聚乙二醇修饰重人白细胞介素—2及其生物学特性

采用聚乙二醇活性酯化学修饰重组人白细胞介素－２及修饰后复性制得修饰产物ＰＥＧ－ｒＩＬ－２，ＰＥＧ－ｒＩＬ－２系列研究，经ＳＤＳ－Ｐ；ＡＧＥ和ＣＴＬＬ－２短期细胞２培养结合＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定，ＰＥＧ－ｒＩＬ－２分子量为２５ｋＤ，生物活性保留６９．７％；采用ＬＤＨ释放法测定证实ＰＥＧ－ｒＩＬ－２激活的ＬＡＫ细胞对人体肝癌细胞ＢＥＬ－７４０２和Ｋ５６２细胞的杀伤作用和ｒＩＬ－２相近甚至强于ｋＩＬ－     

聚乙二醇化重组人白细胞介素-6药效研究

目的探讨体内外不同修饰度的聚乙二醇(PEG)化重组人白细胞介素-6(rhIL-6)的药效。方法以相对分子质量20000的PEG2-NHS修饰剂化学耦合修饰rhIL-6,利用毛细管电泳仪分离得单修饰PEG-rhIL-6(mono-PEG-rhIL-6)和双修饰PEG-rhIL-6(di-PEG-rhIL-6),采用标准方法(即7TD1细胞/MTT比色法)测定体外IL-6的生物学活性,参考品为已标定的rhIL-6。体内实验:小鼠腹腔注射环磷酰胺构建BALB/c小鼠模型,分为模型组、阳性对照组、mono-PEG-rhIL-6高剂量组、mono-PEG-rhIL-6低剂量组、di-PEG-rhIL-6高剂量组和di-PEG-rhIL-6低剂量组。各组按上述剂量1次/d皮下注射给药,连续5d,于给药的第3天各组小鼠同时腹腔注射环磷酰胺,每日1次,连续3d。于给药的第8、11、14、17天切尾采血测定各小鼠血小板数并进行统计学处理。结果体外生物活性检测表明,mono-PEG-rhIL-6与di-PEG-rhIL-6相差不大,均比rhIL-6低10倍;体内活性测定表明,阳性对照组、mono-PEG-rhIL-6和di-PEG-rhIL-6的高、低剂量组小鼠血小板数回升速度较同时期模型组快,它们之间的差异具有统计学意义(P0.05)。结论 PEG单修饰和多修饰(≥2)的rhIL-6在体外均具有促7TD1细胞增殖的活性;在体内均具有抗环磷酰胺致小鼠血小板减少的作用。mono-PEG-rhIL-6和di-PEG-rhIL-6均是药物的主要成分。     

白细胞介素2快速诱导人LAK细胞的实验研究

本文采用~(125)IUdR释放法测定了大剂量白细胞介素2(IL-2)体外短期诱导人脐血,正常人、良性瘤及恶性瘤病人外周血淋巴细胞的抗肿瘤活性,发现四种来源的淋巴细胞在大剂量IL-3作用15分钟时均可诱导出一定水平的LAK活性,最适IL-2用量为6×10~3u/1.2×10~7细胞/ml,最适体外培养时间为3天。     

聚乙二醇修饰鼠抗人CD3单克隆抗体

目的:确定一条聚乙二醇化鼠抗人CD3单克隆抗体(mAb)和抗体片段的制备工艺路线.方法:以胃蛋白酶酶解并通过凝胶柱分离和纯化得到抗体Fab′, 利用PEG-SPA修饰抗体和抗体片段Fab′上的氨基, 通过体内和体外T细胞增殖实验, 考查修饰后的抗体和抗体片段的免疫活性.结果:较佳的修饰工艺条件为:在pH9.0硼酸缓冲液, 反应温度25℃, 抗体浓度0.2 g/L, 抗体和聚乙二醇摩尔比为1∶ 20, 反应3 h.修饰后抗CD3 mAb全抗, 对T淋巴细胞增殖抑制活性下降了32.3%, 抗体Fab′下降了8.0%, PEG化Fab′下降了19.9%.利用ELISA检测血液中修饰后的抗体和抗体片段的半衰期.结果显示mPEG修饰后抗体和抗体片段血药浓度降低明显减缓, 修饰后抗CD3抗体半衰期从2.66 h延长到8.72 h, 延长了3.28倍.而修饰后抗体Fab′片段半衰期从2.21 h延长到4.17 h, 延长了1.90倍.结论:利用聚乙二醇修饰抗体和抗体片段, 提高了抗体半衰期, 且无细胞毒性, 活性损失较小, 该技术具有较高的可行性, 可极大地提高mAb尤其是非人源性抗体在临床上的应用.     

重组白细胞介素－2（rIL－2）的免疫放射分析及人体药代动力学研究

用免疫放射分析（ＩＲＭＡ）检测接受白细胞介素－２（ｒＩＬ－２）治疗的肿瘤病人血清标本中ＩＬ－２活性。该法采用双抗体夹心模式，灵敏度＜２．１Ｕ／ｍｌ，（２９０ｎｇ／ｍｌ），平均批内和批间变异系数分别为１．９８％和５．２７％，方法特异、灵敏、快速。用此法检测两组皮下注射不同剂量ｒＩＬ－２的１６例本院肿瘤病人血清浓度，并对部分病例进行药代动力学研究，其血药浓度变化曲线属二室模型。消除半衰期（ｔ１／２β）为１８ｈ，达峰时间为２．５ｈ。     

人白细胞介素4诱导杀伤细胞的研究

人重组白细胞介素４（ｒｈＩＬ－４）在ＰＨＡ协同下，从人外周血单核细胞（ＰＢＭＣ）诱导出明显的ＬＡＫ活性，其对Ｋ５６２、Ｒａｊｉ细胞的杀伤力低于ＩＬ－２诱导者，对ＴＢＬ－Ｅ，ＰＨＡ活化的淋巴母细胞（ＰＨＡ－ｂｌａｓｔｓ）的杀伤力和ＩＬ－２诱导者相似。在ＰＨＡ介导的４小时５１Ｃｒ杀伤试验中，加入ＰＨＡ后，ＩＬ－４－ＬＡＫ对ＰＨＡ－ｂｌａｓｔｓ的杀伤力提高２．３倍，而ＩＬ－２－ＬＡＫ对ＰＨＡ－ｂｌａｓｔｓ的杀伤力无变化，提示ＩＬ－４主要诱导ＣＴＬ样活性，而ＩＬ－２主要诱导ＮＫ样活性，ＩＬ－４诱导效应ＣＴＬ的能力强于ＩＬ－２。我们的实验同时证实，在淋巴细胞活化的早期，ＩＬ－４抑制ＩＬ－２诱导的ＬＡＫ活性，淋巴细胞活化后，ＩＬ－４与ＩＬ－２有协同作用，增强ＩＬ－２诱导的ＬＡＫ活性。     

重组牛白细胞介素—2的高效表达及其生物学活性的测定

以ＰＣＲ方法扩增重组牛白细胞介素２基因，获得带有ＡＴＧ的完整牛白细胞介素２基因片段。以ｐＢＶ２２０为表达质粒，成功地构建了重组牛白细胞介素２的高效表达载体ｐＢＶｍＢｏＩＬ２，并转入Ｅ．ｃｏｌｉ。诱导表达结果表明，表达的重组牛白细胞介素２占总菌体蛋白的２２％以上，比原来提高２倍。活性测定结果表明，表达的重组牛白细胞介素２具有极显著的体外增殖活化淋巴细胞的活性，重组牛白细胞介素２的分子量约为１５４８８。     

重组人白细胞介素-10诱导瘤细胞凋亡

目的 研究重组人白细胞介素-10诱导瘤细胞凋亡的作用。方法利用基因工程技术制备的rhIL-10,分别作用于体外培养的ScaBer、NCIS446、U937瘤细胞,观察瘤细胞的形态改变,MTT法检测rhIL-10对瘤细胞增殖的抑制作用,电泳观察rhIL-10诱导瘤细胞凋亡的情况,TUNEL法检测瘤细胞凋亡百分率。结果电泳出现典型的DNA“lader”,ScaBe,、NCIS446、U937三种瘤细胞的凋亡率为48．5％、45．6％、47．1％,IC50分别为0．043、0．052、0．058mg／mL。结论rhIL-10具有显著抑制瘤细胞生长活性、诱导瘤细胞凋亡的作用。     

重组人白细胞介素18的纯化及其生物学活性研究

目的：纯化rhIL-18并对其生物学功能进行初步研究。方法：采用优化的包涵体提取技术和Sephacryl S-200分子筛层析纯化rhIL-18,利用MTT染色法研究rhIL-18对NK细胞促杀伤作用和对外周血单个核细胞（PBMC）的促增殖作用,采用半定量RT－PCR方法研究rhIL-18诱导IFN－γ基因的表达情况。结果：得到纯度达96％的纯品rhIL-18,复性的rhIL-8可以明显地促进PBMC增殖,增强NK细胞细胞毒活性。结论：得到纯度较高、具有较好生物学功能的rhIL-18,可用于进一步的研究。     

白细胞介素-2及其受体与肿瘤基因治疗

作为最重要的细胞因子之一,白细胞介素-2(IL-2)抗瘤作用的研究一直引导着肿瘤生物免疫治疗的方向。本文从分子生物学和细胞生物学角度介绍IL-2的结构、激活信号系统、功能活性、各免疫细胞的IL-2分泌动力学特点;IL-2受体亚单位组成、表达调控、功能意义及在不同细胞中的表达状况;IL-2基因转导接种疗法的基本方法、作用原理、主要优点、近年获得的实验与临床研究数据、以及待解决的问题等。     

重组人IL-2在E.coli中的高效表达诱导因素及其纯化的研究

表达人IL-2的E.coli pETI-2/MM294在色氨酸饥饿的培养基中发酵,加入一定量的3—吲哚乙酸诱导其trp启动子,可以使rlL-2的表达量高达总菌体蛋白量的19％。高水平表达的rlL-2以不溶性的包含体形式存在于E.coli的胞浆中。通过破碎细菌、变性抽提和使rlL-2复性后,再经CM-SephadexC-50、DEAE-SephadexA-50、SephadexG-75等一系列层析步骤纯化,最终得到的rlL-2纯度达90％以上,比活性为7.21×10~5μ/mg,总回收率为10.5％。     

人白细胞介素2基因修饰诱导的肥大细胞瘤细胞广泛调亡

为研究基因修饰的Ｐ８１５小鼠肥大细胞瘤细胞在肿瘤排斥中的作用，我们将人白细胞介－２基因修饰的Ｐ８１５小鼠肥大细胞瘤细胞接种ＤＢＡ／２小鼠，观察到动物成瘤的伏期延长，肿瘤的生长速度延缓，已形成的肿瘤可逐渐缩小并全部消退。     

白细胞介素-27及其受体的结构与生物学作用

IL-27是由p28和EBI3组成的异二聚体,主要由抗原提呈细胞产生;IL-27R由WSX-1/TCCR和gp130组成。IL-27具有多种生物学作用,能促进T细胞尤其初始CD4T细胞增殖,向Th1细胞方向分化产生IFN-γ,具有诱导Th1反应促炎性作用和减轻炎性反应双重作用,同时在抗肿瘤免疫方面也发挥重要作用。     

白细胞介素-2对心肌β-肾上腺素受体作用的调制

目的：研究生理浓度白细胞介素-2（IL-2）对β-肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素（ISO）心肌细胞效应的调制作用及其信号途径。方法： 采用酶解分离的成鼠心室肌细胞模型，用视频跟踪系统测定单个心室肌细胞的收缩幅度、最大收缩速度和最大舒张速度（±dL/dtmax）；以Fura-2/AM为钙探针，用细胞内双波长钙荧光系统检测心肌［Ca2+］i的变化。结果： ① ISO显著增加心肌细胞的收缩幅度和±dL/dtmax，2×103 U/L的IL-2预处理15 min对心肌细胞的收缩没有影响，但是使心肌细胞对ISO的反应明显降低；② ISO浓度依赖性地增加心肌细胞的钙瞬态值，EC50为（0.12±0.01）μmol/L。2×103U/L的IL-2预处理15 min对心肌细胞的钙瞬态值没有影响，但是使心肌细胞对ISO的反应曲线显著降低，EC50为（0.44±0.06）μmol/L；③ 20 mg/L CTX预处理12 h可显著增加心肌细胞的钙瞬态值，2×103 U/L 的IL-2处理5 min可显著降低钙瞬态值；④ Forskolin显著增加单个心肌细胞的钙瞬态值，IL-2 2×103 U/L预处理15 min后，forskolin增加钙瞬态值的最大效应降低。结论： 生理浓度的IL-2 (2×103 U/L)能够显著抑制ISO对单个分离心肌细胞的正性肌力作用和钙瞬态值增高作用。IL-2的调制作用可能是通过抑制Gs蛋白，降低AC的活性来实现的。     

稳定表达人白细胞介素2肝干细胞系的建立

目的:通过逆转录病毒介导,建立能稳定高效表达白介素2的肝干细胞WB-F344。方法:构建逆转录病毒载体Plpcx-IL-2质粒,转染包装细胞PT67,收集细胞培养上清,检测病毒的滴度。将高滴度的PT67/Plpcx-IL-2病毒液感染肝干细胞WB-F344,用嘌呤霉素加压筛选出抗性克隆,并用RT-PCR、间接免疫荧光实验、免疫组化实验和Western blot实验证实抗性细胞在转录水平和蛋白水平均有白介素2的表达情况。结果:成功构建含白介素2的逆转录病毒载体,获得滴度为105CFU/ml的感染性病毒液。建立的细胞系在转录水平和蛋白水平均有白介素2的表达。结论:成功建立了稳定表达人白细胞介素2的肝干细胞系WB-F344/Plpcx-IL-2,为下一步开展研究以肝干细胞为载体肝癌免疫基因治疗奠定了基础。     

重组IL-2激活的胎儿肝脾细胞LAK样活性

本研究证明,胎儿肝脾细胞经重组IL-2作用96小时,可产生显著的LAK样活性,在重组IL-2 1000u/ml,E:T为100:1其杀伤率分别达60%和62%。如果这一体外试验结果在体内应用中得到证实,无疑将给临床获取LAK细胞提供一条新的途径。