PCR循环测序法检测K-ras和HCV 5'非编码区基因变异

目的：建立一种简单、快速、可靠的ＤＮＡ序列分析方法，并利用此方法分析Ｋｒａｓ基因和ＨＣＶ５′非编码区基因的变异情况。方法：ＰＣＲ循环测序法是将ＰＣＲ扩增与核酸序列分析相结合的一种研究方法。根据此技术原理，建立了以ＰＣＲ扩增引物为测序引物，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶、荧光标记的２′，３′双脱氧核苷三磷酸（ｄｄＮＴＰ）直接进行ＰＣＲ扩增产物序列分析的方法。应用该方法对人肺癌组织中的Ｋｒａｓ癌基因和丙型肝炎病毒５′非编码区（ＨＣＶ５′ＮＴＲ）进行了序列测定。结果：肺癌组织中的Ｋｒａｓ基因第１外显子第３５位碱基发生点突变（ＧＧＴ→ＧＡＴ）；属于高度保守区的ＨＣＶ５′ＮＴＲ存在基因变异。结论：ＰＣＲ循环测序法具有简单、快速、结果可靠等特点，为基因突变的检测和病原体的核酸序列分析提供了一个快速实用的方法。     

结核分枝杆菌耐药基因检测

目的：研究结核分枝杆菌耐药的分子机制，建立快速检测耐药基因型的分子药敏试验方法。方法：通过聚合酶链反应、ＰＣＲ－单链构象多态性、ＰＣＲ－限制性片段长度多态性分析ＭＴ临床分离株的ｒｐｏＢ、ｒｐｓＬ、ＫａｔＧ基因和ｉｎｈＡ调节序列。结果：ＰＣＲ分析耐药基因的敏感性为１－１０ｐｇＤＮＡ；除ｒｐｏＢ经物ＰＣＲ扩增为属特异性外，余耐药基因引物ＰＣＲ扩增都具有较高的种特异性。与传统药敏试验方法相比，ＰＣＲ与Ｐ     

人白细胞介素18cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

获得ＩＬ－１８全长ｃＤＮＡ序列，研究ＩＬ－１８在大直菌中的表达。方法利用ＲＴ－ＰＣＲ方法人人外周血单个核细胞中扩增出人白细胞介素的ｃＤＮＡ，以Ｓａｎｇｅｒ双脱氧法测序。     

应用核糖体DNA聚合酶链反应方法鉴别蚊虫

为了建立一种能鉴别蚊类近缘种的ＰＣＲ方法，用ＰＣＲ方法扩增按蚊，库蚊和伊蚊等蚊虫的γＤＮＡ－ＩＴＳ２区片段。７种蚊虫基因ＤＮＡ扩增出γＤＮＡ－ＩＴＳ２区片段在３４５－５８５ｂｐ之间。表明该技术是一种简便可靠的蚊种近缘种鉴别方法。     

糖还原酶基因（AC）n二核苷酸串联重复序列不同等位基因的筛选

研究了醛糖还原酶基因转当起始点上游－２．１ｋｂ处的微卫星ＤＮＡ标记－（ＡＣ）ｎ二核苷酸串联重复序列７种等位基因（Ｚ＋６，Ｚ＋４，Ｚ＋２，Ｚ，Ｘ－２，Ｚ－４和 Ｚ－６）的筛选方法。首先自人外周血提取基因组ＤＮＡ后设计一对引物进行ＰＣＲ扩增，获得长度为１３２－１４４ｂｐ的ＤＮＡ片段。选取等位基因为纯合子的个体ＤＮＡ标本的ＰＣＲ扩增产物，经纯化后直接测序以确定等位基因的种类；并以确定的等位基因为标准，用     

呼吸道合胞病毒PCR序列分析方法的建立和应用

目的：探讨呼吸道合胞病毒ｃＤＮＡ（ＲＳＶ ｃＤＮＡ）序列分析的方法。方法：将ＰＣＲ扩增与核酸序列分析技术相结合,以γ＾３２Ｐ－ＡＴＰ标记Ｔ７Ｐｒｏｍｏｔｅｒ为测序引物,Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶直接测序。结果：测序梯清晰,可读性好。．ＲＳＶ ＮＳ和Ｎ基因区虽较稳定,但仍有颠换突变。结论：ＲＳＶ的变异性决定了它对人类的反复感染,ＰＣＲ测序方法较简便,在临床标本的检测和变异的观察中有重要意义。     

肾移植供受者DNA水平人类白细胞抗原－DR配型的研究

探讨利用聚合酶链反应方法（ＰＣＲ－ＳＳＰ），进行人类白细胞抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ基因分型，并应用于肾移植临床的可行性，以准确选择理想配型的供受者，提高移植物长期存活率。方法作者应用分子生物学技术根据ＨＬＡ－ＤＲ核苷酸序列设计合成３０个特异引物，快速盐析法提取模板ＤＮＡ，借助ＰＣＲ技术建立ＰＣＲ－ＳＳＰ方法，对１７１例肾移植供受者和１４份标准ＤＮＡ进行ＨＬＡ－ＤＲ基因水平分型。扩增条件为９４℃、３０秒、６０℃、５０秒，７２℃、４０秒，共３４个循环。分型结果采用标准ＤＮＡ，限制性内切酶分析和特异性探针杂交等予以确证。结果所有１７１份样本和１４份标准ＤＮＡ采用ＰＣＲ－ＳＳＰ进行ＨＬＡ－ＤＲ基因分型均获成功。特异性扩增产物与引物设计预期大小相同，无假阳性和假阴性，总耗时５小时。分型结果经标准ＤＮＡ、内切酶分析和探针杂交等证实符合，特异性和重复性为１００％。结论ＰＣＲ－ＳＳＰ用于ＨＬＡ－ＤＲ基因分型是一种快速而精确的方法，适合于器官移植，尤其是尸肾移植供受者配型选择的临床应用。     

副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆

目的探讨克隆副溶血性弧菌（Ｖｐ）耐热直接溶血毒素基因的方法。方法用ＰＣＲ技术扩增目的基因,双酶切载体 ｐＵＣ１９和目的基因 ＤＮＡ,连接并转化大肠杆菌 ＪＭ１０９。对重组质粒进行 ＰＣＲ鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果凝胶电 泳显示,标准株Ｖｐｌ４－９０基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ产物长约６００ ｂｐ。阳性克隆的ＰＣＲ产物也为一长约６００ ｂｐ）的条带,经双 酶切可切出一约 ６００ ｂｐ的条带。 ＤＮＡ 测序结果表明与 Ｇｅｎｅｂａｎｋ中的序列有 ９９．６５％的同源性。结论利用该方法成功 克隆了目的基因,为制备用于现场检测的基因探针和Ｖｐ的保护性菌苗以及阐明Ｖｐ的致病机理奠定了基础。     

2.2.15细胞中HBV DNA前C和C区PCR扩增及其产物测序

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）及其扩增产物的直接测序技术对２．２．１５细胞中乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）基因前Ｃ和Ｃ区进行测序。结果表明，根据ａｙｗ亚型ＨＢＶ基因设计的引物能够扩增２．２．１５细胞中ＨＢＶＤＮＡ扩增产物位于２２１－２９８碱基对之间，而对ａｄｒ亚型ＨＢＶＤＮＡ无扩增作用，说明ＰＣＲ扩增是特异性的，所测到的１３２个碱基序列与ａｗｙ１亚型ＨＢＶＤＮＡ完全符合，提示２．２．１５细胞中ＨＢＶＤＮＡ属ａ     

桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因,并对其进行序列分析。方法：从桂北五步蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ,采用一步法（ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ在同一管内进行）扩增出纤溶酶金属蛋白基因,利用平端连接的方法将ＰＣＲ扩增产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体,挑选白色菌落,用酶切和ＰＣＲ法对其进行鉴定,直接利用纯化ＰＣＲ产物进行测序或提取阳性菌落进行测序。结果：ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ扩增得到一６００ｂｐ产物,并被克隆     

人淋巴霉素cDNA克隆及顺序分析

目的：克隆人淋巴毒素ｃＤＮＡ并测序。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从ＰＨＡ／ＰＭＡ活化的Ｔ细胞系Ｊｕｒｋａｔ细胞总ＲＮＡ中扩增入淋巴毒素ｃＤＮＡ并定向克隆于ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９质粒载体Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序，结果：ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一个５４１ｂｐ的ＤＮＡ片段，限制性内切酶图谱分析和测序结果显示。该５４１ｂｐ片段为编码人淋巴毒素成熟肽的ｃＤＮＡ，与公布的人淋巴毒素ｃＤＮＡ序列完全一致，结论；     

用PTVS检测t（14；18）PCR产物的DNA序列

为确定聚合酶链反应（ＰＣＲ）和地高辛（ＤＩＧ）系统检测ｔ（１４；１８）的特异性，我们采用ＰＧＥＭ－Ｔｖｅｃｔｏｒ系统（ＰＴＶＳ）和双脱氧链终止技术克隆并测定了ＲＬ细胞系和一个ＮＨＬ患者－Ａｍｂｒｏｓｅｎ的ｔ（１４；１８）ＰＣＲ产物的ＤＮＡ序列。结果表明两者的ＰＣＲ扩增产物均为ｂｃｌ－２－ＪＨ融合基因片段，证实ＰＣＲ－ＤＩＧ系统是一种特异的检测ｔ（１４；１８）的方法。同时还表明用ＰＴＶＳ对ＰＣＲ。产物进行克隆测序优于直接用双脱氧法测序。     

未知人Na（＋）—K（＋）—Exchanging ATP aseα1亚基基因第一 …

目的 研究人Ｎａ（＋）－Ｋ（＋）－ＥｘｃｈａｎｇｉｎｇＡＴＰａｓｅα１亚单位基因外区约８０￣１３０位氨基酸编码序列的未知基因组结构。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法对人基因组ＤＮＡ及ｃＤＮＡ文库进行扩增,限制性酶切分析扩增产物,并进行荧光测序,对测序结果进行同源性分析及剪接位点的搜索并对得到的核苷酸序列进行分析。结果 人基因组ＤＮＡ和ｃＤＮＡ经扩增后分别得到８３３和１９５ｂｐ两种不同大小的片段     

检测HBV DNA基因型的方法学探讨

迄今发表的ＨＢＶＤＮＡ全序列已有６１株，根据其核苷酸序列的差异分为Ａ～Ｆ６个基因型。我们利用ＰＣＲ和限制性片段长度多态性分析技术，由慢性无症状ＨＢＶ携带者血清扩增病毒Ｓ基因区，建立了新的分型方法；用此方法对广州地区６１名慢性无症状携带者的ＨＢＶＤＮＡ进行分型，发现主要为Ｂ、Ｃ两种基因型。     

PCR—谱酶法检测小儿肝炎综合征人疱疹解毒DNA的研究

为探讨婴儿肝炎综合征（ＮＨＳ）与疱疹病毒（ＨＳＶ）感染的关系。在疱疹病毒高度同源序列ＤＮＡ聚合酶基因中设计一对引物，能对ＨＳＶ－Ｉ、ＨＳＶ－Ⅱ、ＥＢＶ和ＣＭＶ四种疱疹病毒ＤＮＡ进行扩增，继而用凝胶电泳和限制性内切酶ＢａｍＨⅠ或ＳｍａⅠ酶切分析扩增产物进行鉴别，建立了能一次性分型检测上述四种病毒的ＰＣＲ－酶谱法。灵敏度可测到１ｆｇＤＮＡ，且该引物仅对四种疱疹病毒扩增。用建立的ＰＣＲ－酶谱法检测３０例     

人干细胞因子的cDNA基因克隆

利用逆转录－ＰＣＲ的方法从人骨髓基质细胞中扩增出人干细胞因子基因，并与载体ｐＫＫ２３３－２和ｐＵＣ１８重组。经该基因的限制酶酶解图谱分析及ＤＮＡ序列分析证实。     

HIV-1基因限制性显示片段的克隆与序列分析

目的　克隆并分析经限制性显示－聚合酶链反应（ＲＤ－ＰＣＲ）扩增的ＨＩＶ－１基因片段。方法　将所有ＨＩＶ－１基因片段 分成１０组并进行ＲＤ－ＰＣＲ扩增,纯化各组ＰＣＲ产物后将之克隆至Ｔ载体上并快速鉴定。从阳性克隆中提取质粒,扩 增靶片段并测序。结果　序列分析表明,所扩增的片段均属于ＨＩＶ基因。结论　改良了一种多片段的克隆及鉴定方法并 用于限制性显示扩增片段的克隆。     

一种连接产物—PCR方法用于获知难或不能被克隆的DNA片段

目的 为获知难或不能被克隆的ＤＮＡ片段。方法 建立一种以体外连接产物作为模板底物的取合酶链反应（Ｌｉｇａｔｉｏｎ－ＰＣＲ）法，通过染色体酶切消化混合物中目标ＤＮＡ片段的序列，未知的一端连接于一常用的克隆载体如ｐＭＣＬ２００上，利用载体的已知ＤＮＡ片段序列设计引物与目标ＤＮＡ片段序列已知一端的引物配对，进而扩增该目标ＤＮＡ片段并测定其部分序列。然后设计新引物并使用常规ＰＣＲ方法直接从染色体基因组６．     

抗－HBe阳性患者乙肝病毒前核心基因的扩增与克隆

本文采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法从９例抗－ＨＢｅ阳性的乙肝患者血清中扩增了含ＰｒｅＣ和Ｃ基因的ＤＮＡ片段，并分别与载体ｐＵＣ１８相连接，成功地克隆入大肠杆菌中，为后续的ＤＮＡ测序及分析ＰｒｅＣ基因突变打下了基础。并建立了快速、简便的ＰＣＲ直接筛选和鉴定阳性克隆的方法。     

结核杆菌特异性重复DNA序列的PCR扩增检测

结核杆菌特异性重复ＤＮＡ序列的ＰＣＲ扩增检测徐华梅，巫绪芳，潘理明，吴竞生，王祖贻结核杆菌染色体ＤＮＡ中有一段多次重复出现的核甙酸序列，以此基因片段作为靶ＤＮＡ，利用ＰＣＲ技术进行扩增，为结核病人快速诊断，及时治疗提供依据。本文摘要报告我们的研究结果...