复序列与内含子不稳定性和基因缺失的关联，我们分析了缺失型DMD病人的连接片段的断裂点并研究了DMD基因内含子结构与内含子不稳定性之间是否存在相关。【方法】多重引物PCR法鉴定缺失型DMD患者，分别克隆46和51号外显子缺失后形成的连接片段，测定连接片段的序列；并用计算机分析DMD基因可以获得的全部内含子的结构特点。【结果】对46号和51号外显子缺失后形成的连接片段的序列分析表明，5’和3’端的断裂点均位于重复顺序，断裂点附近无小插入、小缺失或点突变。对连接片段的二级结构分析表明，所有的断裂点均位于单链发夹结构的非匹配区。对DMD基因可以获得的全部内含子的结构分析表明，在DMD基因全长内含子中重复序列占大约34．8％。大量重复序列的存在是许多内含子的重要结构特征。【结论】重复序列是DMD基因多数内含子的关键结构，与内含子的不稳定性相关。在原有DNA序列的基础上，单链发夹结构的形成增加了DMD基因的不稳定性，形成了基因断裂的基础，单链发夹结构的形成导致两个断裂点的靠近，最终导致了基因缺失。     

Dystrophin基因3～5号外显子缺失连接片段的克隆和测序

目的 通过对抗肌萎缩蛋白（dystrophin）因3～5号外显子缺失后连接片段的克隆和测序分析,探讨dystrophin基因缺失的发生机制。方法 先以外显子PCR反应检测证实1例杜氏肌营养不良症患者3～5号外显子缺失,然后在2、5号内含子上用PCR步移方法寻找断裂位点,最后用靠近断裂位点处设计的引物,以PCR法直接扩增dystrophin基因的缺失连接片段并测序,测序结果和正常内含子序列作对比分析。结果 获得2113bp PCR产物,本例基因缺失片段长约49000bp。5’端断裂点位于2号内含子短散在元件Alu序列内,3’端断裂点在单一序列,附近有TTTAAA序列。断裂点附近有较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点。连接片段插入了26bp序列并在断裂点周围形成3个13bp的短序列重复（GGCTTATATTTAA）连接断裂点两端。结论 推测重复序列、断裂点附近较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点关联易引起基因的断裂重组,加上非同源末端连接修复机制等综合因素可能是导致基因缺失的重要原因。     

人类Vimentin基因第1,2,6,7内含子序列的测定

[目的]人vimentin(VIM)基因位于10号染色体短臂1区3带,属于第Ⅲ型中间丝纤维蛋白基因.目前已知全部外显子序列及部分内含子序列,本文测定了部分未知的VIM基因内含子序列.[方法]通过已知VIM基因的外显子序列设计引物,用PCR扩增其未知的内含子片段,将PCR产物进行克隆测序.[结果]共测得未知的4个内含子序列,内含子1长692bp,测得其全部序列;内含子2长2kb,测得其两端与外显子相接的序列,共1kb;内含子6长456bp,测得其全部序列;内含子7长404 bp,测得其全部序列.[结论]本研究PCR检测多例人VIM基因的内含子7大小为404 bp,与文献报道人类vi-mentin基因的内含子7大小为800bp相差很大,但引物两端外显子序列相同.另外,文献报道的人类vimentin基因与外显子3相邻的第2内含子末端41nt的核苷酸序列与本研究所测的第2内含子末端序列完全不同.     

抗肌萎缩蛋白基因内含子不稳定性研究

报道中山大学附属第一医院神经科盛文利的研究表明,抗肌萎缩蛋白基因内含子结构与内含子不稳定性相关。该研究对缺失型DMD患者的连接片段     

Xp21邻近基因缺失综合征1例及其基因缺失分析

目的:探讨Xp21邻近基因缺失综合征基因缺失范围.方法:应用聚合酶链反应对1例Xp21邻近基因缺失综合征患者进行基因缺失分析.结果:该患者Xp21区域的缺失范围包括从DMD基因的部分3'端序列到AHC基因的几乎全部序列,其中位于DMD和AHC之间的GKD基因和微卫星DNA标记DXS992未发现缺失,缺失的5'端断裂点位于DMD基因外显子61和外显子62之间,3'端断裂点位于AHC基因的远端.结论:尽管常规染色体检查正常,对先天性肾上腺皮质功能低下的患者,应进一步考虑是否患有Xp21邻近基因缺失综合征,分子遗传学分析有助于确定基因缺失的范围.     

Duchenne型肌营养不良症患者32例基因缺失分析及产前诊断

目的:探讨Duchenne型肌营养不良症(DMD)基因缺失突变的类型,建立基因诊断技术平台.方法:应用寡核苷酸引物扩增DMD基因18个外显子区域,对27例家系32例DMD患者进行基因缺失分析,用4对二核苷酸重复序列多态引物对DMD家系进行扩增片段长度多态性连锁分析.并对10例先证者有DMD基因缺失的家系进行产前诊断.结果:27例DMD家系中19例(70.4%)有至少1个外显子缺失,且缺失热点区域集中在外显子12、13、45、47、48、49和50,所有携带者至少有1个或1个以上多态性位点为杂合态,缺失诊断结合多态分析进行诊断,10例男性胎儿中2例具有外显子缺失.结论:基因缺失诊断结合连锁分析可快速、准确地进行DMD的产前诊断.     

假性肥大型肌营养不良症第50和51号内含子的结构特点及51号外…

探讨假性肥大型肌营养不良症基因第５０和５１号内含子的结构特点与第５１号外显子缺失的关系。用分子克隆技术，按Ｓａｎｇｅｒ法双链测序，克隆了含ＤＭＤ基因第５０和５１号内含子的人基因组ＤＮＡ３．１ｋｂ－ＨｉｎｇⅢ片段，测出了该片段的全部顺序，并用计算机分析了序列特点。     

人类Vimentin基因第1，2，6，7内含子序列的测定

目的 人vimentin(VIM）基因位于10号染色本短臂1区3带,属于第Ⅲ型中间丝纤维蛋白基因。目前已知全部外显子序列及部分内含子序列。本测定了部分未知的VIM基因内含子序列。方法 通过已知VIM基因的外显子序列设计引物,用PCR扩增其未知的内含子片段,将PCR产物进行克隆测序。结果 共测得未知的4个内含子序列,内含子1长692bp,测得其全部序列;内含子2长2kb,测得其两端与外显子相接的序列,共1kb;内含子6长456bp,测得其全部旬;内含子7长404bp,测得其全部序列。结论 本研究PCR检测多例人VIM基因的内含子7大小为404bp,与献报道人类vimentin基因的内含子7大小为800bp相差很大,但引物两端外显子序列相同,另外,献报道的人类vimentin基因与外显子3相邻的第2内含子末端41nt的核苷酸序列与本研究所测的第2内含子末端序列完全不同。     

应用10对引物多重PCR方法检测DMD基因缺失

目的 建立适合于Duchenne型进行性肌营养不良(DMD)临床基因诊断的10对引物多重PCR方法,并探讨其临床应用价值.方法 抽提55例DMD患者及正常对照者外周血DNA,选取肌营养不良蛋白基因的10对外显子引物,应用多重PCR反应方法,同时扩增10个特异性片段,扩增产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳.结果 55例DMD患者中,28例(50.9%)存在外显子缺失.27例(49.1%)未检测到缺失;25例缺失片段集中于第45～53外显子,3例缺失片段集中于第12-19外显子.第50外显子缺失频率最高;其次为外显子45、47、51、52,再次之为外显子12、53.结论 DMD基因缺失片段主要分布于第45-53、12-19外显子2个缺失热点区域.该方法具有临床应用价值,是检测DMD基因缺失的首选方法.     

产前基因检测杜氏肌营养不良

目的 产前基因检测杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)家系胎儿.方法 利用性别决定基因SRY引物PCR和羊水细胞培养染色体核型分析确定3例DMD家系胎儿性别,采用mPCR技术对3个DMD家系成员外周血及胎儿羊水和脐静脉血进行DMD基因内18个外显子位点扩增,STR-PCR结合聚丙稀酰胺凝胶技术对DMD基因3'端及基因内的44、45、49、50内含子的(CA)n短串联重复序列引物进行扩增,进行家系连锁分析和产前基因诊断.结果 共检出4例胎儿,其中2例单胎和1例双胎之甲胎为男性,之乙胎为女性.3个DMD家系2个检出为非缺失型,1个为缺失型.4例胎儿均继承了与同代先证者相同的母源致病单体型,除1例双胎之女胎为风险基因携带者外,其余3例男胎均为DMD风险胎儿,3例患儿母亲均为杂合型.结论 STR多态连锁分析不仅适用于常见缺失突变检测未发现缺失的DMD患者,同样适用于缺失型DMD患者的产前基因检测.     

基因工程与医学

目的：探讨基因工程研究与医学的关系。方法：对与医学有关的基因工程研究报告和最新成果,加以分析。结果：基因药物,基因诊断和治疗已在临床上取得一定应用。结论：基因工程研究促进医学的发展。     

含有CD基因的腺病毒载体的构建

目的 :构建携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体。方法 :先将真核表达载体质粒 pCI中的转录框架构建入腺病毒载体中 ,后再将CD和LacZ基因分别装配到框架的多克隆位点内。结果 :经过酶切鉴定成功地构建了分别携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体 ,对肿瘤的前药转换基因治疗有重要意义。     

鼻咽癌的演变与某些相关癌基因及抑癌基因

目的：探讨癌基因(C—erbB2，C—myc，EBV，CDK4)和抑癌基因(E—CD，p16，p53)在鼻咽癌演变中的相互关系。方法：复习近期国内外有关癌基因和抑癌基因在鼻咽癌中的关系，作一综述。结果：癌基因和抑癌基因在鼻咽中相互制约。结论：抑癌基因的低表达和癌基因的过表达在鼻咽癌中起重要作用。     

结直肠癌MICA基因的表达与p53K-ras基因突变的关系研究

目的:分析结直肠癌MICA基因的表达与p53、K-ras基因突变的关系.方法:回顾性分析我院2014年3月至2016年3月收治的66例结直肠癌患者的临床资料,应用半定量PCR-SSCP技术,对癌组织mdr1基因表达量与p53、K-ras进行检测,并分析结直肠癌MICA基因表达与p53、K-ras基因突变间的相互关系.结果:经研究发现,MICA表达与结直肠癌患者肿瘤部位、年龄、性别无相关性(P>0.05).于66例患者中,22例淋巴结转移者的MICA平均表达量明显高于淋巴结未转移者,差异具有统计学意义(P<0.05).8例K-ras、p53基因联合突变者MICA基因平均表达量高于非联合突变者,差异具有显著统计学意义(P<0.05),12例K-ras基因突变者MICA平均表达量稍高于未突变者,但比较差异无统计学意义(P>0.05),16例p53基因突变者MICA平均表达量显著优于p53基因未突变者,差异具有统计学意义(P<0.05).结论:MICA基因高表达已成为了结直肠癌的关键检测指标,而p53、K-ras基因与其高表达具有相关性.     

重组人Grn的克隆与表达

目的 :构建人Grn基因原核表达载体并观察其表达。方法 :从人单核细胞系THP-1细胞c DNA中扩增出Grn片段,通过酶切与连接,将Grn片段构建到p GEX-4T-2质粒载体上,再转化入感受态细胞TOP10,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析,测序正确的重组质粒再转化入感受态细胞DE3中表达蛋白,用Western blot鉴定结果。结果 :构建的p GEX-4T-2表达载体作PCR和双酶切鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与Grn序列设计完全一致,将其转化入DE3中,Western blot结果表明在细菌裂解上清有分子质量为91KD的融合蛋白。结论 :重组人Grn的克隆与表达成功,为进一步研究Grn的功能奠定了基础。     

ras基因P~(53)基因与胰腺癌研究近况

癌基因ras、抑癌基因P53在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。本文就其在胰腺癌中的研究和应用作一综述 ,以便寻求胰腺癌诊断、估计预后的新手段     

DMD基因缺失及其在基因诊断中的应用

应用DMD基因位点cDMD8探针和BglⅡ核酸内切酶对1例正常中国人及8例无亲缘关系的DMD患者的基因组DNA进行了分析。结果显示,正常中国人的杂交带型为11.0kb、7.4kb、3.5kb、2.6kb及1.0kb 5条杂交带,其中3.5kb为双杂交片段。8例病例中有4例可检测到基因缺失,缺失率为50％。缺失的部位、大小不同,呈现遗传异质性。本文讨论了cDNA探针在DMD基因诊断、携带者检出及产前基因诊断中的应用。     

HLA基因与硬皮病相关性的研究进展

硬皮病的病因及发病机制尚未明确。关于其病因及发病机制有以下学说:遗传学说、自身免疫紊乱学说、细胞外间质代谢异常学说、血管病变学说、细胞因子异常学说。其中人类白细胞抗原基因与硬皮病的相关性是目前研究热点之一。HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ、HLA-Ⅲ类基因与硬皮病均有相关性。其中HLA-Ⅱ类基因中的HLA-DR、HLA-DQ与硬皮病的相关性最密切。     

基因治疗及其伦理问题

基因治疗是21世纪人类治疗疾病的重要手段，但其目前仍然面临着众多困扰。本文对基因治疗的有效性和安全性进行了考察，并在此基础上，提出了基因治疗的伦理原则。     

肿瘤抑制基因p53及Rb在鼻咽癌中的表达

为观察ｐ５３基因和Ｒｂ基因与鼻咽癌发生的关系，应用聚合酶链反应－单链构型多态分析技术（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术），检测３３例鼻咽癌组织、４例鼻咽部炎性组织及３例正常鼻咽部组织中ｐ５３基因第７，８外显子的突变。结果显示，在３３例鼻咽癌中有７例存在ｐ５３基因第８外显子的突变，突变率为２１．２％。在第７外显子中未检测出突变发生。应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，对Ｒｂ基因在鼻咽癌中存在状态进行研究。结果表明，在１３例鼻咽癌组织中有１１例鼻咽癌组织有Ｒｂ基因的缺失或明显减弱，提示ｐ５３基因突变及Ｒｂ基因的缺失而导致的基因失活与鼻咽癌的发生有密切关系。