vIL-10逆转录病毒载体构建及在鼠成纤维细胞中的表达

目的：探讨ｖＩＬ１０的免疫抑制作用，为应用ｖＩＬ１０进行免疫基因治疗打基础。方法：用基因重组技术将ｖＩＬ１０ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ，并用脂质体法导入包装细胞ＰＡ３１７，取其上清感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３。结果：经筛选获得抗Ｇ４１８的ＮＩＨ３Ｔ３阳性克隆，用ＲＴＰＣＲ，ＥＬＩＳＡ方法检测到ｖＩＬ１０的表达，用３ＨＴｄＲ法检测到ｖＩＬ１０对ＭＬＲ的抑制作用。结论：构建ｖＩＬ１０逆转录病毒表达载体并转染小鼠成纤维细胞，初步证实ｖＩＬ１０具有免疫抑制作用。     

逆转录病毒介导的vIL—10表达对小鼠MLC和心脏移植存活？…

目的：探讨逆转录病毒介导的病毒白介素１０（ｖＩＬ－１０）基因表达对小鼠混合淋巴细胞培养（ＭＬＣ）反应和心脏移植存活期的影响。方法：将ｖＩＬ－１０ ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ，取ｖＩＬ－１０重组逆转录病毒上清加入ＢＡＢＬ／ｃ和ＣＢＡ／Ｊ混合淋巴细胞中培养，液闪测量。在新生ＣＢＡ／Ｊ小鼠心脏移植时，将ｖＩＬ－１０上清１０μＬ（１０００ｐｆｕ）注入移植心脏内，观察其对心脏移植存活期的影响。结     

逆转录病毒转移的β—半乳糖苷酶基因在成纤维细胞中的表达

为了研究逆转录病毒载体转移外源基因的实用性，我们采用小鼠白血病病毒（ＭｏＭＬＶ）载体将大肠杆菌的β－半乳糖苷酶基因（ｌａｃＺ）和抗新霉素（Ｎｅｏ＾Ｒ）基因转移到大鼠成纤维细胞内，对整合后的前病毒结构和基因表达进行了酶活性测定和ＤＮＡ分析。结果表明：ｌａｃＺ基因可以在大鼠皮肤成纤维细胞和２０８Ｆ细胞株中较长时间地表达；前病毒整合位点。靶细胞特性和整合后的载体结构与转入基因表达的稳定性紧密相关。     

小鼠GM—CSF cDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍ     

成纤维细胞介导的人IL-10基因疗法的实验研究

目的：建立ＩＬ－１０基因疗法的实验模型，并动态观察其体内ＩＬ－１０分泌水平。方法和结果：构建携带鼠ＩＬ－１０基因的重组逆转录病毒载体，体外转染小鼠ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞，筛选到１株高分泌ＩＬ－１０的细胞克隆株；将此阳性克隆株移植到小鼠腹腔内，可在小鼠血清中检测出ＩＬ－１０的活性。结论：成纤维细胞能成功地将ＩＬ－１０基因导入体内并有效表达     

小鼠GM─CSFcDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因组中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍＲＮＡ表达，用骨髓细胞增殖法和ＣＦＵ－ＧＭ检测也表明转化细胞分泌有较多的ＧＭ－ＣＳＦ，该研究为下一步在动物体内进行ＧＭ－ＣＳＦ基因治疗的研究奠定基础     

IL-10对TGF-β刺激成纤维细胞转化的影响

目的 探讨白介素-10(interleukin-10,IL-10)对转化生长因子-β(transtorm growth factor beta,TGF-β)刺激成纤维细胞增殖、胶原分泌以及向肌成纤维细胞(myofibroblast,MFB)转化的影响.方法 培养人胚肺成纤维细胞,根据不同的处理方法分为五组:A组加入TGF-β (5 ng/ml),B组加TGF-β (5 ng/ml)+IL-10(5 ng/ml),C组加TGF-β (5 ng/ml)+IL-10(15 ng/ml),D组加TGF-β (5 ng/ml)+IL-10(25 ng/ml),E组为空白对照组(无细胞).于72 h使用MTT方法观察各组成纤维细胞增殖情况,羟脯氨酸消化法检测胶原产生量,免疫细胞化学法检测平滑肌肌动蛋白( α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达情况.结果 B、C、D组细胞内α-SMA表达量分别与A组比较,差异均有统计学意义(P均＜0.01),D组与B、C组比较差异均有统计学意义(P均＜0.01);羟脯氨酸产生量C与B组、D组比较差异均有统计学意义(P均＜0.01).细胞增殖吸光度D组与C、B组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 在体外IL-10对TGF-β刺激成纤维细胞的增殖、胶原产生及α-SMA表达有抑制作用,且呈剂量依赖性.     

人白介素10逆转录病毒表达载体的构建

目的构建一个人白介素10(hIL-10)逆转录病毒表达载体,为研究hIL-10的生物学活性打下基础.方法用限制性内切酶消化提取质粒pCDHIL-10中hIL-10全长cDNA,采用定向克隆的方法将hIL-10基因插入逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点中,经转化、扩增、限制性内切酶消化,电泳鉴定分析.结果外源性hIL-10基因成功插入到逆转录病毒载体pLXSN的中.结论成功完成了人白介素10(hIL-10)逆转录病毒表达载体的构建,为今后进一步研究hIL-10的生物学活性打下了基础.     

人生长激素重组载体的构建及其在原代成纤维细胞中的表达

早在1987年，生长激素(GH)基因即被成功克隆，随即开展了基因治疗的有关研究，但其进入临床试验的阻碍主要是缺少一个高效、易操作的基因治疗系统，尤其是靶细胞的问题，尽管传代细胞系易培养，但存在免疫排斥反应和肿瘤形成的危险。本实验以原代小鼠胚胎成纤维细胞为靶细胞，以逆转录病毒为基因表达载体，建立一个可操作的基因治疗系统。     

重组正反义α-SMA逆转录病毒载体对瘢痕与皮肤成纤维细胞的影响

目的 利用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因重组反义和正义逆转录病毒载体，探讨α-SMA逆转录病毒对瘢痕与皮肤成纤维细胞的影响。方法 用含α-平滑肌肌动蛋白cDNA，重组反义和正义逆转录病毒载体，并感染培养的瘢痕和皮肤成纤维细胞，进行α-SMA在蛋白水平表达等的研究，观察瘢痕与皮肤成纤维细胞形态学与功能的变化。结果 反义α-SMA逆转录病毒抑制了瘢痕成纤维细胞的增殖，细胞形态变小；α-SMA在瘢痕与皮肤成纤维细胞表达降低，并随着作用时间延长，效果更明显；正义α-SMA逆转录病毒则具有相反的作用，促进α-SMA的表达。结论 α-SMA重组病毒对瘢痕与皮肤成纤维细胞的形态、生长、细胞功能均有影响。     

成纤维细胞生长因子10 mRNA在寻常型银屑病皮损中的表达

目的:研究成纤维细胞生长因子10 mRNA在寻常型银屑病皮损中的表达,探讨其在银屑病发病中的作用机制.方法:应用原位杂交法检测FGF10 mRNA在22例正常皮肤组织、银屑病皮损和未受累皮肤中的表达和分布.结果:原位杂交法检测发现,在22例正常皮肤组织、银屑病皮损和未受累皮肤表皮的全层或表皮中下层可见FGF10 mRNA表达(95%);在正常皮肤表皮的基底层或少量细胞内可见FGF10 mRNA的表达(5%);在寻常型银屑病非皮损表皮的中下层或个别细胞内可见FGF10 mRNA的表达(82%).寻常型银屑病皮损表皮中FGF10 mRNA的表达明显高于正常对照组(P＜0.05).结论:FGF10 mRNA在银屑病发病早期阶段的表达增高可能与银屑病的早期发病有关.     

pEGFP-N1/hIL-1ra重组真核表达载体的构建及其在人牙龈成纤维细胞中的瞬时表达

目的:构建重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra)基因真核表达载体pEGFP-N1/hIL-1ra,瞬时转染人牙龈成纤维细胞并检测其表达,为牙周炎症的基因治疗提供实验基础。方法:TRIzol法提取人乳腺癌组织总RNA进行RT-PCR,将纯化的扩增产物hIL-1ra与克隆载体pMD18-T连接、转化,测序正确后将重组体pMD18-T/hIL-1ra与真核表达质粒pEGFP-N1分别进行双酶切,连接后转化感受态细菌E.coliTOP10。将构建正确的pEGFP-N1/hIL-1ra重组质粒DNA瞬时转染人牙龈成纤维细胞,荧光显微镜观察绿色荧光的表达,RT-PCR方法检测其基因的表达。结果:构建的pEGFP-N1/hIL-1ra真核表达载体经PCR及双酶切鉴定均表明人IL-1ra基因已与pEGFP-N1正确重组。瞬时转染人牙龈成纤维细胞后能观察到绿色荧光,RT-PCR可得到目的片段。结论:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/hIL-1ra,瞬时转染人牙龈成纤维细胞后检测到其基因水平的表达,为炎性细胞因子拮抗剂基因用于牙周炎抗炎治疗奠定了实验基础。     

成纤维细胞生长因子10在肺损伤性修复中的研究进展

成纤维细胞生长因子(FGF)10来源于间充质细胞,介导间充质-上皮之间的信号转导,调控支气管-肺泡上皮细胞的增殖分化,在胚胎支气管-肺的形态发生过程中发挥重要调控作用.伴随组织修复和再生医学的兴起,FGF10在肺损伤中的修复能力开始受到关注,FGF10-FGF受体2b信号通路决定了FGF10靶向调控支气管-肺泡上皮的细...     

Islet-1基因逆转录病毒表达载体的构建

目的：分离大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1（Islet-1）基因,构建plEGFP-C1-Islet-1逆转录病毒表达载体。方法：利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,克隆到测序载体PGET-1 TA 中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,通过脂质体2000将其导入包装细胞PA317中,经G418筛选后,获得阳性克隆。结果：RT-PCR产物为1 050 bp条带,经测序鉴定与GenBank中Islet-1基因的序列相同;构建的plEGFP-C1-Islet-1载体经酶切鉴定,证实Islet-1基因片段正确插入逆转录表达载体中。用共聚焦激光扫描显微镜观察导入Islet-1基因的PA317细胞,可见细胞发出绿色荧光。结论：分离得到了大鼠Islet-1基因并成功构建了plEGFP-C1-Islet-1表达载体。     

成纤维细胞激活蛋白在胃癌中的表达及临床意义

目的:探索胃癌组织中成纤维细胞激活蛋白(FAP)的表达与肿瘤恶性生物学行为和预后的关系。方法:收集2009年2月至2011年4月在我院手术的胃癌患者60例,采用免疫组化法检测胃癌组织和正常胃组织中FAP的表达水平,并分析其与临床病理特征、预后的相关性。结果:FAP在肿瘤间质成纤维细胞胞质内阳性表达,胃癌组织与正常胃组织中FAP阳性细胞数平均值分别为32.80±19.3和0.41±0.21(P<0.01)。胃癌组织中FAP的表达水平与肿瘤的大小、分化程度及临床分期明显相关(P<0.05)。Kaplan-Meier分析显示FAP低表达组胃癌患者术后的生存时间明显高于高表达组,差异有显著统计学意义(P<0.05)。结论:FAP在胃癌的生长、侵袭和转移中发挥着重要作用,可能作为胃癌预后判断和治疗的一个的潜在靶点。     

人IL—18结合蛋白cDNA的克隆及其逆转录病毒载体的构建

目的：克隆人白细胞介素－18结合蛋白（hIL-18BP)的cDNA及构建hIL-18BP逆转录病毒载体,以研究IL－18BP与IL－18相互作用的机制及自身免疫性疾病的基因治疗。方法：从中国汉族人胎盘组织中提取总RNA,用RT－PCR方法扩增hIL-18BP cDNA,与载体pcDNA3连接,转化大肠杆菌DH5α,得到的重组质粒经鉴定正确后,再作为模板进行PCR,PCR产物插入逆转录病毒载体pLNCX中。结果RT－PCR扩增出全长585bp hIL-18BP cDNA,2次酶切鉴定证明hIL-18BP已分别与pcDNA3,pLNCX重组,2次测序结果均与国外文献报道的hIL-18BP的序列一致。结论：成功地克隆了中国人IL－18BP cDNA,并构建了重组hIL-18BP 闻转录病毒载体。     

细菌脂多糖诱导人牙龈成纤维细胞产生IL-1β

目的：在细菌脂多糖诱导下探讨人牙龈成纤维细胞（HGF）在牙周炎症反应中的作用。方法：用细胞培养法，酶联免疫吸附分析法（ELISA）检测细胞培养液上清中的IL－β浓度，用MTT法检测人牙龈成纤维细胞对细菌脂多糖（LPS）的增殖反应。结果：LPS对HGF具有促增殖作用；LPS以剂量依赖方式诱导HGF产生IL－1β，6h最大分泌量，结论：HGF是一种能分泌炎性细胞因子参与牙周组织破坏的细胞。     

成纤维细胞与成纤维细胞激活蛋白在结肠癌中的研究进展

肿瘤发生、发展是一个错综复杂的生物学过程,不仅是实质细胞本身的恶性转变,还有赖于肿瘤微环境的作用。肿瘤微环境一般由间质细胞、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)和血管构成,其中成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)是主要的间质细胞,在微环境中与癌细胞接触,相互作用,转化为癌相关成纤维细胞(carcinoma associated fibroblasts,CAFs)。近年来,肿瘤中CAFs的研究备受关注,这些细胞在上皮肿瘤的恶性转变中发挥着不可忽视的作用。成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast activation proteih,FAP)是活化的成纤维细胞表面上的特异性表达分子,与肿瘤的生长及侵袭密切相关。现就NFs、FAP在结肠癌中的特点、具体作用及机制综述如下。     

构建人白细胞介素2逆转录病毒载体和包装细胞

目的：构建人白细胞介素２（ｈＩＬ－２）逆转录病毒载体及包装细胞。方法：用基因重组法将ｈＩＬ－２ｃＤＮＡ与ｐＬＮＣＸ重组成正义和反义ＬＮＣＩＬ－２基因。用磷酸钙－甘油法及感染法将ＬＮＣＩＬ－２基因转入ＰＡ３１７包装细胞内。所得克隆Ａ８的ｈＩＬ－２分泌量，ＤＮＡ、ＲＮＡ分别用ＥＬＩＳＡ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交法分析。结果：Ａ８分泌的ｈＩＬ－２量为８．４ｎｇ·（２４ｈ·１０６细胞）１，ｈＩＬ－２基因完整地整合到转导细胞基因组内并有ｈＩＬ－２ｍＲＮＡ表达，细胞上清内病毒滴度为１０６·ＣＦＵ·ｍｌ１。结论：本研究成功地构建编码ｈＩＬ－２的逆转录病毒载体，并筛选出能产生病毒粒子、分泌ｈＩＬ－２的包装细胞。