抗口蹄疫蛋白疫苗与DNA疫苗混合物的免疫原性研究

目的 研究抗口蹄疫蛋白及DNA疫苗混合物免疫原性。方法 以O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1免疫活性肽基因串连片段取代猪IgG H链基因可变区的CDR3区构成融合基因。然后分别与原核表达载体pET28b及真核表达载体pCDM－8构建抗口蹄疫蛋白疫苗pET28b-FH及DNA疫苗PCDM－FH。用蛋白疫苗pET28b-FH和DNA疫苗pCDM-FH及其混合物免疫猪后,用攻毒实验检测其效果。结果 攻毒后,抗口蹄疫蛋白疫苗pET28b-FH及DNA疫苗pCDM-FH单猪免疫能分别使猪发病推迟10天和1天,症状减轻;而混合疫苗免疫效果比阴性对照好而不及这两个疫苗单独免疫效果。结论 抗口蹄疫蛋白疫苗pET28b-FH及DNA疫苗pCDM-FH单独免疫能使猪发病推迟,症状减轻,而混合疫苗免疫效果较差,免疫方法仍需改进。     

DNA疫苗在变应性疾病方面的研究进展

DBA疫苗是近10年来疫苗研究的热点并显示了很好的前景,其在变应性疾病方向的应用研究包括疾病的发生机制、黏膜免疫、DNA疫苗的免疫机制、结构、载体、佐剂、免疫途径和免疫方法等方面。     

日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用增强免疫保护作用的研究

目的 探讨日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用以增强免疫保护作用的效果。方法分别大量制备质粒DNA：pcDNA3．1-SjC23、pcDNA3．1-SjCTPI、pcDNA3．1-（CDR3）6和重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30。pcDNA3．1-SjC23、pcDNA3．1-SjCTPI、pcDNA3．1-（CDR3）6等量混合后即为鸡尾酒式的混合DNA疫苗，重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30等量混合后即为鸡尾酒式的混合蛋白疫苗。70只BALB／c小鼠随机分为A、B、C、D、E5组，每组14只。A组为自然感染组；B组（空质粒对照组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3．1；C组（空质粒＋混合蛋白对照组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3．1，第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗＋100μl福氏完全佐剂（FCA）；D组（混合DNA组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗；E组（混合DNA＋混合蛋白组）每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗，第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗＋100μlFCA。DNA免疫组末次免疫后4周，蛋白加强组末次免疫后2周，所有小鼠同时经腹部皮肤感染（40±1）条尾蚴。攻击感染后42d剖杀小鼠，计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前2d及感染前2d分别经尾静脉采血，分离血清检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1及IgG2a，并取小鼠脾脏制备单个脾细胞，检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。结果C、D组和E组的减虫率分别为17．70％、32．88％和45．35％，D组和E组的减虫率均显著高于C组（P均〈0．01），且E组的减虫率显著高于D组（P〈0．01）；C、D组和E组的减卵率分别为9．39％、36．20％和48．54％，D组和E组的减卵率均显著高于C组（P均〈0．01），且E组的减虫率也显著高于D组（P〈0．05）。C、D、E3组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体，?     

静脉途径时脂质体和糖化多聚赖氨酸对基因表达肝脏靶向定位效果的比较

目的 比较脂质体和糖化多聚赖氨酸对目的基因肝脏靶向定位效果的影响。方法 将真核细胞表达质粒分别与脂质体和糖化多聚赖氨酸偶联,经尾静脉导入大鼠体内,运用原位杂交和免疫组化和方法观察目的基因在肝脏和其他脏器分布表达。结果 经脂质体或糖化多聚赖氨酸包埋的质粒ＤＮＡ导入体内２４小时后均见明显表达,一周后逐渐下降,三周时仍有表达;均以肝脏为主要分布器官,但用糖化多聚赖氨酸包埋的质粒在肝脏中的分布表达高于使用     

SARS冠状病毒S蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果研究

目的构建SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的两个片段S1和S2的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,检测它们在哺乳动物细胞中的表达,并观察它们在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒棘突糖蛋白的两个片段S1和S2的基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-S1和pVAC-S2重组质粒。并通过Lipofectamine 2000将它们转染到HEK293细胞,RT-PCR和Western-blot鉴定重组质粒在真核细胞中的转录和表达。以构建的重组质粒直接免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及抗体亚类,流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布。结果成功构建了重组真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,并可在HEK293细胞中获得表达。免疫小鼠三次后,抗体滴度达到了1∶3 200。pVAC-S1诱导了高滴度的IgG2a,IgG2b和IgG1,pVAC-S2刺激产生高滴度IgG2a,IgG2b和较高滴度的IgG3。脾脏T淋巴细胞亚群分析示pVAC-S1和pVAC-S2两免疫组小鼠CD3+和CD8+T细胞明显升高。结论构建的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2能在哺乳动物细胞中表达,免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答。     

多聚赖氨酸包被球囊导管转移基因表达的时相特征

目的评估多聚赖氨酸包被球囊导管－重组腺病毒／ＬａｃＺ（Ａｄ５／ＬａｃＺ）局部基因转移系统的基因转移效率与表达时间。方法利用该系统，在体将Ａｄ５／ＬａｃＺ导入兔腹主动脉下段。然后于转基因后不同的时间点对转基因表达进行了定性（Ｘ－Ｇａｌ染色）及定量（β－Ｇａｌ活性）测定。结果基因转移后７天的表达最高。３天与１４天的次之，２１天时表达显著下降。２８天时几乎测不到转基因的表达。结论该基因转移系统能有效地实现直接、在体的基因转移。腺病毒介导的基因表达时间是短暂的。其表达峰值约在７天左右。     

甲胎蛋白与热休克蛋白70融合DNA疫苗抗肿瘤免疫

目的通过小鼠甲胎蛋白(AFP)与结核分枝杆菌热休克蛋白70(HSP70)基因融合制备DNA疫苗,研究该种DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答及其对荷瘤小鼠的治疗作用。方法应用分子克隆技术构建AFP与HSP70的融合表达载体,免疫实验共分5组:磷酸盐缓冲液组、pcDNA3．1组、pcDNA3.1-AFP组、pcDNA3．1-HSP70组、pcDNA3．1- AFP-HSP70组(融合疫苗组),每组7只小鼠。2次免疫后分离小鼠脾细胞,体外诱导细胞毒性T淋巴细胞做杀伤实验, 以乳酸脱氢酶法检测杀伤率,以酶联免疫吸附法检测脾细胞释放的干扰素γ;体外培养小鼠肝癌细胞系Hepa1-6,以每200 μl 4×106细胞数在C57BL／6J小鼠右前腋皮下注射作荷瘤鼠模型,以融合疫苗免疫荷瘤鼠,观测肿瘤大小评价融合疫苗的治疗作用。结果AFP与HSP70的融合疫苗能诱导AFP特异性细胞毒性T淋巴细胞反应,HSP70对于该反应有增强作用(P<0．05),杀伤率在效:靶比为50:1时为32％左右;免疫后小鼠脾细胞体外刺激后分泌干扰素γ约200 pg／ml,融合疫苗组分泌高于其他组(P<0．05),融合疫苗组肿瘤小于其他组(P<0．05),生存时间长于其他组(P<0．05)。结论 AFP与HSP70的融合疫苗能激发AFP特异性细胞毒性T淋巴细胞．并且对肝癌移植瘤有治疗作用。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-2DNA疫苗诱导小鼠T淋巴细胞的增殖

目的　为了探讨恶性疟原虫FCC - 1/HN株裂殖子表面蛋白 - 2 (MSP - 2 )DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法　将重组真核表达质粒pBK/MSP - 2经骨骼肌注射BALB/c小鼠 ,小鼠经DNA疫苗免疫 8w后 ,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化 ,并体外培养脾脏细胞 ,用夹心ELISA法测定IFN -γ和IL - 2的产生。结果　与对照组相比 ,疫苗组CD+ 4CD8+ T淋巴细胞有显著性的增高 ,体外培养的脾脏细胞IFN -γ有一个高浓度的分泌。结论　恶性疟原虫FCC - 1/HNMSP - 2DNA疫苗诱导了一个TH1的免疫应答类型     

日本血吸虫23 kDa膜蛋白DNA疫苗和蛋白质疫苗联合应用免疫保护性作用的研究

目的　研究 Sj C2 3DNA疫苗和 Sj C2 3蛋白疫苗联合免疫对 C5 7BL/ 6感染小鼠的免疫保护作用。方法　分别构建和制备 Sj C2 3DNA疫苗 (pc DNA3.1- Sj C2 3)和蛋白疫苗 (Sj C2 3大亲水片段融合蛋白 GST- HD)。 4 8只 C5 7BL / 6小鼠随机分为 A、B、C、D 4组 ,每组 12只。 A组 (Sj C2 3DNA+GST- HD联合应用组 )每只小鼠分别在第 0、2周经股四头肌注射 10 0μg Sj C2 3质粒 DNA,在第 4周经背部皮下多点注射 5 0 μg GST- HD+5 0 μg CFA;B组 (Sj C2 3DNA组 )每只小鼠分别在第 0、2、4周经股四头肌注射 10 0 μg Sj C2 3质粒 DNA;C组 (蛋白疫苗组 )于第 4周每鼠经背部皮下多点注射5 0μg GST- HD+5 0μg CFA 1次 ;D组 (对照组 )每鼠分别在第 0、2、4周肌注 10 0μg pc DNA 3.1。各组在末次免疫后 30 d每鼠以 4 5± 2条 /只日本血吸虫尾蚴攻击感染 ,攻击后 4 5 d剖杀小鼠 ,计数成虫及肝内虫卵数。在免疫前、末次免疫后和攻击后从小鼠尾静脉采血 ,分离血清 ,用 Western- blot法检测抗体反应。结果　联合组与质粒对照组相比 ,获得了 36 .9%的减虫率和 30 .7%减卵率 ;而单独Sj C2 3DNA疫苗组的减虫率为 2 6 .9% ,显著低于联合组 (P<0 .0 5 )和 2 2 .2 %的减卵率 ,单独蛋白疫苗组 (GST- HD)为 15 .2 %和 12 .2 %     

乙型肝炎DNA疫苗诱导小鼠免疫反应的实验研究

目的 探讨DNA疫苗pCI-S-IRES-ProTα接种小鼠后的免疫反应变化。方法 用基因重组技术构建DNA疫苗,脂质体介导转染NIH－3T3细胞,并给小鼠进行DNA疫苗接种。ELISA检测HBsAg、抗－HBs,RT－PCR检测pCI-S-IRES-ProTα的表达。结果 pCI-S-IRES-ProTα、pCI-S在细胞中高效表达,pCI-S-IRES-ProTα接种小鼠产生的体液反应和特异淋巴细胞增殖反应强于pCI-S组。结论 ProT α可增强接种小鼠的免疫反应。     

Development of DNA Vaccine Candidate against SARS-CoV-2

Despite the existence of various types of vaccines and the involvement of the world’s leading pharmaceutical companies, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) remains the most challenging health threat in this century. Along with the increased transmissibility, new strains continue to emerge leading to the need for more vaccines that would elicit protectiveness and safety against the new strains of the virus. Nucleic acid vaccines seem to be the most effective approach in case of a sudden outbreak of infection or the emergence of a new strain as it requires less time than any conventional vaccine development. Hence, in the current study, a DNA vaccine encoding the trimeric prefusion-stabilized ectodomain (S1+S2) of SARS-CoV-2 S-protein was designed by introducing six additional prolines mutation, termed HexaPro. The three-dose regimen of designed DNA vaccine immunization in mice demonstrated the generation of protective antibodies.     

日本血吸虫中国大陆株23 kDa膜蛋白DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫的研究

目的　研究日本血吸虫中国大陆株 2 3kDa膜蛋白 (SjC2 3)DNA疫苗诱导C5 7BL/6小鼠免疫保护作用。方法　将全长的SjC2 3基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1,构建DNA疫苗 pcDNA3.1 SjC2 3。制备SjC2 3及IL 12的两个亚单位 p35、p4 0的DNA疫苗和对照 pcDNA3.1。 4 8只C5 7BL/6小鼠随机分为A、B、C 3组。A组小鼠肌注 10 0 μgpcDNA3.1;B组注射 10 0 μg pcDNA3.1 SjC2 3;C组肌注 pcDNA3.1 SjC2 3、pcDNA3.1 p35及pcDNA3.1 p4 0各 10 0 μg的混合物。每隔 2周各免疫 1次 ,共 3次。第 8周每鼠感染 4 5± 2条 /只尾蚴 ,4 5d后剖杀 ,计数成虫及肝内虫卵。采用免疫组化法检测SjC2 3及 p35、p4 0在小鼠局部组织内的表达 ;用脾细胞培养法检测经rSjC2 3 HD刺激后 ,攻击前、后小鼠脾细胞IL 2、IL 4、IL 10和IFN γ的水平。用Westernblotting检测血清中抗SjC2 3抗体。结果　SjC2 3以及p35、p4 0在免疫小鼠股四头肌细胞膜和细胞浆均获得表达。IL 2和IFN γ的水平攻击前、后在B组和C组均明显升高。Westernblotting检测抗SjC2 3抗体结果表明 ,免疫后两周 ,B组 8/10份血清为阳性 ,C组 9/10份血清阳性。B组和C组分别获得 2 6 .9%和 35 .4 %的减虫率 ,C组显著高于B组 (P <0 .0 5 ) ;减卵率分别为 2 2 .2 %和 2 8.4 %。结论　SjC     

日本血吸虫Mr 26000 GSTDNA疫苗和重组蛋白疫苗联合免疫的保护作用研究

目的 观察日本血吸虫Mr26000谷胱甘肽S-转移酶(Sj26)DNA疫苗和重组蛋白(rSj26GST)疫苗联合免疫对小鼠的保护作用。方法 将Sj26基因克隆入含有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N3,构建重组质粒pEGFP-Sj26,并转染幼仓鼠肾细胞(BHK),用荧光显微镜和蛋白质印迹法(Western blotting)检测蛋白的表达。联合免疫组BALB/c小鼠分别在第0、2周用pEGFP-Sj26免疫2次,第4周再用rSj26GST加强免疫1次;而单独免疫的pEGFP-Sj26组及rSj26GST组,与上组同步各自免疫3次。末次免疫后2周进行感染攻击,45d后剖杀,计数成虫及肝内虫卵。同时设PBS对照组。结果 pEGFP-Sj26在BHK中能有效表达。联合免疫组的减虫率为50·8%,显著高于pEGFP-Sj26(28.0%)和rSj26GST组(25.5%)(P值均<0.01)。联合免疫组以及pEGFP-Sj26、rSj26GST组减卵率分别为32.7%、20.6%、33.0%;联合免疫组及rSj26GST组,肝组织中每条雌虫平均产卵数显著低于PBS对照组(P值均<0.01)。结论 联合免疫组的保护作用优于pEGFP-Sj26和rSj26GST单独免疫组。     

猪囊尾蚴病DNA疫苗研究现状

猪囊尾蚴病DNA疫苗是近年来出现和发展起来的一种新型疫苗,不仅可以引起体液免疫,而且还能诱导高水平的细胞免疫应答,在猪囊尾蚴病预防方面优势明显。本文就猪囊尾蚴病DNA疫苗的研究现状作一综述。     

Sjcb2 DNA疫苗的构建及其在HeLa细胞中的表达

构建日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶基因核酸疫苗，PCR、双酶切和DNA序列鉴定后，运用电穿孔技术将重组体pcDNA3.1（+）／Sjcb2转染Hela细胞，免疫细胞化学检测其能在HeLa细胞浆内表达，为抗日本血吸虫核酸疫苗的研制打基础。     

SAG1-MIC8复合DNA基因疫苗免疫小鼠诱导抗弓形虫感染的保护性研究(英文)

目的观察弓形虫SAG1-MIC8复合DNA基因疫苗对C57BL/6J小鼠的免疫保护作用。方法构建重组质粒pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-MIC8和pcDNA3.1-SAG1-MIC8,并分别转染Hela细胞体外表达蛋白,蛋白质印迹(Westernblotting)分析鉴定。将70只小鼠随机均分为5组,分别为PBS组、空质粒组、pcDNA3.1-SAG1组、pcDNA3.1-MIC8组和pcDNA3.1-SAG1-MIC8组,每2周肌注免疫(100μg/只)1次,共3次,于免疫前和初次免疫后13、27、41和55d采血分离血清。初次免疫后56d,每组小鼠中7只剖杀后分离脾细胞,另7只经腹膜感染弓形虫RH株速殖子(1×104/只),观察各组生存时间。ELISA法分别检测各组小鼠血清IgG、IgG1、IgG2b和IgG2c水平,以及干扰素γ(IFN-γ)和白介素4(IL-4)水平。放射法检测T淋巴细胞增殖情况。结果Westernblotting分析结果显示,重组质粒pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-MIC8和pcDNA3.1-SAG1-MIC8均能在Hela细胞表达,蛋白相对分子质量(Mr)分别为34000、74000和109000。pcDNA3.1-SAG1-MIC8组初次免疫后41d和55d血清中IgG,末次血清中IgG2b、IgG2c和IFN-γ,以及T淋巴细胞增殖能力均显著高于其他各组(均P0.05)。各组的末次血清中IgG1和IL-4水平差异均无统计学意义(均P0.05)。5组小鼠感染弓形虫速殖子后生存时间中位数分别为3、4、7、7和10d,各组间差异有统计学意义(P0.01)。结论弓形虫SAG1-MIC8复合DNA抗原较SAG1和MIC8单基因抗原有更好的免疫保护性。     

Immunisation Using Novel DNA Vaccine Encoding Virus Membrane Fusion Complex and Chemokine Genes Shows High Protection from HSV-2

Herpes simplex virus 1 and 2 infections cause high unmet disease burdens worldwide. Mainly HSV-2 causes persistent sexually transmitted disease, fatal neonatal disease and increased transmission of HIV/AIDS. Thus, there is an urgent requirement to develop effective vaccines. We developed nucleic acid vaccines encoding a novel virus entry complex stabilising cell membrane fusion, ‘virus-like membranes’, VLM. Two dose intramuscular immunisations using DNA expression plasmids in a guinea pig model gave 100% protection against acute disease and significantly reduced virus replication after virus intravaginal challenge. There was also reduced establishment of latency within the dorsal root ganglia and spinal cord, but recurrent disease and recurrent virus shedding remained. To increase cellular immunity and protect against recurrent disease, cDNA encoding an inhibitor of chemokine receptors on T regulatory cells was added and compared to chemokine CCL5 effects. Immunisation including this novel human chemokine gene, newly defined splice variant from an endogenous virus genome, ‘virokine immune therapeutic’, VIT, protected most guinea pigs from recurrent disease and reduced recurrent virus shedding distinct from a gD protein vaccine similar to that previously evaluated in clinical trials. All DNA vaccines induced significant neutralising antibodies and warrant evaluation for new therapeutic treatments.     

重组白细胞介素-4增强日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗诱导小鼠的保护力

目的?摇探讨重组白细胞介素－4（IL-4）真核表达质粒增强日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗对小鼠的免疫保护效果。 方法 将小鼠IL-4 基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1以构建小鼠重组IL-4表达质粒， 并联合日本血吸虫组织蛋白酶B的表达质粒DNA (VR1012-Sj31)肌注免疫小鼠，设重组IL-4表达质粒、组织蛋白酶B表达质粒和2种空载体质粒对照组。免疫组化检测IL-4和组织蛋白酶B在小鼠肌细胞内的表达，末次免疫3周后攻击感染，用减虫率及减卵率表示保护力。 结果 重组IL-4和组织蛋白酶B DNA均在小鼠肌细胞表达，重组IL-4和组织蛋白酶B DNA联合免疫小鼠，产生43.2% 的减虫率和76.6% 的减卵率，与组织蛋白酶B DNA单独免疫相比差异有显著性（P<0.01，P<0.05 ）。 结论 重组IL-4 能提高日本血吸虫组织蛋白酶B 核酸疫苗的抗血吸虫保护力作用，具有佐剂的免疫效应。     

日本血吸虫三磷酸甘油醛脱氢酶核酸疫苗小鼠体内的免疫应答特征

目的 研究日本血吸虫大陆株三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠诱生的免疫应答特征和保护性。 方法 将用免疫筛库得到的日本血吸虫大陆株GAPDH编码基因以PCR扩增，扩增产物T-A克隆至载体pT-Adv而后与真核表达载体pcDNA3连接，构建成核酸疫苗（pcDNA3-SjGAPDH）。将纯化的pcDNA3-SjGAPDH经后腿胫前肌免疫C57BL/6小鼠。免疫荧光染色法研究pcDNA3-SjGAPDH在注射的局部肌肉表达特性；用十二烷基硫酸钠?鄄聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）、蛋白质印迹法（Western blotting）、ELISA等方法分析pcDNA3-SjGAPDH所诱导的特异性免疫应答特征。 结果 pcDNA3-SjGAPDH免疫后24和48h即可在荧光显微镜下看到C57BL/6小鼠小腿胫前肌的局部肌肉的冰冻切片发出淡绿色荧光，表明有GAPDH蛋白的表达。pcDNA3-SjGAPDH免疫小鼠主要诱生IgG2a、IgG2b和IgG3亚类；免疫小鼠脾淋巴细胞体外经特异性抗原刺激主要诱生γ-干扰素(IFN-γ)和白介素-2(IL-2)细胞因子，未检出IL-4。另外，免疫鼠血清能够识别日本血吸虫SWAP中的天然GAPDH成分。 结论 pcDNA3-SjGAPDH核酸疫苗免疫C57BL/6小鼠主要诱导Th1类型细胞免疫应答。