嗅鞘细胞的培养纯化及形态学特征

目的　建立体外培养纯化嗅鞘细胞 (Olfactoryensheathingcells,OECs)的模型 ,观察OECs生长状态和形态学变化 ,为研究神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法　以原代培养的方法分离、培养成年大鼠嗅球OECs,再用阿糖胞苷抑制 ,P75抗体吸附方法纯化及Forskolin和牛垂体提取液 (bovinepituitaryextract,BPE)营养物质综合作用。根据P75免疫组化学染色结果统计所得OECs的纯度 ,同时对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果　 (1)此纯化方法所得的OECs纯度可达 95 %以上 ,细胞增殖速度较快 ,且细胞纯度不因培养时间的延长而明显下降。 (2 )未纯化前细胞形态多变 ,主要为巨噬细胞状、双极和多极状 ;纯化后 2～ 4天 ,OECs多呈双极或多极状 ;突起短小 ;4天后 ,OECs以突起细长的双极和三极为主 ,细胞走向一致 ,呈平行排列。结论　P75抗体吸附方法纯化效率高 ,Forskolin和BPE能够促进细胞的增殖 ,并影响细胞的形态及排布     

经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞

目的:采用经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞(OECs),以探求更加简单、高效的嗅黏膜OECs取材和培养纯化方法.方法:成年雄性SD大鼠6只,采用经改良的方法剥取嗅黏膜,然后用改良差速贴壁法培养纯化嗅黏膜OECs.倒置相差显微镜下观察细胞生长情况以及形态并照相,培养7 d、14 d细胞行NGFRp75免疫细胞化学染色鉴定,并根据免疫细胞化学染色结果计算细胞纯度.结果:体外培养的嗅黏膜OECs形态主要有扁圆形或油煎蛋形、梭形或双极、多突起形.嗅黏膜OECs NGFRp75免疫细胞化学染色阳性.培养7 d嗅黏膜OECs纯度为90%,培养14 d嗅黏膜OECs纯度为85%.嗅黏膜OECs最长可以存活35 d.结论:经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜OECs具有简单、高效的优点,培养的嗅黏膜OECs的纯度完全可以达到细胞移植的要求.     

嗅鞘细胞移植对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的影响

目的:探索嗅鞘细胞移植实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠的移植途径、可行的移植时间窗,移植后的迁移特性以及发挥保护作用的可能机制。方法:分别采用豚鼠脊髓匀浆(GPSCH)与MOGIgd融合蛋白免疫Lewis大鼠,制作EAE模型;每组发病大鼠分别归入:MOG组和GPSCH组。MOG组分为:OECs空白对照组(MOG0组)4只、OECs尾静脉移植组(MOG1组)7只、OECs侧脑室移植组(MOG2组)4只;GPSCH组分为:OECs空白对照组(GPSCH0组)4只、OECs尾静脉移植组(GPSCH1组)4只。发病高峰期,按照实验分组,分别采用立体定向侧脑室细胞移植和尾静脉细胞移植,观察移植后大鼠的临床症状;移植后2周观察OECs在大鼠体内的分布情况及组织病理学方面的缓解情况。结果:OECs分别经尾静脉、侧脑室移植后,EAE大鼠症状改善,与空白对照组神经功能评分峰差值比较有显著差异(F=18.470,P0.01;t=-7.147,P0.01),MOG1组和MOG2组评分峰差值间无显著差异(P0.05);Hoechst33342示踪证实了OECs能在大鼠体内存活及强大的迁移能力;OECs经尾静脉移植后,可以透过破坏的血脑屏障进入脑内,分布于软脑膜和病灶周围;经侧脑室移植的嗅鞘细胞,向病灶局部广泛迁移;组织病理学评分(HE染色和Luxol fast blue髓鞘染色),移植组与未移植组间无显著差异(P0.05),2种途径移植组间亦无显著差异(P0.05)。结论:纯化培养的成年大鼠嗅球嗅鞘细胞分别经尾静脉和侧脑室移植EAE大鼠,均可缓解发病大鼠的症状。     

两种不同纯度的嗅鞘细胞在体外存活与生长的比较

比较80%和50%两种纯度的嗅鞘细胞在体外培养条件下的存活与生长,为嗅鞘细胞体内移植选用最佳纯度提供依据。分离、培养并纯化成年SD大鼠嗅鞘细胞,将纯化的嗅鞘细胞和收集到的贴壁成纤维细胞进行约80%和50%的比例混合后接种,继续培养1d或3d。所有细胞于不同时间点行P75免疫细胞化学荧光染色,以鉴定嗅鞘细胞的初始及其后培养过程中数量和纯度的变化。观察细胞状态,计数细胞总数和P75免疫阳性细胞数目,求得各组嗅鞘细胞数量和纯度并行统计学分析。结果显示:两种不同纯度嗅鞘细胞在培养1d时形态正常,3d时纯度为50%的嗅鞘细胞胞体依然饱满,突起更加纤长,数量和纯度亦无明显下降。而纯度为80%的嗅鞘细胞在培养3d时已出现胞体萎缩和突起变短,数量从1d时每一观察区域内的35±13显著下降为23±5(P=0.02),但纯度未发生明显变化。结果表明50%纯度嗅鞘细胞的存活及生长状态优于80%者,提示细胞体内移植时应考虑选取50%纯度的嗅鞘细胞。     

S100β对炎症条件下嗅鞘细胞的作用及机制

目的:明确S100β对干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)诱导的炎症条件下嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)的作用,并探讨其发挥作用的机制。方法:将采用改良差速贴壁联合胰酶限时消化3 min法纯化培养的大鼠OECs分为空白对照组、炎症模型组、S100β组等3组,每组种板1×106/ml;空白对照组采用常规培养体系培养OECs,炎症模型组采用重组IFN-γ诱导炎症建立OECs体外炎症模型,S100β组在炎症模型组基础上加入S100β蛋白进行干预;采用免疫荧光染色进行OECs鉴定及纯度分析;利用MTT法检测OECs的增殖情况并筛选IFN-γ诱导OECs炎症模型的适宜浓度;利用TUNEL染色法判断各组OECs的凋亡状况;采用Real-Time PCR检测各组OECs表达炎症相关因子i NOS、IL-1β、TNF-α的mRNA水平。根据以上结果,判断在炎症环境中S100β对OECs的影响及可能机制。结果:采用改良方法原代培养的大鼠OECs能够获得80%纯度;与5 ng/ml的浓度相比,10 ng/ml的IFN-γ对OECs的抑制率更高,凋亡细胞更多;与炎症模型组比较,S100β干预组细胞增殖能力升高,凋亡细胞减少;炎症相关因子i NOS、IL-1β以及TNF-α的基因表达水平下降。结论:S100β可以下调IFN-γ激活的炎症因子i NOS、IL-1β和TNF-α的基因表达水平,提示S100β可能是通过抑制炎症因子的表达从而减少了OECs凋亡的发生。本研究结果为深入研究S100β联合嗅鞘细胞移植对周围神经损伤的修复作用奠定了基础。     

实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠嗅鞘细胞移植排斥反应研究

目的研究嗅鞘细胞(OECs)的免疫原性及移植实验性免疫性脑脊髓炎(EAE)后颈淋巴系统的反应。方法用新生ICR小鼠嗅球培养出OECs,流式细胞术(FCM)检测其表面主要组织相容性抗原I、II类(MHC-I、MHC-II)诱导型和组成型表达情况。将经荧光染料CFSE标记OECs悬液或PBS注入EAE发病大鼠,收集注射7d后颈部淋细胞,FCM检测CFSE+、抗原提呈细胞标志物CD83+及CFSE+CD83+的表达率,混合淋巴细胞培养检测淋巴细胞增殖率(PI)。结果 OECs组成型表达少量MHC-I分子但几乎不表达MHC-II分子,但能在IFN-γ作用下能显著上调这二类分子。移植实验显示移植OECs的EAE大鼠颈部淋巴结中CD83+、CFSE+及CD83+CFSE+检出率及OECs诱导的PI值均高于对照组或正常大鼠(P<0.05)。同时,PBS注射的EAE大鼠,较正常大鼠亦有较高的CD83+检出率及PI值(P<0.05)。结论 OECs组成型或诱导型表达的MHC分子提示OECs有一定免疫原性,移植后局部淋巴系统可出现针对OECs的抗原引流、提呈及T细胞的活化,进一步分析提示这种免疫反应的启动依赖于EAE的炎性环境。     

多肽自组装纳米纤维凝胶与大鼠嗅鞘细胞相容性的实验研究

为了研究自组装纳米纤维凝胶材料异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)多肽与大鼠嗅鞘细胞(OECs)的生物相容性。将培养纯化的大鼠OECs种植于自组装制成IKVAV多肽纳米纤维凝胶表面(二维培养)和纤维凝胶内部(三维培养),倒置显微镜和免疫荧光镜下观察OECs的黏附、增殖情况,并采用MTT法和S-100阳性细胞计数、胞体面积、细胞周长的图像处理和统计分析检测支架对细胞的毒性来评价细胞的活力。OECs接种到IKVAV凝胶后,大多数OECs能在凝胶中生长良好,MTT检测及荧光显微镜下观察OECs的数目、周长与面积与多聚赖氨酸(PLL)组无显著性差异。证实自组装IKVAV多肽纳米纤维凝胶与大鼠OECs有良好的生物相容性。     

嗅鞘细胞在含Schwann细胞冻融周围神经移植物内的存活及对成年大鼠视神经再生的影响

为了研究嗅鞘细胞(OECs)在含Schwann细胞(SCs)及预先溃变的冻融周围神经内的存活及对成年大鼠视神经再生的影响,我们将30只动物左视神经眶内断端分别移植冻融周围神经、预溃冻融周围神经、含OECs预溃冻融周围神经、含SCs冻融周围神经或含OECs和SCs冻融周围神经,4周后观察OECs在神经移植物中的存活和分布,计数各组以5%荧光金逆行标记的再生RGCs数量。结果显示,OECs仅存活于含SCs冻融周围神经移植物内,含OECs-SCs冻融周围神经组及含SCs冻融周围神经组视网膜内可见荧光金标记的RGCs,前组再生RGCs均数(346±42)较后组(205±59)显著增高(P<0.05)。这些结果提示预溃冻融周围神经不适宜OECs生存。OECs在含有SCs的冻融周围神经移植物中能够存活,并发挥较单用SCs更强的促进视神经再生的作用。     

不同来源嗅鞘细胞的生长特性和生物学活性观察

目的探讨来源于乳鼠嗅球与成年大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞（OECs）生长特性和生物学活性的区别，为临床应用不同来源OECs提供理论支持。方法选取成年SD大鼠嗅粘膜和乳鼠嗅球的OECs，通过原代培养，在不同时间观察细胞形态和生长趋势，测定培养细胞上清中神经营养因子一Ⅲ（NT-3）的含量。结果培养出相应OECs，同时期源自乳鼠嗅球OECs细胞活性高于嗅粘膜OECs，进入平台期后二者生物学活性一致。结论不同来源的OECs生长特性有差别，但其生物学活性一致。     

新生大鼠嗅鞘细胞的改良培养方法研究

目的:探讨新生大鼠嗅鞘细胞的分离、培养和纯化方法。方法:取2 d内的新生大鼠嗅球组织,在解剖显微镜下分离取材,原代培养嗅鞘细胞,运用差速贴壁法和差速贴壁+阿糖胞苷+细胞生长刺激因子法两种方法进行纯化,在倒置显微镜下观察不同培养时间嗅鞘细胞的形态、数量和NGFRp75抗体免疫荧光结果,统计嗅鞘细胞的纯度。结果:嗅鞘细胞的纯度分别是差速贴壁组平均为60.41%±4.32%,差速贴壁+阿糖胞苷+细胞生长刺激因子法组平均为84.98%±4.03%。两组数据用t检验进行统计学分析,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:取材于新生大鼠;显微镜下分离脑膜;差速贴壁+阿糖胞苷+细胞生长刺激因子法纯化,都是良好的嗅鞘细胞培养方法。     

奥氮平对鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡的保护作用

探讨非典型抗精神病药物奥氮平对鱼藤酮诱导神经元凋亡的可能保护作用及其机制。以NGF诱导后的PC12细胞作为细胞模型,采用鱼藤酮诱导细胞凋亡。用不同浓度奥氮平、氟哌啶醇预处理后,观察鱼藤酮对PC12细胞的作用,分别用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性、流式细胞仪检测细胞凋亡率、Hoechst33342染色观察细胞形态学改变,并对二者的结果进行比较。鱼藤酮以剂量依赖的方式杀死PC12细胞。鱼藤酮(6μmol/L)作用后,奥氮平(50μmol/L)组预处理48h的细胞活力显著高于对照组(无药物预处理)(P<0.05);鱼藤酮(4、6、8μmol/L)作用后,氟哌啶醇组(20、40、60μmol/L)的细胞活力均低于对照组。流式细胞仪检测结果显示,对照组、氟哌啶醇(20μmol/L)组、奥氮平(50μmol/L)组、空白对照组(无药物预处理以及鱼藤酮处理)的细胞凋亡率依次为(32.2±1.3)%、(42.1±1.0)%、(14.0±1.0)%和(1.3±0.3)%。Hoechst33342染色结果显示,对照组每个视野多见凋亡细胞,细胞核裂解为碎块,氟哌啶醇组更明显;奥氮平组凋亡细胞数量较氟哌啶醇组及对照组为少。结果提示奥氮平对鱼藤酮诱导PC12细胞的凋亡具有保护作用,这可能是奥氮平和氟哌啶醇在精神分裂症病人应用中有不同的治疗效果和副作用的部分机制。     

胰岛素样生长因子1对β样淀粉蛋白引起的神经元凋亡和tau蛋白磷酸化的作用(英文)

本研究的目的是阐明胰岛素样生长因子1(IGF-1)对β样淀粉蛋白(Aβ)引起的神经元凋亡的保护作用,以及tau蛋白磷酸化的作用。用MTT(四甲基偶氮唑盐)方法检测细胞活性,用流式细胞学结合Annexin V-FITC和PI(碘化丙锭)双染的方法检测早期凋亡和晚期凋亡/坏死,用Hoechst 33342染色观察凋亡细胞形态学,用免疫细胞化学的方法检测tau蛋白磷酸化。IGF-1阻止了Aβ25-35引起的培养的大鼠海马神经元的毒性,MTT值显著增加,从54.51%增至61.8%,Hoechst 33342阳性细胞的百分比从30.77%减少到22.81%。Aβ25-35孵育使Annexin V单标记细胞(Annexin V+/PI-)以及Annexin V/PI双标记细胞(An-nexin V+/PI +)的百分比显著增加(分别为3.41%和19.47%),应用100 ng/ml的IGF-1可显著减少Annexin V单标记细胞和Annexin V/PI双标记细胞的百分比分别至2.98%和15.16%。Aβ25-35可增加tau蛋白磷酸化,AT8阳性细胞占41.84%,而IGF-1则可抑制这一效应。我们的结果表明IGF-1可保护神经元,降低Aβ的细胞毒性,减少早期和晚期凋亡/坏死细胞的比例,抑制tau蛋白磷酸化,这可能是IGF-1神经保护作用的细胞机制。     

成年大鼠嗅球成鞘细胞的原代培养

本实验取材于成年 Wistar大鼠嗅球的最外两层 ,进行原代培养嗅球成鞘细胞 ,用胶质纤维酸性蛋白抗体免疫组化方法确认。结果显示 :( 1)培养至第 10 d,原代培养物多见两种形态的细胞 :一种为单极、双极或多极细胞 ,带有细长的突起 ;另一种为所谓“煎蛋样”细胞 ,扁平状 ,胞质少极化 ,边缘不规则 ;( 2 )胶质纤维酸性蛋白反应显示这两种细胞均呈阳性 ,Nissl法复染后 ,可计数其纯度为 70 %～ 85 %。     

绿茶多酚主要成分对百草枯诱导PC12细胞损伤的保护作用

探讨绿茶多酚的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate,EGCG]对百草枯(paraquat,PQ)诱导的PC12细胞损伤的影响及可能机制。建立PQ损伤的PC12细胞体外模型,经不同浓度EGCG预处理后,分别用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞活性,Hochest33258染色观察凋亡时细胞核形态的变化,流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡比例,免疫细胞化学染色观察细胞色素c蛋白表达水平。1、5、10μmol/LEGCG对PQ诱导的PC12细胞损伤具有一定的保护作用。与PQ组(54.6±3.5%)相比,1、5、10μmol/LEGCG预处理组细胞活力分别上升为66.5±2.7%、74.4±2.6%、83.7±3.2%。Ho-chest33258染色发现PQ组较多胞核出现固缩凝集(43.5±8.4%),而EGCG预处理组则较少(分别为30.7±7.9%、17.9±6.8%、11.2±4.4%)。FCM检测也提示EGCG预处理可降低细胞的凋亡百分率,正常组、PQ组、EGCG预处理组(1、5、10μmol/L)分别为4%、39.9%、32.6%、20.1%和10.4%。另外,免疫细胞化学染色发现EGCG预处理可下调PQ诱导的细胞色素c在胞浆中的过表达。以上结果提示EGCG可减轻PQ诱导的PC12细胞损伤,其机制可能与下调细胞色素c在胞浆内的过表达有关。     

不同保存方式下嗅鞘细胞的活性

背景：获取和寻找适合的保存方式对嗅鞘细胞实验和临床应用有重要的意义。 目的：探索合适的嗅鞘细胞低温保存方式。 方法：取对数期生长的嗅鞘细胞,冻存1,3,6个月进行复苏。 结果与结论：MTT比色法及锥虫蓝染色显示5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉处理的细胞活性最高,其次是10%二甲基亚砜处理的细胞,5%二甲基亚砜的保护作用最差。冰箱降温或程控降温仪降温方式及不同的冻存时间对嗅鞘细胞活性影响不明显。因此,推荐用5%二甲基亚砜-6%羟乙基淀粉作为嗅鞘细胞冻存低温保护剂。     

人胚嗅球嗅鞘细胞原代培养的实验研究

目的拟建立人胚胎嗅球嗅鞘细胞的培养方法并探讨这些细胞在活性、纯度方面是否具备临床应用水平。方法用含有促进细胞生长的谷氨酰胺、转铁蛋白、生物素、硒酸纳的无血清纯化液纯化嗅鞘细胞,胰蛋白酶消化收集细胞,制成单细胞悬液。采用台盼蓝染色法进行活性测定,P75NGFR和S-100双标免疫荧光染色鉴定,以Hoechst复染鉴定OECs的纯度。结果可见比较典型的嗅鞘细胞:双极或梭形、多突起形和扁圆形,主要以梭形和多突起形细胞为主。细胞活性大于95%,纯度大于90%。结论实验建立的人胚胎嗅球嗅鞘细胞原代培养的方法可行,细胞活性大于95%,纯度和均一性已达到临床应用水平。     

嗅鞘细胞移植对大鼠脊髓半横断损伤后轴突再生及后肢功能恢复的作用

为了对嗅鞘细胞移植治疗大鼠脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)后轴突再生及后肢功能恢复进行综合性的评价,本实验采用22只雌性成年SD大鼠,并随机分成A、B、C、D 4组。其中A、B、D组行左侧T11 ～T12节段脊髓半横断手术,然后A组移植嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)悬液;B组移植DMEM/F12培养液;D组移植核荧光试剂(Hoechst33342)标记的嗅鞘细胞,用于鉴定嗅鞘细胞在体内的存活情况;C组作为正常对照组。术后6周内,对大鼠进行BBB评分、IP斜板试验并观察皮质体感诱发电位(cortical somatosensory evoked potential, CSEP)、运动诱发电位(motor evoked potential, MEP)的潜伏期。将辣根过氧化物酶(HRP)注射到横断面尾段脊髓,逆行追踪观察横断面头段脊髓及对侧中脑红核内HRP逆标细胞数,并观察左侧后肢小腿三头肌肌细胞横截面积及直径的变化。结果显示:(1)移植后的OECs数量未见明显减少,细胞核形态较好,细胞未向头、尾侧迁移;(2)移植3周后BBB评分及IP斜板,试验A、B组较C组明显低(P<0.05),但A组明显高于B组(P<0.05);(3)A、B组的CSEP及MEP潜伏期较C组明显延长(P<0.05),但A组要比B组明显缩短(P<0.05);(4)HRP逆行追踪观察到对侧中脑红核大细胞区及脊髓T9 ～T11节段逆标细胞的数量,A组明显多于B组,但A、B组均少于C组;(5)左侧后肢小腿三头肌肌细胞的横截面积及直径,A、B组均较C组减少,但A组减小的幅度明显小于B组。以上结果表明OECs移植能促进半横断脊髓轴突的再生及后肢功能的恢复。     

不同pH值水平下脂肪间充质干细胞的存活和增殖

背景：在退变的椎间盘内,pH值的下降对脂肪间充质干细胞有很大影响。 目的：在不同的pH值条件下体外培养脂肪间充质干细胞,观察其增殖及生存情况。 方法：分离兔脂肪间充质干细胞,在分别在pH 7.4,7.1,6.8,6.5条件下培养5 d后用锥虫蓝染色检测各组的细胞存活率,采用MTT法绘制细胞生长曲线。 结果与结论：相比其他3组,pH 6.5条件下脂肪间充质干细胞存活率最低(P < 0.05),其细胞生长速度持续减慢。结果证实,pH 6.5的酸度培养条件可抑制脂肪间充质干细胞的活力和增殖。