苏芪合剂对羊软骨细胞一氧化氮合成的调节作用

目的：探讨苏芪合剂对脂多糖诱导的羊软骨细胞一氧化氮合成的调节作用，及其治疗类风湿关节炎(rhellmatoid arthritis，RA)和骨关节炎的机制。方法：取健康小尾寒羊左后膝关节软骨，分离出软骨细胞进行体外培养。用脂多糖刺激软骨细胞分泌一氧化氮，同时加入不同浓度的苏芪合剂，分别于24，48和72h收集培养细胞上清液，用化学比色法测一氧化氮含量。结果：不同浓度的苏芪合剂对软骨细胞的一氧化氮合成均有抑制作用(P&;lt;0．01)，且以剂量依赖方式。浓度为0．500g／mL的对软苏芪合剂骨细胞一氧化氮合成的抑制作用最强最稳定。结论：本实验证明了苏芪合剂抑制了软骨细胞一氧化氮的合成，可能是其治疗RA和骨关节餐的作用机制之一。     

参芪合剂对羊软骨细胞一氧化氮合成的调节作用研究

目的 探讨参芪合剂(SQHJ)对脂多糖(LPS)诱导的羊软骨细胞一氧化氮(NO)合成的调节作用,了解其治疗类风湿关节炎(RA)和骨关节炎(OA)的机制.方法 取健康小尾寒羊左后膝关节软骨,分离出软骨细胞进行体外培养.用脂多糖刺激软骨细胞分泌一氧化氮,同时加入3种不同浓度的参芪合剂,分别于24、48 h和72 h收集培养细胞上清液,用化学比色法测一氧化氮含量.结果 3种不同浓度的参芪合剂对软骨细胞的一氧化氮合成均有抑制作用(P＜0.01)且以剂量依赖方式发挥作用.浓度为0.5 g/ml的参芪合剂对软骨细胞一氧化氮合成的抑制作用最强最稳定.结论 丹参与黄芪以一定比例组成的参芪合剂可以抑制软骨细胞一氧化氮的合成,从而控制一氧化氮作为炎性介质造成的软骨损伤.此作用是其治疗RA、OA的作用机制之一.     

骨关节炎兔软骨细胞凋亡与八味柔肝散的抑制效应

背景:传统中药对骨关节炎具有镇痛等治疗作用,但对关节软骨是否有保护作用及其通过何种机制起作用少有报道.目的:观察八味柔肝散对兔骨关节炎软骨细胞凋亡的影响.方法:将新西兰大白兔随机分为正常组、模型组和治疗组,模型组和治疗组行Hurth法骨关节炎造模.建模后1周,正常组和模型组每天生理盐水灌胃,治疗组行八味柔肝散水提液灌胃.建模后8周行组织学观察Mankin's评分,硝酸还原酶法测定关节液一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶活性,原位末端转移酶标记技术检测软骨细胞的凋亡指数.结果与结论:结果显示,治疗组关节软骨Mankin's评分,关节液一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶活性,关节软骨细胞凋亡指数均低于模型组(P < 0.05).证实八味柔肝散对兔骨关节炎软骨细胞凋亡有抑制作用.     

脂多糖诱导骨关节炎滑膜细胞表达一氧化氮与氨基胍的抑制效应

目的:观察氨基胍对脂多糖诱导骨关节炎滑膜细胞表达一氧化氮的影响,进一步了解炎性因子与一氧化氮之间的相互关系。方法:实验于2006-3/2006-7在南方医科大学组织工程研究中心进行。①6例骨关节炎滑膜,体外培养滑膜细胞。②将细胞浓度为1×108L-1,培养3～5代的滑膜细胞,以0.5mL/孔的量,加入至24孔板中,培养24h后,分别加入0,1,10,100mg/L脂多糖,及20mg/L脂多糖分别加0,0.1,1,10mmol/L氨基胍,继续培养48h后,收集培养液上清液。测量不同浓度脂多糖诱导下培养上清液中诱导型一氧化氮合酶的含量变化和同一浓度脂多糖 不同浓度氨基胍培养上清液中一氧化氮的含量变化。结果:①未加入脂多糖组培养上清液中诱导型一氧化氮合酶的含量极低,与培养基对照组比较差异无显著性意义(P>0.05)。诱导型一氧化氮合酶的含量随加入脂多糖浓度的增加而逐渐增加,各组间比较,差异有显著性意义(P<0.05)。②滑膜细胞在20mg/L脂多糖诱导下,0,0.1,1,10mmol/L氨基胍组一氧化氮表达的量逐渐减少,组见比较差异有显著性意义(P<0.05)。结论:在炎症因子脂多糖的作用下,滑膜细胞诱导型一氧化氮合酶的含量明显增加,诱导型一氧化氮合酶抑制剂氨基胍可以减少一氧化氮的生成,有助于阻断炎性因子与一氧化氮相互促进的恶性循环。     

骨关节炎兔软骨细胞凋亡与八味柔肝散的抑制效应

背景：传统中药对骨关节炎具有镇痛等治疗作用,但对关节软骨是否有保护作用及其通过何种机制起作用少有报道。目的：观察八味柔肝散对兔骨关节炎软骨细胞凋亡的影响。方法：将新西兰大白兔随机分为正常组、模型组和治疗组,模型组和治疗组行Hurth法骨关节炎造模。建模后1周,正常组和模型组每天生理盐水灌胃,治疗组行八味柔肝散水提液灌胃。建模后8周行组织学观察Mankin＇s评分,硝酸还原酶法测定关节液一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶活性,原位末端转移酶标记技术检测软骨细胞的凋亡指数。结果与结论：结果显示,治疗组关节软骨Mankin＇s评分,关节液一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶活性,关节软骨细胞凋亡指数均低于模型组（P〈0.05）。证实八味柔肝散对兔骨关节炎软骨细胞凋亡有抑制作用。     

氨基葡萄糖对白细胞介素1β诱导体外培养人骨关节炎软骨细胞蛋白聚糖代谢的影响

背景:蛋白聚糖和胶原纤维的降解是骨关节炎发病的主要生理和病理学基础,氨基葡萄糖不仅可以减轻骨关节炎疼痛症状,同时可以延缓骨关节炎的病理改变。目的:了解氨基葡萄糖对白细胞介素1β诱导骨关节炎软骨细胞蛋白聚糖代谢的影响。方法:取骨关节炎患者的软骨细胞,分阶段酶消化法进行体外原代培养。在培养液中加入白细胞介素1β诱导剂,设立不含药兔血清对照组、白细胞介素1β对照组和加入不同浓度兔氨基葡萄糖含药血清的实验组。结果与结论:各浓度氨基葡萄糖含药血清组体外培养软骨细胞释放入培养液中糖胺聚糖百分比均值明显低于对照组(P<0.01),随氨基葡萄糖浓度的增加,糖胺聚糖百分比逐渐降低;蛋白聚糖合成标记物3B3含量的均值较对照组明显增高(P<0.01),与氨基葡萄糖浓度呈正相关;而蛋白聚糖降解标记物5D4含量的均值则正相反;氨基葡萄糖可以增加骨关节炎患者软骨细胞蛋白聚糖mRNA表达,减低基质金属蛋白酶1,3mRNA表达。表明氨基葡萄糖可以抑制白细胞介素1β对骨关节炎患者软骨细胞蛋白聚糖代谢的促进作用,达到保护软骨,防止骨关节炎的目的。     

应用基因调控方法抑制软骨细胞生成一氧化氮的可行性

目的:探讨用基因调控的方法抑制软骨细胞生成一氧化氮的可行性,为通过抑制一氧化氮生成治疗骨关节炎寻找新的途径和方法。方法:实验于2001-09/2002-03在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室完成。根据基因调控和基因诱捕理论,培养大鼠软骨细胞,人工合成大鼠诱生型一氧化氮合酶基因上能够与核因子κB序列识别和结合并带有荧光标记的特异性序列核因子κB诱捕性双链寡核苷酸,同时合成诱生型一氧化氮合酶基因上不能够与核因子κB识别和结合的非特异性序列假诱捕性双链寡核苷酸作为对照,将假诱捕性双链寡核苷酸及1,2,4,8,10μm诱捕性双链寡核苷酸转染入培养的大鼠软骨细胞,通过荧光显微镜观察其转染效率及降解情况,应用一氧化氮检测试剂盒及反转录聚合酶链反应的方法观察其对白细胞介素1诱导的软骨细胞一氧化氮生成及诱生型一氧化氮合酶mRNA转录的影响。结果:①双链寡核苷酸转染软骨细胞的观察结果:核因子κB诱捕性双链寡核苷酸及假诱捕性双链寡核苷酸能转染入软骨细胞胞核并能维持一定时间(48h左右降解)。②一氧化氮的检测结果:以重组人白细胞介素1β刺激的软骨细胞分泌量为100作对照,在未受白细胞介素1β刺激的情况下,软骨细胞分泌少量的一氧化氮(13.6±5.4);以白细胞介素1β刺激软骨细胞后,转染核因子κB诱捕性双链寡核苷酸为1μm,2μm时,软骨细胞分泌的一氧化氮与对照组相比无显著性;而在达到4μm时,一氧化氮分泌量差异即具有显著性(63.8±13.3,P<0.01);此后,随诱捕性双链寡核苷酸浓度增加,软骨细胞分泌的一氧化氮的含量逐渐减少(寡核苷酸浓度为8μm和10μm时);而在转染10μm的假诱捕性双链寡核苷酸后,软骨细胞合成一氧化氮的量并未减少。③诱生型一氧化氮合酶mRNA的表达结果:反转录聚合酶链反应测定诱生型一氧化氮合酶mRNA的相对表达量显示,软骨细胞未受白细胞介素1β刺激时,软骨细胞表达诱生型一氧化氮合酶mRNA为0.02±0.01,软骨细胞受白细胞介素1β刺激时,诱生型一氧化氮合酶mRNA高表达为1.2±0.16,在转染10μm的假诱捕性双链寡核苷酸和1μm,2μm的诱捕性双链寡核苷酸,诱生型一氧化氮合酶mRNA表达量与对照组无显著差异。而在浓度达到4μm时,差异即具有显著性(0.6±0.11,P<0.01)。此后,随诱捕性双链寡核苷酸浓度增加,诱生型一氧化氮合酶mRNA表达量逐渐减少。结论:双链寡核苷酸能够转染入软骨细胞,达到一定浓度的诱捕性双链寡核苷酸(4μm)能抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞一氧化氮生成及诱生型一氧化氮合酶mRNA表达。应用诱捕性双链寡核苷酸通过基因调控的方式阻止了诱生型一氧化氮合酶基因上的一致性序列与核因子κB的结合,从而抑制了诱生型一氧化氮合酶mRNA的转录及诱生型一氧化氮合酶生成,为抑制诱生型一氧化氮合酶的生成提供了新的思路和方法。     

一氧化氮对骨肉瘤细胞生长能力影响的体外实验研究

目的:研究不同细胞因子作用下体外巨噬细胞中一氧化氮的产生及对人骨肉瘤细胞株(HOS)非特异性免疫功能的影响。方法:实验于1999-06/2002-09在第一军医大学南方医院外科实验室和动物实验室完成。HOS体外与小鼠腹腔巨噬细胞混合培养,实验分为4组,第1组用磷酸盐溶液(PSB)做对照,第2,3,4组分别加入γ-干扰素、脂多糖和一氧化氮合酶(NOS)抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)。分别检测各组一氧化氮的产生情况(Griess比色法)和HOS细胞生长能力(锥虫蓝实验)。结果:在有巨噬细胞和γ-干扰素、脂多糖存在时,一氧化氮浓度为(62.6±0.9)μmol/L,细胞存活率为(6.2±1.7)%,但加入L-NAME后一氧化氮浓度又可降至原有水平,HOS细胞存活数量亦随着增加。结论:体外培养条件下,巨噬细胞在细胞因子的作用下可以产生大量的一氧化氮,并对HOS细胞的生长产生明显抑制作用,为骨肉瘤的治疗及患者保肢希望的功能预后提供了一条新的有效途径。     

一氧化氮合酶抑制剂对白细胞介素1β诱导软骨细胞增殖和基质金属蛋白酶表达的影响

目的:研究表明,白细胞介素1β对鼠肾细胞、心肌细胞和神经上皮细胞发挥抗增殖作用,但其是否可抑制人的软骨细胞增殖?这种抗增殖作用是否可被一氧化氮合酶抑制剂抑制尚不清楚.实验拟验证一氧化氮合酶抑制剂对人骨关节炎软骨细胞增殖及基质金属蛋白酶的影响.方法:选择2006-05/12在南方医科大学附属南方医院脊梓骨病科住院的膝骨关节炎患者8例.所有患者均符合1986年美国风湿病学会关于骨关节炎的临床诊断标准或临床及放射学诊断标准,排除其他疾病(创伤性、风湿性及感染性)所导致的骨关节炎.所有患者均在术前告知,并签有试验知情同意书.分离培养关节软骨细胞,将不同浓度(0,1,10,100 μg/L,其中0 μg/L作为对照)白细胞介素1β作用于骨关节炎软骨细胞24,48,72 h,一氧化氮合酶抑制剂氨基胍作为干扰因素,与白细胞介素1β共同作用72 h,收集细胞上清液,一氧化氮的表达量通过一氧化氮试剂盒检测,并作为检测一氧化氮合酶抑制剂活性的手段;四甲基偶氮唑盐法检测软骨细胞的增殖;xMAP技术检测软骨细胞基质金属蛋白酶1,基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶9的表达.结果:①不同时间点1,10,100 μg/L白细胞介素1β组作用后的吸光度值与对照组相比,差异显著(JP＜0.05,P＜0.01);相同浓度白细胞介素1β在24,72h的吸光度值相比较,差异显著(P＜0.01).②白细胞介素1β和氨基胍(100 μmol/L)共同作用软骨细胞72 h后,各浓度组吸光度与白细胞介素1β组相比,差异显著(P＜0.01).③白细胞介素1β可促进软骨细胞一氧化氮的表达,并呈剂量依赖关系.④白细胞介素1β促进基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶3的表达,与对照组相比,差异有显著性意义(P＜0.01),而软骨细胞基质金属蛋白酶9的表达在本实验中没有检测到.结论:白细胞介素1β可抑制软骨细胞增殖,诱导基质金属蛋白酶表达,这些影响可被氨基胍抑制,白细胞介素1β和氨基胍对软骨细胞的影响可能是通过一氧化氮途径发挥作用.     

双醋瑞因干预体外培养关节软骨结缔组织生长因子的表达

背景:在骨关节炎软骨退变中结缔组织生长因子作为一种重要的效应分子在软骨细胞的增殖、分化方面发挥重要作用。临床应用双醋瑞因治疗骨关节炎已取得了良好的效果,但其治疗的确切机制尚不清楚。目的:观察不同浓度双醋瑞因对体外白细胞介素1β诱导下软骨细胞中结缔组织生长因子的影响。方法:体外培养SD大鼠关节软骨细胞,重组人白细胞介素1β刺激软骨细胞制备体外骨关节炎模型。实验分组:正常对照组不给予任何处理因素;模型对照组给予重组人白细胞介素1β;实验组给予不同浓度双醋瑞因+10μg/L重组人白细胞介素1β。利用MTT比色法观察软骨细胞的增殖情况,Western Blot法检测结缔组织生长因子的表达。以上实验均重复3次。结果与结论:MTT结果显示,与正常对照组比较,双醋瑞因能促进软骨细胞MTT增殖活性,以浓度为10-5 mol/L更明显(P<0.01),白细胞介素1β作用后各实验组软骨细胞增殖能力下降(P<0.05);但与正常对照组比较,无论是否加白细胞介素1β,浓度为10-4 mol/L和10-5 mol/L双醋瑞因仍能促进软骨细胞MTT增殖活性(P<0.05)。Western Blot检测结果显示,白细胞介素1β能够降低结缔组织生长因子的表达(P<0.01),浓度为10-5 mol/L双醋瑞因能够显著促进白细胞介素1β诱导下结缔组织生长因子的表达,显著高于模型对照组(P<0.01)。提示双醋瑞因可以促进白细胞介素1β诱导下结缔组织生长因子的高表达,其可能是双醋瑞因促进软骨细胞的分化增殖,治疗骨关节炎的作用机制之一。