糖基化终末产物对ECV-304细胞ICAM-1及VCAM-1表达的影响

目的探讨糖基化终产物(AGEs)与其受体(RAGE)对ECV-304细胞上血管细胞黏附分子-(1ICAM-1)和细胞间黏附分子-(1VCAM-1)的影响,为研究AGEs在动脉粥样硬化发生发展中的作用提供实验依据。方法采用体外制备的糖基化终产物——糖基化的牛血清白蛋白(AGE-BSA)和反义RAGE寡核苷酸处理ECV-304细胞,通过流式细胞仪技术、Western印迹技术检测ECV-304细胞上ICAM-1、VCAM-1蛋白质的表达。结果AGEs处理ECV-304细胞后,可诱导ECV-304细胞上VCAM-1和ICAM-1的表达增加,且这种效应呈剂量依赖性。采用反义技术阻断RAGE的mRNA水平的翻译后,ECV-304细胞ICAM-1和VCAM-1的表达呈剂量依赖性降低。结论AGEs可通过与其膜受体RAGE的结合激活血管内皮细胞VCAM-1和ICAM-1的表达,这可能是AGEs促动脉粥样硬化发生发展的机制之一。     

晚期糖基化终产物对心肌微血管内皮细胞管样结构形成和崩解的影响及机制

目的研究晚期糖基化终产物(AGEs)对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)管样结构形成和崩解的影响及其初步机制。方法分离、培养SD大鼠CMECs,将AGEs-BSA与大鼠CMECs共同孵育,实验分为对照组(只加DMEM培养液)、BSA组(100 μg/ml BSA)、AGEs-BSA组(100μg/ml AGEs-BSA)。分别在孵育第1、3天时,用管样结构形成实验观察CMECs管样结构的长度;流式细胞仪检测CMECs的凋亡;ELISA法测定CMECs半胱天冬酶3(caspase-3)的活性。孵育1天采用Western blot法检测CMECs血管内皮细胞生长因子(VEGF)蛋白的表达。结果第1天时,与对照组和BSA组比较,AGEs-BSA组CMECs管样结构的长度明显增加,VEGF蛋白表达显著增加,差异均有统计学意义(P<0.01);而CMECs早期凋亡率及caspase-3的活性,差异无统计学意义(P>0.05)。第3天时,与对照组和BSA组比较,AGEs-BSA组CMECs的管样结构长度明显降低,CMECs早期凋亡率及caspase-3的活性显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 AGEs-BSA在早期可能通过自分泌VEGF促进CMECs管样结构的形成,晚期可能通过促进CMECs的凋亡,加速管样结构的崩解。     

C反应蛋白对血管内皮细胞表达糖基化终产物受体和MCP-1的影响

目的研究C反应蛋白（C-RP）对内皮细胞（Ec）晚期糖基化终产物受体（RAGE）的影响,及RAGE在C-RP促动脉粥样硬化中的作用。方法在不同时间用不同剂量C-RP刺激EC。用Western blot检测CRP对RAGE蛋白表达的影响,RT-PCR研究RAGEmRNA的变化。利用特异的小分子干扰RNA（siRNA）敲低RAGE基因表达,通过ELISA方法检测各组培养液中单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）水平变化。结果与对照组相比,C-RP刺激可以增加EC的RAGE蛋白和mRNA的表达（P〈O．05）,并且旱浓度-时间依赖性。在干扰RAGE基因表达后,C-RP促MCP-1分泌作用消失。结论c反应蛋白可以增加糖基化终产物受体蛋白和mRNA表达水平,并通过RAGE促进MCP1水平的增加。     

替米沙坦对人血管内皮细胞炎性反应的影响及其相关机制

目的探讨替米沙坦对晚期糖基化终末产物(AGEs)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎性反应的影响及与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的关系。方法酶消化法获取HUVECs。实验分8组:BSA组;AGEs组;以不同浓度替米沙坦刺激细胞30 min,再加AGEs,依次为TM 1组(1 nmol/L)、TM 2组(10 nmol/L)、TM 3组(100 nmol/L)、TM 4组(1000 nmol/L);GW9662组:GW9662预先刺激细胞30 min后,加替米沙坦和AGEs;15d-PGJ_2组:15d-PGJ_2预先刺激细胞30 min后,加AGEs。各组均刺激细胞24 h。采用RT-PCR法检测PPARγ、AGEs受体(RAGE)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)mRNA的表达;荧光探针2,7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸检测细胞内活性氧的变化。结果替米沙坦呈浓度依赖性抑制AGEs诱导的MCP-1 mRNA表达。与AGEs组比较,TM 4组和15d-PGJ_2组PPARγ mRNA水平明显升高,RAGE mRNA和MCP-1 mRNA水平明显下降,活性氧荧光信号强度明显减弱。与TM 4组比较,GW9662组PPARγ mRNA的表达水平明显下降,RAGE mRNA和MCP-1 mRNA的表达水平明显升高,活性氧荧光信号强度明显增强。结论替米沙坦可抑制AGEs诱导的HUVECs炎性反应;替米沙坦可能通过激活PPARγ抑制HUVECs炎性反应。     

糖基化终产物通过其受体诱导小鼠足细胞表达单核细胞趋化因子1

目的了解糖基化终产物(AGE)能否在体外诱导小鼠足细胞表达单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)以及其受体RAGE在其中的作用。方法以RT-PCR和ELISA的方法检测AGE、羰甲基化白蛋白(CML)、S100蛋白和RAGE中和抗体对小鼠足细胞的MCP-1的基因和蛋白质表达的影响。结果(1)未分化和已分化的足细胞都能表达RAGE。(2)AGE和CML以剂量依赖的方式诱导足细胞表达MCP-1mRNA。AGE和CML孵育8h诱导足细胞产生MCP-1蛋白[分别为(7.44±1.01,8.06±0.96)ng/L],明显高于牛血清白蛋白(BSA)孵育的足细胞[(3.77±0.39)ng/L,均P<0.05],而孵育24hMCP-1的浓度分别为(87.78±9.32,85.35±9.83和17.95±0.76)ng/L(均P<0.01)。(3)RAGE的另外一个配体,S100蛋白,也能以剂量依赖的方式诱导足细胞表达MCP-1mRNA。RAGE中和抗体完全阻断了AGE、CML和S100的作用。结论AGE和CML通过RAGE使诱导分化的足细胞表达MCP-1。     

普罗布考对大鼠心脏微血管内皮细胞RAGE表达的影响

目的 观察普罗布考对大鼠心脏微血管内皮细胞糖基化终末产物（AGEs）受体（RAGE）表达的影响.方法 体外原代培养心脏微血管内皮细胞.空白组加无血清培养液培养,AGEs组加AGEs（100 mg/L）孵育,普罗布考（5、10 μmol/L）组用普罗布考（5、10 μmol/L）分别作用细胞30 min后,加入AGEs（100 mg/L）再孵育24 h.各组分别作用于心脏微血管内皮细胞24h,免疫组化法和Western blot法检测RAGE蛋白表达.结果 AGEs组与空白组RAGE蛋白表达比较,P＜0.05;普罗布考10μmol/L组与AGEs组比较,P＜0.05.结论 普罗布考能够抑制AGEs诱发的心脏微血管内皮细胞RAGE的表达,从而抑制氧化应激的发生.     

P38信号通路对人脐静脉内皮细胞单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

目的 探讨P38信号通路(P38MAPK)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的关系，以及P38MAPK在糖尿病(DM)动脉粥样硬化(AS)中的作用。方法 分别以高葡萄糖(HG)、糖基化终产物(AGEs)、高胰岛素(HIns)和过氧化氢(H2O2)孵育人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，观察HUVECs P38MAPK的蛋白表达和MCP-1 mRNA表达；以P38MAPK特异抑制剂SB203580预处理，再用以上4种刺激因素孵育HUVECs，观察MCP-1 mRNA在HUVECs的表达。结果 HG、AGEs、HIns和H2O2均可独立激活P38MAPK，使磷酸化P38MAPK蛋白表达量及MCP-1 mRNA表达量增加；SB203580预处理后，MCP-1 mRNA表达被明显抑制。结论 P38MAPK调控MCP-1的表达，表明P38MAPK可能是DM致AS发生的始动信号之一。     

辛伐他汀减轻糖基化终末产物对内皮细胞环氧化酶2表达的影响

目的探讨辛伐他汀对糖基化终末产物(AGEs)诱导内皮细胞环氧化酶2(COX-2)表达的影响。方法体外以不同浓度的糖基化白蛋白(AGE-BSA)、辛伐他汀单独或联合作用于人脐静脉内皮细胞,检测细胞COX-2mRNA的表达及培养上清液中前列腺素E2(PGE2)的含量。结果 AGEBSA诱导内皮细胞COX-2mRNA的表达,作用呈剂量和时间依赖方式。辛伐他汀可降低AGE-BSA诱导的COX-2mRNA表达及PGE2产物浓度。结论 AGEs促进内皮细胞COX-2表达,辛伐他汀可减轻此作用。     

氯沙坦对自发性高血压大鼠糖基化终末产物及其受体诱导的血管损伤的影响

背景晚期糖基化终末产物(AGEs)及其受体RAGE系统在糖尿病靶器官损伤的病理过程中起非常重要的作用,有研究报道血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂(ARB)能减少体内外2型糖尿病动物AGEs聚集以及氧化应激反应.目的 探讨血管氧化应激与AGE水平及其受体RAGE及核转录因子(NF-kB)等在高血压血管损伤进程中的变化及氯沙坦对其损伤路径的影响.方法 选30 周龄自发性高血压大鼠(SHR)随机分为SHR组、氯沙坦组[30 mg/(kg·d)],WKY组为对照.干预12周,用放免法测定血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平;免疫荧光检测血管晚期糖基化终末产物(AGEs)表达;免疫组化法检测血管RAGE表达.RT-PCR检测AT1 mRNA、NF-KB mRNA、NADPH氧化酶p47 phox mRNA表达.结果 12周后,SHR组的血压稳定在治疗前水平[(222±5)mmHg],氯沙坦组血压降至[(158±4)mmHg],且明显低于SHR组(P<0.01);氯沙坦组血浆Ang Ⅱ水平达(67.4±5.4)pg/mL,明显高于SHR组[(49.5±4.6)pg/mL,P<0.01];氯沙坦组及WKY组血管AGEs表达显著低于SHR组;氯沙坦组RAGE蛋白表达指数(6.5±0.7)显著低于SHR组(8.33±0.95,P<0.01);氯沙坦组ATl mRNA、NF-kB mRNA、NADPH oxidase p47 phox mRNA 表达相对系数分别是0.51±0.06、0.39±0.07、0.36±0.05明显低于SHR组(0.91±0.12、0.54±0.1、0.54±0.06,P<0.01).结论 高血压病血管内皮细胞氧化应激增加,氯沙坦能通过阻止Ang Ⅱ与血管紧张素Ⅱ 1型受体结合,降低氧化应激抑制AGEs水平和RAGE及NF-KB活化等,改善高血压血管重塑.     

PPARγ对ECV-304细胞ICAM-1与VCAM-1表达的影响

目的 观察过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(PPARγ)对糖基化终末产物(AGEs)所诱导的血管内皮细胞表达ICAM-1、VCAM-1的影响,探讨PPARγ在糖尿病血管并发症及动脉粥样硬化中的可能作用.方法 体外培养人内皮细胞系ECV-304,应用PPARγ的反义寡核苷酸及激动剂处理细胞,采用流式细胞仪及Western印迹技术检测细胞中ICAM-1及VCAM-1蛋白质的表达.结果 反义阻断PPARγ在mRNA水平上的表达,ECV-304细胞ICAM-1及VCAM-1的表达上调,而PPARγ激动剂Ciglitizone则降低ICAM-1及VCAM-1的表达.结论 PPARγ激活可负调控AGEs诱导的血管内皮细胞ICAM-1和VCAM-1的表达,这是PPARγ抑制糖尿病血管并发症及动脉粥样硬化发生发展的可能机制之一.     

糖基化终末产物诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能改变

目的 研究糖基化终末产物(AGEs)诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能的变化及相关机制.方法 SPF级雄性Wistar大鼠20只,7～8周龄,体重260～280 g,分离培养大鼠视网膜内皮细胞,采用免疫荧光染色、流式细胞术和体外形成毛细血管样网络结构的方法进行鉴定.视网膜内皮细胞在AGEs刺激后,用噻唑蓝(MTT)法分析细胞的增殖能力;用膜连蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染法检测细胞凋亡;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术检测细胞AGEs受体、人蛋白激酶C(PKC)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达变化.采用t检验进行统计学分析.结果 分离纯化的大鼠视网膜内皮细胞表达血管性血友病因子(vWF)并在人工基膜上形成毛细血管网络结构.AGEs以时间和剂量依赖的方式抑制大鼠视网膜内皮细胞增殖能力,在200 mg/L的AGEs组培养至第5天时细胞增殖能力低于对照组(t=8.9,P＜0.05),7 d和9 d时抑制作用更明显(t值分别为15.7和46.1,均P＜0.01).400 mg/L AGEs组在第3天开始出现细胞增殖减慢(t=12.5,P＜0.05),从第5天开始增殖速度明显低于对照组(t值分别为22.4、41.5和77.7,均P＜0.01).并且AGEs诱导视网膜内皮细胞凋亡.进一步分析发现AGEs上调了大鼠视网膜内皮细胞AGEs受体、PKC、ICAM-1和iNOS的mRNA表达(t值分别为91.8、9.22、16和42,均P＜0.01)和蛋白水平的表达(t值分别为20.2、12.3、7.7和13.9,均P＜0.01).结论 AGEs可能通过上调AGEs受体诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能的改变.     

色素上皮衍生因子抑制糖基化终产物介导人肾小球系膜细胞糖基化终产物受体表达的研究

目的 观察色素上皮衍生因子（PEDF）、晚期糖基化终产物受体（RAGE）的表达及重组PEDF对RAGE表达的抑制作用,探讨PEDF与DN的关系及对DN的保护作用. 方法 采用糖化小牛血清白蛋白（AGE-BSA）体外诱导人肾小球系膜细胞（HRMCs）,Western blot及RT-PCR法分别检测RAGE、PEDF蛋白和mRNA表达. 结果 （1） AGE-BSA（100～400 mg/L）呈浓度梯度减少HRMCsPEDF表达（P＜0.01）,升高RAGE表达（P＜0.01）;（2）重组PEDF蛋白（5～40 nmol/L）呈浓度依赖性抑制AGE-BSA介导RAGE蛋白在HRMCs的表达（P＜0.05）. 结论 AGEs通过降低PEDF表达,增加RAGE表达参与DN的发生,PEDF可能通过抑制AGE-RAGE轴对DN发挥保护作用.     

Olmesartan blocks advanced glycation end products (AGEs)-induced angiogenesis in vitro by suppressing receptor for AGEs (RAGE) expression

We have previously shown that advanced glycation end products (AGEs)-their receptor (RAGE) interaction elicits angiogenesis through autocrine production of vascular endothelial growth factor (VEGF), thus suggesting the active involvement of the AGEs-RAGE system in proliferative diabetic retinopathy (PDR). Since the crosstalk between the AGEs-RAGE and the renin-angiotensin system has also been proposed in the pathogenesis of PDR, we investigated here whether olmesartan, an angiotensin II type 1 receptor blocker, inhibited the AGEs-elicited angiogenesis in vitro by suppressing the NF-kappaB-mediated RAGE expression. Olmesartan significantly inhibited the AGEs-induced NF-kappaB promoter activity and RAGE gene expression in cultured microvascular endothelial cells (ECs). Further, olmesartan was found to block the AGEs-induced up-regulation of VEGF mRNA levels and consequent increase in DNA synthesis in ECs. These results demonstrated for the first time that olmesartan inhibited the AGEs signaling to angiogenesis by suppressing RAGE expression in ECs. Our present study suggests that blockade of the renin-angiotensin system by olmesartan may play a protective role against PDR by attenuating the deleterious effects of AGEs via down-regulation of RAGE.     

血管内皮细胞中三磷酸腺苷-结合盒转运子A1对炎性细胞因子表达的影响

目的研究在公认的ATP-结合盒转运子A1(ABCA1)诱导因素8-溴-环磷酸腺苷(8-Br-cAMP)刺激下,人血管内皮细胞ECV304中ABCA1基因对炎性细胞因子细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、单核细胞化学趋向蛋白-1(MCP-1)及白介素-1β(IL-1β)的调节作用。以阐明ABCA1基因在动脉粥样硬化(AS)发生中的作用机制。方法培养人血管内皮细胞株ECV304,加入8-Br-cAMP(0.5 mmol/L)刺激3、6、12及24 h,以荧光定量逆转录聚合酶链式反应检测ABCA1、ICAM-1及MCP-1 mRNA表达量,Western blot蛋白印迹法和酶联免疫吸附测定法检测ABCA1I、CAM-1、MCP-1及IL-1β蛋白质表达量;ABCA1的反义寡核苷酸(100 nmol/L)转染人血管内皮细胞,给予上述的8-Br-cAMP,同样的方法测定上述指标的改变。结果人血管内皮细胞ECV304在给予8-Br-cAMP刺激6、12 h后,ABCA1I、CAM-1、MCP-1的mR-NA和蛋白质水平及IL-1β蛋白质水平均增高;给予反义寡核苷酸转染后,8-Br-cAMP刺激后36、h ABCA1I、CAM-1、MCP-1mRNA的表达降低,122、4 h ABCA1I、CAM-1、MCP-1及IL-1β蛋白质的表达水平降低。结论在8-Br-cAMP作用下,血管内皮细胞中ABCA1可增加炎性因子的表达,从而在AS早期的发生中发挥作用。     

Induction of macrophage inflammatory cytokines by Ox-LDL is ABCA1 dependent

Objective The current study aimed to evaluate whether the induction of macrophage inflammatory cytokines by Ox-LDL is related to the expression of ABCA 1 pathway. Methods After THP 1/PMA macrophages were transfected with ABCA1 antisense oligonucleotides （100nmol/L） followed by treatment with Ox-LDL （30mg/L）, the expressions of ABCA1, ICAM-1 and MCP-1 mRNA and protein were determined by real-time fluorescent quantitative RT-PCR, Western blot or ELISA. Results Ox-LDL induced expressions of ABCA1, ICAM-1, and MCP-1 at both mRNA and protein levels from THPI/PMA macrophages. Transfection with ABCAI antisense oligonucleotides reduced ABCA1 mRNA levels after 3 and 6 hours and protein levels after 12 and 24 hours. The expression of ICAM-1 and MCP-1 induced by Ox-LDL was also decreased after inhibition of ABCA 1 protein expression by ABCA 1 antisense oligonucleotide decreased. Conclusion The induction of macrophage inflammatory cytokines by Ox-LDL is partially dependent on expression ofABCA1. Our studies disclose new functions of ABCA1 in macrophages Objective The current study aimed to evaluate whether the induction of macrophage inflammatory eytokines by Ox-LDL is related to the expression of ABCA 1 pathway. Methods After THP 1/PMA macrophages were transfected with ABCA1 antisense oligonucleotides （100nmol/L） followed by treatment with Ox-LDL （30mg/L）, the expressions of ABCA1, ICAM-1 and MCP-1 mRNA and protein were determined by real-time fluorescent quantitative RT-PCR, Western blot or ELISA. Results Ox-LDL induced expressions of ABCA1, ICAM-1, and MCP-1 at both mRNA and protein levels from THPI/PMA macrophages. Transfection with ABCAI antisense oligonucleotides reduced ABCA1 mRNA levels after 3 and 6 hours and protein levels after 12 and 24 hours. The expression of ICAM-1 and MCP-1 induced by Ox-LDL was also decreased after inhibition of ABCA 1 protein expression by ABCA 1 antisense oligonucleotide decreased. Conclusion The induction of macrophage inflammatory cytokines by Ox-LDL is partially dependent on expression ofABCA1. Our studies disclose new functions of ABCA1 in macrophages     

糖基化终末产物对人脐静脉内皮细胞凋亡及其受体表达的影响

目的 研究糖基化终末产物(AGEs)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡及其受体(RAGE)表达的影响。方法 采用流式细胞仪技术，荧光显微镜，电镜观察AGEs对培养的HUVEC凋亡的影响，同时用RT-PCR方法检测RAGE的mRNA的表达。结果 AGEs加入细胞培养中，可明显诱导HUVEC凋亡，并呈剂量依赖效应关系。在发生凋亡的同时有RAGE mRNA表达的增强。结论 AGEs对HUVEC有诱导凋亡的作用，该作用可能通过RAGE介导。     

尾加压素Ⅱ诱导巨噬细胞表达单核细胞趋化蛋白1上调及机制研究

目的观察尾加压素Ⅱ(UⅡ)对小鼠巨噬细胞(RAW264.7细胞)表达和分泌单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的影响。方法 RAW264.7细胞用UⅡ10~(-10)、10~(-9)、10~(-8)和10~(-7)mol/L刺激后,检测MCP-1 mRNA和蛋白的水平;还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制剂二苯基碘(DPI)或抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理细胞后,再加入UⅡ10~(-7)mol/L刺激,检测MCP-1 mRNA表达和蛋白的分泌;用UⅡ刺激细胞不同时间段后,检测NADPH氧化酶亚基的表达水平;用UⅡ刺激细胞后,流式细胞仪检测细胞活性氧的生成。结果与不加UⅡ时比较,UⅡ10~(-7)mol/L刺激12 h后,巨噬细胞MCP-1 mRNA表达和蛋白分泌分别提高了100.5%和57.0%(P<0.01)。UⅡ刺激12 h后,p47phox mRNA表达为不加UⅡ时的1.96倍(P<0.01)。UⅡ刺激6 h后,巨噬细胞活性氧为不加UⅡ时的1.8倍(P<0.01)。与单用UⅡ刺激比较,用DPI或NAC预处理后,MCP-1mRNA表达分别下调21.8%和36.2%(P<0.01),蛋白分泌分别下降22.3%和19.5%(P<0.05)。结论 UⅡ可能通过NADPH氧化酶依赖的活性氧介导了小鼠巨噬细胞MCP-1的表达和分泌上调。