抗人B-淋巴细胞刺激因子噬菌体单链抗体库的构建

目的构建抗人B-淋巴细胞刺激因子噬菌体单链抗体库。方法从B-淋巴细胞刺激因子免疫小鼠的脾细胞中抽提总RNA,经逆转录聚合酶反应合成cDNA,分别扩增小鼠重链可变区基因和轻链可变区基因。通过重叠延伸拼接法将重链可变区基因和轻链可变区基因组装成单链抗体基因,重组于载体pFUSE5,电转化E.coliXL 1-Blue。在辅助噬菌体援救下,构建成噬菌体单链抗体库。采用聚合酶链反应、核苷酸序列测定和酶联免疫分析鉴定单链抗体库的特征。结果本抗体库的噬菌体库容量约1×106,单链抗体基因插入效率为93%,存在序列差异性并含有抗B-淋巴细胞刺激因子单链抗体。结论成功地构建了抗人B-淋巴细胞刺激因子单链噬菌体抗体库,为筛选抗B-淋巴细胞刺激因子单链抗体药物奠定了良好的基础。     

抗CCR7单链抗体的筛选及初步鉴定

目的从噬菌体抗体库中筛选抗CCR7单链融合抗体,并对其生物学特性进行初步检测。方法PCR检测大肠杆菌中ScFv基因插入率;琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;分别以乳腺癌细胞及CCR7多肽片段为靶抗原对抗体库进行4轮和3轮筛选富集。将阳性克隆转化E.coliHB2151进行可溶表达。抗体亲和层析纯化后,经Western blot鉴定,通过ELISA法检测可溶性ScFv抗体的免疫活性。免疫细胞化学和放射免疫显像鉴定scFv抗体与乳腺癌细胞结合的特异性。结果ScFv基因插入率为90%(18/20),双酶切鉴定检测到目的条带。经4轮细胞筛选,3轮抗原筛选抗CCR7抗原的噬菌体抗体得到了明显富集,在E.coliHB2151中实现可溶表达。Western blot结果显示获得抗体相对分子质量为34ku左右。免疫细胞化学检测与放射免疫显像均证实单链抗体与表达CCR7的乳腺癌细胞MDA-MB-435s特异性结合。结论成功从噬菌体抗体库中筛选获得具有较高特异性的抗CCR7单链抗体。抗体在体内体外均与肿瘤细胞表达特异抗原结合。     

抗人肝癌噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的构建抗人肝癌的噬菌体抗体库并对该库进行初步筛选。方法以RT-PCR法从经Bel7404细胞免疫的BALB／C小鼠脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白的Fd段及k链基因,克隆到表达载体pCOMB3H-SS中并将抗体Fab段表达于单链噬菌体表面,构建噬菌体抗体库;以Bel7404细胞为抗原对所建噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的亲和筛选。结果建成了容量为2×106cfu的噬菌体抗体库,在亲和筛选过程中,噬菌体收获率逐轮得到提高,第4轮为第一轮的246倍,含Fab基因的克隆比率也由25％增到83％,表明特异性噬菌体抗体得到了富集。结论噬菌体抗体库技术系高效筛选体系,为肿瘤单抗的制备提供了有效的新途径。     

人源抗BLyS单链抗体的筛选及其构建与表达

目的:从人源单链抗体库中筛选抗B细胞刺激因子(BLy S)的单链抗体基因、构建表达载体并实现单链抗体的表达。方法:以哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库为起始文库,通过流式细胞术进行分选,获得荧光强度最强、比例为0.1%的阳性细胞。从候选细胞中提取质粒并转化至DH5α中进行扩增,得到质粒转染293T细胞作为下一轮筛选所需的抗体库。经过依次降低抗原浓度进行了3轮分选得到2个候选的Sc Fv序列。经序列分析,选择其中一种单链抗体基因,利用基因工程技术构建分泌型表达质粒,转染293E细胞并通过镍亲和层析纯化获得B-10 Sc Fv抗体蛋白并通过Fortie Bio Octet QK进行亲和力分析。结果:经过3轮筛选获得了全新的抗BLy S Sc Fv抗体序列,成功构建并表达了anti-Bly S Sc Fv抗体蛋白,该单链抗体与的BLy S亲和常数为3.08 nmol·L-1。结论:从哺乳动物细胞展示型人源Sc Fv抗体库中成功获得了可结合BLy S的全新单链抗体基因序列,该单链抗体与BLy S具有较高的亲和力,这为后续的活性研究以及产品开发奠定了基础。     

食管癌人源噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选

目的构建全人源化食管癌噬菌体单链抗体库,从中筛选Eca-109细胞特异性单链抗体。方法取食管癌病人癌肿周围淋巴结作为B细胞的来源,提取总RNA,用RT-PCR的方法获得抗体可变区基因cDNA文库。首先分别网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对,以cDNA为模板扩增VH和VL基因片段,再以它们为模板分别扩增VH-linker与VL-linker,用SOE-PCR技术将后者组装成scFv,再引入酶切位点SfiI和NotI。将scFv基因克隆入噬菌粒载体pCANTAB-5E后电转入EcoliTG1,经抗体表达的辅助噬菌体M13KO7超感染,构建单链抗体库。PCR鉴定阳性重组菌EcoliTG1中scFv的插入率,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果。从该抗体库中筛选特异性识别Eca109细胞的单链抗体,将阳性克隆菌转化EcoliHB2151进行可溶性表达。抗体亲和层析纯化后经SDS-PAGE、West-ern blot鉴定,通过ELISA法、免疫组化法、免疫细胞化学鉴定其与人食管癌细胞的结合的特异性。结果食管癌周围淋巴结总RNA的提取琼脂糖电泳结果中可见清晰的28S、18S条带;VH基因的大小约为450bp,VL基因为350bp,组装后的scFv基因约为850bp。用pUC18标准质粒测定转化效率达到108cfu.μg-1。scFv的阳性插入率为91.7%(22/24)。在筛选过程中,食管癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第4轮为第1轮的141倍;SDS-PAGE与Western blot结果显示抗体分子量为30ku左右,在Ecoli HB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。免疫组织化学结果提示可溶性抗体仅食管癌组织着色,而肝癌、胃癌组织不染色。免疫细胞化学结果表明此可溶性抗体可使食管癌细胞Eca109染色。细胞ELISA测定结果显示可溶性抗体具有较高的特异性,能与Eca109细胞结合,而不与胃癌BGC-823和NHEEC结合。结论从食管癌病人癌肿周围淋巴结成功地构建人源食管癌噬菌体单链抗体库,并从中筛选到食管癌特异性抗体。     

人源Fab段噬菌体抗体库的构建及抗IL-4抗体的初步筛选

[摘要] 目的： 构建大容量人源Fab噬菌体抗体库及筛选特异性抗体 方法：采集18位成人外周血,分离淋巴细胞,细胞室培养淋巴细胞。提取总RNA,反转录成cDNA,用PCR扩增Fab段抗体基因,用试剂盒回收纯化抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源Fab噬菌体抗体库,用限制性内切酶鉴定基因的插入。用抗原IL-4对抗体库进行筛选。五轮筛选后,随机挑取30个单克隆用Phage ELISA和酶切进行检测。并且对阳性克隆DNA的序列进行测定。结果：构建的人源Fab噬菌体抗体库库容为2.4×108 ,酶切鉴定插入基因片段大小正确,ELISA鉴定阳性克隆有抗原结合活性。测序结果证实为为人免疫球蛋白可变区基因。结论：构建了大容量人源Fab噬菌体抗体库,从中筛选出抗IL-4人源Fab抗体,有望为获得其他抗体提供源泉,为疾病的诊断与治疗打下基础     

梭曼单链抗体的基因克隆和表达

成功地扩增了有机磷毒剂梭曼类似物１－羟基－１－对胺基苯基甲膦酸单频哪基醇酯与血蓝蛋白结合物免疫小鼠脾细胞中抗体重链和轻链基因片段，构建了单链抗体可变区基因（ＶＨ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＬＤＮＡ），并将该基因克隆到噬菌体表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ的外壳蛋白ｇ３ｐ基因中，使单链抗体以融合蛋白的形式在Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１中表达在噬菌体表面，构成噬菌体抗体库．通过免疫亲和淘洗和竞争抑制酶联免疫吸附测定法筛选，得到１２株克隆，其分泌的单链抗体与梭曼有结合活性．     

从噬菌体抗体库中筛选血管内皮细胞新型嘌呤受体功能抗体的研究

目的筛选鉴定血管内皮细胞新型嘌呤受体功能性抗体,为进一步研究新型嘌呤受体提供标志物。方法大鼠血管内皮细胞蛋白质免疫BALB/c小鼠,采用噬菌体抗体库技术构建小鼠抗大鼠血管内皮细胞的单链噬菌体抗体库。利用新型嘌呤受体在主动脉内皮细胞表达而在血管平滑肌细胞不表达的特点,先用主动脉内皮细胞进行阳性筛选,再用血管平滑肌细胞进行阴性筛选,从噬菌体抗体库中富集主动脉内皮细胞特异抗体。对筛选到的抗体经可溶性表达后,采用离体血管环功能试验,筛选新型嘌呤受体特异单链抗体。采用免疫组化实验对筛选到的抗体进行鉴定。结果经过4次免疫后,小鼠血清抗内皮细胞蛋白的IgG效价为1∶16000,通过噬菌体表面呈现,得到小鼠抗大鼠内皮细胞免疫噬菌体抗体库容量为8×106。4轮主动脉内皮细胞阳性筛选及大鼠血管平滑肌细胞阴性筛选富集到约2500株主动脉内皮细胞特异抗体,可溶性表达后,在离体血管环上,经过4轮的逐级淘筛得到一株影响腺苷诱发NO依赖性血管收缩反应的功能性抗体ScFv-B,其抑制率为83.4%±21.6%。免疫组化鉴定此抗体与内皮细胞特异结合,功能性鉴定此抗体对腺苷诱发的肠肌收缩反应无影响,初步认为此抗体是新型嘌呤受体特异性功能抗体。结论本研究通过噬菌体抗体库的构建及抗体筛选和鉴定,得到了新型嘌呤受体特异性功能抗体ScFv-B,为进一步采用表达文库筛选的方法克隆新型嘌呤受体基因提供了良好的工具。     

人源性肺癌噬菌体展示抗体库的构建

目的应用噬菌体展示技术,构建天然人源抗肺癌噬菌体抗体组合文库,筛选能与肺癌细胞特异结合的抗体。方法用RNA提取试剂盒提取淋巴细胞RNA,以Oligo DT为引物反转录合成cDNA,以半套式PCR扩增轻链和重链可变区抗体基因并重组到原核表达载体中,通过噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,形成噬菌体抗体组合文库。结果电泳显示扩增的mRNA有清晰的28s、18s和5.8s的条带,600~700bp片段者为重组克隆;噬菌体展示抗体库大小在108~107之间;优化电转化条件,最终得到库容为1.2×108cfu,双链重组率为41%的抗体库。结论成功构建人源抗肺癌噬菌体展示文库,为下一步筛选具有肺癌细胞特异亲和力的人源性单克隆抗体奠定了基础。     

从噬菌体单链抗体库中筛选MMP7单链抗体

目的:从人天然噬菌体单链抗体库中筛选与MMP7特异结合的单链抗体(scFv),并对其特异性及活性进行分析。方法:转化MMP7质粒,分离、纯化与鉴定表达的MMP7。以MMP7为靶标对人天然噬菌体单链抗体库进行4轮的筛选富集,初步筛选到能与MMP7结合的scFv。通过ELISA和Western对所获scFv的特异性进行分析。结果:分离纯化鉴定了MMP7,筛选获得了结合MMP7的人噬菌体抗体。ELISA和Western表明筛选到的scFv特异性较好。结论:利用噬菌体抗体库技术可直接获得特异人源MMP7抗体,为抗MMP7单抗药物的研发提供了新的可能性。