啤酒酵母鲨烯合酶基因的克隆及其基因表达载体的构建

[目的] 克隆啤酒酵母鲨烯合酶基因及构建其基因表达载体,为在微生物体内重建青蒿素合成途径打下基础.[方法]采用聚合酶链反应(PCR)扩增、扩增片段与T-载体连接和克隆片段的序列分析;酶切并回收目的基因,反向插入酵母表达载体pGAPZαA,双酶切鉴定重组子.[结果] 通过PCR扩增获得1 335 bp片段,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定.初步测序结果与GenBank上已登录的酵母鲨烯合酶基因序列基本吻合,相差仅数个碱基对;将此片段反向插入酵母表达载体pGAPZαA,构建了反义酵母表达载体,并通过双酶切加以鉴定.[结论] 成功克隆了啤酒酵母鲨烯合酶基因并进行了测序,同时构建了反义酵母表达载体.     

马兜铃酪氨酸脱羧酶基因克隆、测序及同源性分析

【目的】从中草药马兜铃中获得酪氨酸脱羧酶基因(tyrDC)互补DNA(cDNA)序列并进行同源性分析，以进一步达到敲除tyrDC，减轻该药肾毒性的目的。【方法】参照已知的植物酪氨酸脱羧酶的保守性氨基酸序列设计简并引物，并通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从马兜铃中扩增出cDNA片段。将扩增的cDNA序列克隆并测序，用以设计特异引物，并通过cDNA末端快速扩增(Rapid Ampli6cation of cDNA Ends，RACE)从马兜铃中扩增出全长tyrDC cCNA。【结果】该克隆的tyrDC cDNA的总长度为1678bp，包括一个编码516个氨基酸的1551bp开读框(ORF)和一段127bp的下游非翻译区(3’UTR)。序列比较结果表明，由马兜铃tyrDC核苷酸序列推导的氨基酸序列分别与已发布的罂粟酪氨酸脱羧酶和唐松草酪氨酸／多巴脱羧酶享有76％和79％的同源性。【结论】从马兜铃中扩增得到tyrDC cDNA全序列，且对酪氨酸脱羧酶的同源检索显示，不同植物的酪氨酸脱羧酶之间都存在普遍的序列相似性。为去除马兜铃肾毒性奠定了基础。     

人瘦素基因克隆与序列测定

【目的】构建人瘦素基因cDNA克隆 ,并进行序列分析。【方法】用逆转录聚合酶链反应扩增人瘦素基因cDNA ,获得片段 (6 40bp)连接至 pUC19载体 ,并转化大肠杆菌DH5α。以末端终止法进行序列测定。【结果】所克隆的人瘦素cDNA含全长的人瘦素基因编码区 ,仅 2 87位的腺苷酸被鸟苷酸代替 ,导致 96位编码谷氨酰胺的密码子CAA改变为编码精氨酸的CGA ,其意义尚待阐明。【结论】以逆转录聚合酶链反应方法成功地构建了人瘦素基因cDNA克隆。     

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的：克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10（CFP10）基因,并对其进行序列分析。方法：自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFPIO基因设计引物。通过聚合酶链反应（PCR）技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果：PCR产物电泳显示扩增片段约为300bp,测序获得的片段开放编码框由303bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100％,推导出编码氨基酸序列同源性为100％。结论：成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFPIO基因序列无差异。     

应用SEFA-PCR扩增刺五加内生青霉鲨烯合酶基因的旁邻序列

①目的 克隆刺五加内生青霉Penicillium minioluteum P116-1a鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因的旁邻序列.②方法 根据已经获得的P.minioluteum P116-1a SS DNA序列设计特异性性引物,采用SEFA-PCR(self-formed adaptor PCR)扩增其3'和5'末端未知序列.③结果 3'末端扩增获得长约5 000 bp的片段,5'末端扩增获得长约3 000bp的片段.④结论 首次应用SEFA-PCR技术扩增获得P.minioluteum P116-1a SS基因的末端序列,为进一步研究该基因对刺五加皂苷含量的作用机制奠定了基础.     

恶性疟原虫红内期SSUrRNA编码基因的克隆与序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株红内期小亚单位核糖体核糖核酸SSUrRNA编码基因(SSUrDNA)片段，并进行序列分析。方法根据献报道恶性疟原虫基因序列设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)方法从海南恶性疟患血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrDNA目的基因片段，纯化后与PUC19m-T质粒载体连接构建重组子，并导入大肠杆茵JM109；阳性克隆经双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列，并采用ExPASy Proteomicstools软件分析。结果 恶性疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为431bp；阳性克隆重组质粒作双酶切及PCR扩增均得到预期大小的基因片段；测定的SSUrDNA插入片段核酸序列与巴西恶性疟原虫IMTM／7G8相同基因序列对比。未发现碱基的插入或缺失去，同源性为99．3％；第353位碱基由C取代了G，第371位碱基由T取代了C，其余序列相同。结论 成功克隆了恶性疟原虫海南株红内期SSUrDNA基因片段，该序列在不同恶性疟原虫虫株间相对保守。     

C57BL／6小鼠ZFP580C端编码基因的克隆及序列分析

【目的】克隆C57BL／6小鼠ZFP580C端编码基因cDNA序列，并进行序列测定和分析。【方法】参照GENBANK公布的C57BL／6小鼠ZFP580eDNA序列（注册号为AK005257），根据ZFP580C端编码基因eDNA序列设计1对引物，采用RT-PCR技术，从C57BL／6小鼠的肾脏组织中扩增ZFP580C端编码基因eDNA序列，回收纯化后与T载体连接，构建重组子pMD18-T-ZFP580，转化大肠杆菌DH5a。阳性克隆以限制性酶切分析与PCR法鉴定后，测定序列并分析。【结果】自C57BL／6小鼠肾脏组织获得总RNA，扩增出255bp的基因片段，成功构建阳性克隆重组子pMD-T-ZFP580，经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致。所测定的C57BL／6小鼠ZFP580C端基因eDNA序列与13本RIKEN基因组中心于GENBANK注册（注册号为AK005257）的完全一致，与人ZNF580C端编码基因eDNA序列比较，核苷酸序列同源性为90％；该eDNA序列所编码的氨基酸序列与人ZNT580基因C端比较，同源性为100％，均编码有3个串联重复的C2H2型锌指蛋白主构域。其氨基酸序列与大鼠、犬、牛比较，同源性分别为100％、100％、98％。【结论】成功克隆C57BL／6小鼠ZFP580C端编码基因，该基因在不同种属间高度保守。     

恶性疟原虫肝期抗原1基因3′端的克隆及序列分析

【目的】克隆并测定恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)肝期抗原 1基因 (LSA 1) 3′端序列 ,比较FCC1/HN株与国外分离株LSA 13′端序列的差异。【方法】应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增LSA 13′端序列 ,用T A克隆法将其克隆入pMD18 T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后 ,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA 13′端序列的同源性分析。【结果】PCR扩增得到特异的FCC1/HNLSA 13′端序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的 pT LSA 1重组质粒。测序表明 ,所克隆的LSA 13′端大小为 795bp ,编码 2 6 4个氨基酸。序列分析表明 ,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的NF5 4、T9/ 96、KEN、PNG及BRA株LSA 13′端编码的氨基酸序列只在 3个位点存在不同。【结论】克隆了恶性疟原虫FCC1/HNLSA 13′端片段。序列测定及同源性分析表明 ,FCC1/HNLSA 13′端序列与其它分离株有高度的同源性。     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

间日疟原虫深圳株红内期SSUrDNA基因片段的克隆与序列分析

目的 体外扩增间日疟原虫深圳株红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因(SSUrDNA)片段，研究其结构与功能。方法 设计一对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)从间日疟原虫患者血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段，以PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列。结果 间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与Sal I株顺序相比，仅在第151位处缺失一个碱基C。结论 成功克隆了间日疟原虫SSUrDNA片段．该序列在间日疟原虫虫株间高度保守。     

抗精子抗体和抗子宫内膜抗体与不孕及流产的关系

目的　探讨抗精子抗体（ＡｓＡｂ）与抗子宫内膜抗体（ＥＭＡｂ）在不孕、流产中的作用及二者关系,进一步 揭示不孕、流产的病因。方法　采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）同时检测３４５例不孕、流产妇女血清中的ＡｓＡｂ与 ＥＭＡｂ,按ＡｓＡｂ检测结果分阳性组和阴性组,比较两组ＥＭＡｂ阳性率的差异。结果　原发不孕及自然流产妇女中, ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率高达１６．６７％和１９．５１％,而ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率高达４３．６４％和４２．８６％,显著高于 ＡｓＡｂ（－）组（Ｐ＜０．０１,Ｐ＜０．０５）。继发不孕妇女中ＡｓＡｂ（－）组ＥＭＡｂ阳性率为１８．１８％,ＡｓＡｂ（＋）组ＥＭＡｂ阳性率 为３２．２％,二者无显著性差异（０．０１＞Ｐ＞０．０５）。结论原发不孕及自然流产妇女中因个体免疫反应差异使某些 人易对体内、外物质发生免疫反应而产生抗体,从而导致不孕或流产。     

亚硝基脲类和亚硝基硫脲类的理化性质及致突变能力

本题选择N,N′-二甲基亚硝基脲(DMNU),N,N′-二乙基亚硝基脲(DENU),及其类似物N,N′-二甲基亚硝基硫脲(DMNTU)、N,N′-二乙基亚硝基硫脲(DENTU)为代表,测定了这些化合物的水解反应速度、脂溶性(HPLC的logk′值)、水解产物和致突变能力。证明了硫脲的脂溶性大于脲的脂溶性。DMNTU对TA100菌株的致突变能力最强,其它较弱。     

水疗联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响

目的探讨新生儿游泳联合抚触对新生儿的生长发育、黄疸及睡眠的影响。方法将经阴道顺产分娩的正常新生儿100例随机分为两组，观察组（水疗联合抚触组）50例，对照组（单纯沫浴组）50例。①测定两组10日、28日的体重、身长、上臂围；②观察记录胎便转黄时间，测定皿清胆红素；③记录24h睡眠时间。结果两组新生儿10日、28日体重、身长、上臂同增长有显著差异（P〈0．05），两组新生儿5日时，胎便转黄时间及黄疸指数比较均有显著性差异（P〈0．01），两组睡眠时间比较有统计学意义（P〈0．05），两组并发症比较无统计学意义（P〉0．05）。结论新生儿水疗联合抚触可促进新生儿的生长发育，能加速胎粪的早排出，减轻生理性黄疸程度，有效地降低新生儿高胆红素血症的发病率，提高睡眠质量。     

经络腧穴理论的形成与发展

从<脉书·十一脉><黄帝内经>等文献人手,梳理了血气、经络、腧穴理论的形成与发展,简要介绍了四肢部的基本腧穴、躯体部要穴,以及腧穴配伍的基本要义.     

心肾不交与基因/蛋白质失联之相关性及其临床意义

根据DNA与蛋白质相互作用原理,以及DNA-蛋白质与中医心肾关系的认识,通过分析中西医临床研究,发现中医"心肾不交"与"基因-蛋白质失联"有诸多吻合之处。认为两者相互印证、互补长短、相得益彰的深入研究,将会使中医交通心肾方法与方药得到更多的开发与推广应用。     

Exosomes与肾脏生理及疾病

胞外体（exosomes）是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外基质中直径30～100nm的膜性小囊泡,内含来源细胞的mRNA、miRNA和蛋白质等成分,能反映来源细胞的生物学信息,可能成为潜在的生物学标志物。Exosomes在信号转导、诱导机体抗肿瘤和免疫耐受等方面的作用是近年来研究的热点,并已成为一种新型治疗手段。尿液exosomes与肾脏生理功能及疾病之间有着密切的关系,但其研究尚处于初期阶段。文章就exosomes的生物学特性、生理功能、分离纯化及其在肾脏疾病方面的标志物作用和治疗价值的研究进展作一综述。     

大鼠/小鼠证候及辨证论治方法学的探索与发展

从大鼠/小鼠四诊和辨证方法的提出与创建,大鼠/小鼠计量化辨证方法的建立,荷瘤小鼠证候发生和演变的揭示,大鼠/小鼠异病同证、同病异证的研究,荷瘤小鼠个体化辨证论治及计量化疗效评价,以及不同证候荷瘤小鼠神经—内分泌—免疫网络基因转录与剪接的特征等方面,总结项目组长期以来所提出的系列假说及开展的大量研发工作,对所解决的学术问题,以及该领域存在问题、前沿和发展趋势做了评述。     

浅谈梅毒的流行与防治

本文报告了梅毒的流行、预防和各期的治疗及胎传梅毒的治疗。     

Hyperuricemia and gout among Taiwan Aborigines and Taiwanese-prevalence and risk factors

Gout is a metabolic disorder which normally undergoes 4 stages: hyperuricemia, acute gouty arthritis, an intercritical period, and final tophus. Priority associated with gout is hyperuricemia. Only 5%-10% of patients with hyperuricemia will develop gout. Indeed, the serum uric acid level is correlated with the prospects of gouty attack.1 Therefore, study of gout epidemiology should focus on the hyperuricemia of a community or ethnic population. Twenty-three million people live in Taiwan, among them, an ethnic minority of 330 000 native inhabitants (called "Aborigines"), who live mainly in high mountain areas. The rest are "ethnic Taiwanese", most of whom came from the southern Mainland Chinese provinces some 400 years ago. Some of the "ethnic Taiwanese" arrived from the central and northern areas of Mainland China 50 years ago. The languages, dietary habits and cultures of the Taiwanese and Aborigines are completely different.2     

疟疾知信行现状和影响因素

疟疾是世界范围内的重要公共卫生问题。疟疾相关知识、态度和行为的调查有助于了解当地居民对疾病的认知水平,为制定有效的防控措施提供重要依据。本文综述了疟疾相关知信行调查研究现状及其影响因素。