葛根素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬及其分子机制研究

[目的] 探索葛根素（Puerarin）诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬及其可能的分子机制。[方法] 以二甲基亚砜（DMSO，空白组）、葛根素（50、100、200 μg/mL）、顺铂20 μg/mL分别干预对数生长期人肝癌HepG2细胞。48 h后，CCK-8法检测细胞增殖抑制率，Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平，吖啶橙染色法观察细胞自噬状况，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、激活型半胱氨酸蛋白酶（Cleaved Caspase-3）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、酵母ATG6同源物（Beclin1）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白表达。[结果] 与空白组比较，葛根素100、200 μg/mL组和顺铂20 μg/mL组HepG2细胞增殖抑制率和凋亡率显著升高（P<0.01），自噬溶酶体数量明显增多（P<0.01），p-Akt、p-mTOR、bcl-2表达明显下调而Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-I、LC3-Ⅱ表达明显上调（P<0.05或P<0.01），Akt磷酸化（p-Akt/Akt比值）降低且Bax/bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P<0.01）。与顺铂20 μg/mL组比较，葛根素200 μg/mL组细胞增殖抑制率和凋亡率显著升高（P<0.05或P<0.01），自噬溶酶体数量明显增多（P<0.05），p-Akt、p-mTOR表达下调而Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-Ⅱ明显上调（P<0.05或P<0.01），Akt磷酸化降低且Bax/Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-I比值升高（P<0.01）。[结论] 葛根素具有诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬的作用，该作用具有一定的剂量依赖性；抑制Akt/mTOR/Beclin1通路进而诱导促凋亡、促自噬相关蛋白表达和活化可能是其重要的分子机制。     

地黄多糖对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后氧化应激和细胞凋亡的影响

目的:研究地黄多糖(polysaccharides from Rehmanniae Radix,PRR)对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后氧化应激和细胞凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:分离并培养乳鼠心肌细胞72 h后随机分为空白组,缺氧/复氧(H/R)模型组,PRR 10,20,40 mg·L~(-1)干预组和舒血宁注射液(SXN,100 mg·L~(-1))干预组,每组设10个复孔。各组细胞经药物干预6 h后,采用噻唑蓝(MTT)检测细胞存活率;检测培养基中天门冬氨酸氨基转移酶(AST),肌酸激酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH)活性;测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量;采用流式细胞仪检测细胞凋亡状况并计算凋亡率,通过实时荧光定量-聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)mRNA表达并计算Bcl-2/Bax表达,通过蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测细胞中凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达并进行半定量分析。结果:与正常组比较,H/R模型组细胞存活率显著降低(P0.01),培养基中AST,CK,LDH活性显著升高(P0.01),细胞中SOD,CAT活性显著降低,MDA含量显著升高(P0.01),细胞凋亡率显著升高(P0.01),细胞中Bcl-2和Bax mRNA表达明显升高(P0.05,P0.01),Bcl-2/Bax表达显著降低(P0.01),Caspase-3蛋白表达显著升高(P0.01);与H/R模型组比较,PRR 20,40 mg·L~(-1)干预组乳鼠心肌细胞存活率明显升高(P0.05,P0.01),培养基中AST,CK,LDH活性明显降低(P0.05,P0.01),细胞中SOD,CAT活性明显升高,且MDA含量明显降低(P0.05,P0.01),细胞凋亡率显著降低(P0.01),细胞中凋亡相关基因Bcl-2 mRNA明显上调而Bax mRNA明显下调,Bcl-2/Bax显著升高(P0.05,P0.01),Caspase-3蛋白表达量明显降低(P0.05,P0.01)。结论:PRR能够通过抑制氧化应激损伤和细胞凋亡而对H/R损伤乳鼠心肌细胞起到一定的保护作用;作用机制可能与其改善抗氧化酶活性,上调抑凋亡基因Bcl-2表达、下调促凋亡基因Bax表达,提高Bcl-2/Bax表达,以及抑制促凋亡蛋白Caspase-3表达有关。     

二参颗粒对氯化钴诱导的H9C2细胞氧化应激介导的细胞凋亡的保护作用

目的:通过观察二参颗粒对氯化钴(CoCl_2)诱导的缺氧损伤和大鼠心肌细胞H9C2凋亡的影响,阐明二参颗粒对心脏的保护作用。方法:以500μmol/L的CoCl_2与H9C2细胞共同作用24 h,建立心肌细胞缺氧缺血模型。将H9C2细胞分为空白对照组、模型对照组、二参颗粒50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL组。酶联免疫法检测胞外培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,流式细胞术检测胞内活性氧(ROS)含量、线粒体膜电位(MMP)和凋亡水平,蛋白质印迹分析法检测细胞内Bcl-2/Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的表达水平。结果:与空白对照组比较,模型对照组细胞活力下降、活性氧(ROS)荧光表达值升高、线粒体膜电位JC-1单体阳性细胞显著升高以及细胞培养液中LDH含量升高,凋亡率显著升高,凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的蛋白表达上调,Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05或P<0.01);与模型对照组比较,二参颗粒能有效改善细胞活力,降低LDH的含量,显著降低胞内ROS荧光表达值,改善线粒体膜电位和凋亡水平,下调凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的蛋白表达,升高Bcl-2/Bax的比值(P<0.05或P<0.01)。结论:二参颗粒可以抑制CoCl_2诱导的心肌细胞ROS水平,减少氧化应激发生,进而改善氧化应激介导的心肌细胞的细胞凋亡。     

黄芩茎叶总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响

目的:探讨黄芩茎叶总黄酮(scutellaria baicalelensis stem leaf total flavonoid SSTF)对培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧时凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法:原代培养乳鼠心肌细胞,缺氧(hypoxia H)2h后,复氧(reoxygenation R)4h制备缺氧/复氧损伤模型。以免疫组织化学方法检测心肌细胞Bcl-2、Bax蛋白表达变化。心肌细胞损伤程度以心肌细胞存活率表示。结果:缺氧2h再复氧4h,心肌细胞Bcl-2蛋白阳性表达指数(positive expressionindex PEI)显著低于对照组(P<0.01),Bax蛋白PEI显著高于对照组(P<0.01)。细胞存活率明显低于对照组(P<0.05)。SSTF干预组Bcl-2蛋白PEI明显高于缺氧/复氧组(P<0.05),Bax蛋白PEI显著低于缺氧/复氧组(P<0.05),细胞存活率明显高于缺氧/复氧组(P<0.05)。结论:心肌细胞缺氧再复氧时,Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达增强;细胞存活率降低。SSTF可通过上调Bcl-2蛋白表达,抑制Bax蛋白表达,减少细胞凋亡,从而减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤。     

银杏叶提取物对缺氧复氧诱导心肌细胞损伤的影响

目的:通过培养SD大鼠乳鼠心室肌细胞建立缺氧/复氧(H/R)模型,观察银杏叶提取物(EGB)对心肌细胞缺氧/复氧所致心肌细胞损伤的影响,为心脏缺血/再灌注损伤的防治提供理论依据。方法:采用胶原酶消化法原代培养乳鼠心肌细胞。分正常对照组、H/R组、H/R+银杏叶提取物组,用MTT法观察心肌细胞存活率、用Western blotting测定Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果:与空白对照组相比,H/R组心肌细胞存活率显著降低,Bcl-2蛋白表达水平下降,Bax表达水平上调;银杏叶提取物预处理后进行H/R较大程度地逆转了上述指标变化,与H/R组相比差异均有显著性(P<0.05)。结论:H/R可以诱导心肌细胞损伤;银杏叶提取物可以通过上调Bcl-2,下调Bax而减轻心肌细胞凋亡,对心肌细胞有保护作用。     

黄精多糖对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用

目的:探究黄精多糖(Polygonatum sibiricum polysaccharides,PSP)对H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia-reoxygenation,H/R)损伤的保护作用。方法:体外无菌培养H9c2心肌细胞,制备缺氧/复氧损伤模型。应用A0-EB和Hoechst33324染色法观察心肌细胞凋亡形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用MTT法检测心肌细胞存活率,Westen Blot法检测H9c2心肌细胞Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表达。结果:缺氧/复氧模型组中H9c2细胞存活率明显降低,细胞核浓染致密、固缩,细胞凋亡率明显增加,Caspase-3的表达和Bax/Bcl-2比率显著上调;与模型组比较,黄精多糖1.0、1.5、2.0mg/ml药物组中细胞存活率均明显升高,细胞核淡染,轻微缩小,细胞凋亡率降低,Bax/Bcl-2比率明显下调,Caspase-3表达水平被显著抑制。结论:黄精多糖对H/R诱导的H9c2心肌细胞具有保护作用,其作用可能与抑制心肌细胞凋亡有关。     

青钱柳三萜对链脲佐菌素损伤的INS-1细胞自噬和凋亡的影响

目的:观察青钱柳三萜对STZ损伤的INS-1细胞自噬和凋亡的影响。方法:用链脲佐菌素(STZ)诱导INS-1细胞建立损伤模型。MTT法检测不同浓度青钱柳三萜对INS-1细胞增殖的影响,荧光酶标仪检测青钱柳三萜对胞内活性氧(ROS)含量的影响,用放射免疫法测定其胰岛素分泌能力,比色法测定上清液中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及丙二醛(MDA)含量;比色法测定心肌细胞中Caspase-3、Caspase-9的活性,荧光定量PCR测定Bcl-2和Bax mRNA表达,并计算Bcl-2与Bax的比值,Western blot检测细胞中自噬调控蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)和凋亡调控蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白表达。结果:当青钱柳三萜浓度低于25μg/ml时,无论单用青钱柳三萜还是与STZ联用均对INS-1细胞增殖具有促进作用,但是当其浓度大于100μg/ml或与STZ联用大于50μg/ml时,均对其细胞生长具有抑制作用;青钱柳三萜(6.25、12.5、25μg/ml)可抑制INS-1细胞凋亡,促进INS-1细胞分泌胰岛素,降低细胞内ROS含量;升高上清液中SOD、CAT和GSH-Px活性,降低MDA含量,降低自噬调控蛋白LC3-Ⅱ和凋亡调控蛋白Cleaved PARP的蛋白表达,上抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA表达,下调促凋亡蛋白Bax mRNA表达及Bcl-2/Bax,降低Caspase-9及Caspase-3的活性。结论:青钱柳三萜对STZ损伤的INS-1细胞具有较好的保护作用。它通过抑制STZ损伤的INS-1细胞过量产生ROS,增强内源性抗氧化酶GSH-Px、SOD、CAT的活性,降低自噬调控蛋白LC3-Ⅱ和凋亡调控蛋白Cleaved PARP的表达,上抗凋亡蛋白Bcl-2表达,下调促凋亡蛋白Bax表达及降低Caspase-9及Caspase-3的活性,进而提高INS-1细胞存活率,来发挥对受损INS-1细胞的保护作用。     

基于Akt/mTOR通路研究地榆皂苷II诱导肝癌细胞凋亡和自噬作用机制

目的 探讨地榆皂苷II抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡和自噬的作用机制。方法 采用不同浓度（0、10、20、40 μmol/L）地榆皂苷II处理人肝癌HepG2细胞和小鼠肝癌Hepa1-6细胞,通过CCK-8和EdU实验观察地榆皂苷II对HepG2和Hepa1-6细胞增殖的影响;运用流式细胞术检测地榆皂苷II对细胞凋亡的影响;通过Western blotting检测地榆皂苷II对细胞凋亡和自噬相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine-aspartic acid protease-3,Caspase-3）、Caspase-8、Caspase-9、B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein,Bax）、cleaved Caspase-3、微管相关蛋白1A/1B-轻链3-II（microtubule-associated protein light chain3-II,LC3II）、微管相关蛋白1A/1B-轻链3-Ⅰ（microtubule-associated protein light chain3-Ⅰ,LC3Ⅰ）、自噬相关蛋白p62、Beclin1及蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）通路关键蛋白表达的影响。结果 地榆皂苷II显著抑制HepG2和Hepa1-6细胞活力,且呈现一定的剂量相关性;流式细胞检测发现地榆皂苷II给药后细胞凋亡率显著增加（P＜0.01、0.001）;Western blotting结果显示,与对照组比较,地榆皂苷II给药后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2表达显著降低（P＜0.05、0.01、0.001）,cleaved Caspase-3、Bax蛋白表达显著升高（P＜0.05、0.01）,LC3Ⅱ/LC3I值显著升高（P＜0.05、0.01、0.001）,Beclin1蛋白表达量显著升高（P＜0.05、0.01）,p62蛋白表达量显著下降（P＜0.05、0.01）,p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR值显著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。结论 地榆皂苷II通过Akt/mTOR通路诱导HepG2和Hepa1-6细胞自噬和凋亡实现对肝癌细胞增殖的抑制,为抗肝细胞癌新药发现提供药理学证据。     

苦豆碱通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路调控前列腺癌细胞自噬与凋亡

目的：探讨苦豆碱对前列腺癌PC3、LNCaP细胞的抑制作用及其可能机制。方法：采用不同浓度(0、25、50、100、200、400、800、1 600μmol)苦豆碱处理前列腺癌PC3、LNCaP细胞。CCK-8法及克隆形成实验检测PC3、LNCaP细胞增殖活性;光学显微镜观察细胞形态改变;流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫荧光检测自噬指标LC3Ⅱ表达;Western Blot检测凋亡和自噬相关蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3Ⅱ、Beclin 1、P62及PI3K/AKT/mTOR通路关键蛋白表达。结果：CCK-8及克隆形成实验结果提示苦豆碱以浓度依赖性抑制PC3、LNCaP细胞活力,与空白对照组(0.1%DMSO)比较,100、200μmol苦豆碱处理后的PC3、LNCaP细胞形态发生明显变化,流式细胞术结果显示细胞凋亡率升高,免疫荧光染色结果显示PC3和LNCaP细胞胞质LC3Ⅱ绿色荧光点状表达数量增多,自噬加强,Western Blot结果显示凋亡相关蛋白Caspase-3、Bax表达显著升高,Bcl-2表达显著降低;自噬相关蛋白Beclin 1表达及LC3Ⅱ/LC...     

基于Akt/mTOR信号通路探讨洋地黄毒苷调控甲状腺滤泡上皮细胞自噬与凋亡的机制

目的 探究洋地黄毒苷对脂多糖刺激下的人甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-roi3-1凋亡与自噬的影响及其作用机制。方法 (1)将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷低剂量组、脂多糖+洋地黄毒苷中剂量组及脂多糖+洋地黄毒苷高剂量组,各组进行对应处理后,CCK-8法检测各组细胞活力,免疫荧光染色观察各组细胞自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bcl-2同源结构域蛋白抗体(Beclin 1)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p70S6K蛋白表达情况。(2)将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷组、脂多糖+洋地黄毒苷+自噬抑制剂组,各组进行对应处理后,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR及p70S6K蛋白表达情况。结果 (1...     

活血消瘿方含药血清调控AMPK/mTOR通路对脂多糖诱导的甲状腺滤泡上皮细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨活血消瘿方含药血清对脂多糖(LPS)诱导的甲状腺滤泡上皮细胞(TFECs)自噬和凋亡的影响以及作用机制。方法 光学显微镜观察分离培养的SD大鼠TFECs细胞的形态;免疫荧光染色鉴定TFECs中特异抗原甲状腺球蛋白(Tg)。取对数生长期的TFECs,分为对照组、LPS组、含药血清组、含药血清+compound C(AMPK抑制剂)组、含药血清+MHY1485(mTOR激活剂)组,MTT法检测各组细胞活力;绿色荧光蛋白(GFP)标记质粒转染检测各组细胞自噬小体变化;流式细胞术检测各组细胞凋亡;western blot检测各组细胞中微管相关蛋白1轻链3(LC3)I、LC3II、Beclin1、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)及AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白表达。结果 光学显微镜观察显示,TFECs形态为梭形、形态均一,且可成簇生长。免疫荧光结果显示,TFECs细胞质中可见较强的Tg荧光染色。与对照组比较,LPS组TFECs细胞活力、自噬小体数量、LC3II/LC3I、Beclin1、Bcl-2、p-AMPK/AMPK蛋白相对表达量显著降低,炎性因子IL-6 、TNF-α水平、细胞凋亡率、Bax、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量显著升高(P< 0.05);与LPS组比较,含药血清组TFECs细胞活力、自噬小体数量、LC3II/LC3I、Beclin1、Bcl-2、p-AMPK/AMPK蛋白相对表达量显著升高,炎性因子IL-6 、 TNF-α水平、细胞凋亡率、Bax、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量显著降低(P< 0.05);与含药血清组比较,含药血清+compound C组、含药血清+MHY1485组TFECs中相应指标与上述趋势相反。结论 活血消瘿方含药血清对LPS诱导的TFECs自噬的促进作用及细胞凋亡的抑制作用可能与激活AMPK/mTOR通路有关。     

参元丹含药血清对缺氧复氧心肌细胞自噬的影响

目的:观察参元丹含药血清对缺氧复氧心肌细胞自噬的影响,探讨参元丹心肌保护作用机制。方法:建立缺氧复氧心肌细胞损伤模型,采用免疫细胞化学法观察心肌细胞微管相关蛋白1轻链3(LC3)和磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)表达,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法测定自噬相关基因(Beclin-1)和半胱天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA表达量。结果:与正常对照组相比,缺氧复氧组LC3和PI3K荧光表达增强,参元丹含药血清组与相应浓度空白血清组相比,细胞LC3和PI3K荧光表达强度减弱,其中参元丹含药血清10%组PI3K荧光强度明显降低,具有统计学意义(P0.05);缺氧复氧组细胞Beclin-1和Caspase-3 mRNA表达量明显升高,与相应浓度空白血清组相比,参元丹含药血清组Beclin-1 mRNA表达水平明显降低;参元丹含药血清5%组Caspase-3 mRNA表达量降低。结论:参元丹含药血清对缺氧复氧细胞自噬具有抑制作用,可能与抑制PI3K,下调Beclin-1和Caspase-3基因有关。     

活络效灵丹拆方对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用研究

目的探讨活络效灵丹含药血清对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的保护作用及其机制。方法取体外培养的乳鼠心肌细胞,建立缺氧/复氧心肌细胞损伤模型。实验分为正常组、模型组(H/R组)、活络效灵丹拆方组和阳性药对照组(单硝酸异山梨酯组)。用MTT比色法检测活络效灵丹对H/R损伤心肌细胞存活率和细胞上清液中LDH漏出量的影响,优选活络效灵丹的最佳配伍组合,并测定各组细胞浆丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性;用RT-PCR法检测心肌细胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表达。结果实验优选出活络效灵丹全方、丹参当归配伍、丹参乳香配伍、丹参当归乳香配伍为最佳配伍。与正常组比较,模型组MDA含量升高、SOD活性降低(P<0.01),细胞Bcl-2 mRNA表达降低、Bax mRNA表达增高(P<0.01);与模型组比较,优选的活络效灵丹各配伍组胞浆SOD活性增高、胞浆MDA含量减少(P<0.01),心肌细胞Bax mRNA表达减少、Bcl-2 mRNA表达增高(P<0.01)。结论活络效灵丹对H/R损伤的心肌细胞具有保护作用,其作用机制可能与清除氧自由基、抗脂质过氧化、上调Bcl-2 mRNA和下调Bax mRNA表达等有关。     

基于PI3K/Akt通路的冠心病痰瘀互结证大鼠发病机制研究

[目的]基于磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)通路探讨冠心病痰瘀互结证大鼠模型的发病机制。[方法] Wistar雄性大鼠,随机分为空白组、假手术组、痰浊组、血瘀组、痰瘀互结组。第54天,血瘀组和痰瘀互结组结扎冠状动脉左前降支,假手术组只穿线不结扎。其中空白组、血瘀组、假手术组采用普通饲料喂养8周,痰浊组和痰瘀互结组采用高脂饲料喂养8周。采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记测定(Tunel)染色的方法观察心肌细胞凋亡情况,采用蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关的促凋亡蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表达情况。[结果] Tunel染色结果显示:痰浊组、血瘀组和痰瘀互结组细胞凋亡明显增多。Western blot结果显示,与空白组比较,血瘀组和痰瘀互结组Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P0.05或P0.01);Bax和Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P0.05或P0.01);痰浊组p-Akt蛋白表达明显升高(P0.05),Akt、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达无统计学差异(P0.05)。[结论]心肌细胞Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白的下调,Bax和Caspase-3蛋白的上调,可以激活PI3K/Akt通路,促进细胞凋亡,此过程可能是冠心病痰瘀互结证的发病机制之一。     

补阳还五汤类方提取物对PC12细胞氧化应激损伤模型凋亡与自噬的调控

目的从凋亡与自噬的调控探讨补阳还五汤类方提取物对PC12细胞氧化应激模型的保护机制。方法以不同浓度H_2O_2刺激PC12细胞制备不同损伤程度的氧化应激模型,采用MTT法确定补阳还五汤类方提取物对氧化应激损伤初期和加剧期发挥保护作用的有效浓度,流式细胞术和TUNNEL法检测细胞凋亡情况,透射电镜和m RFP-GFP-LC3腺病毒双标法检测细胞自噬情况,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)与自噬相关蛋白(Beclin1、LC3A和LC3B)的表达。结果分别以0.5、2.0 mmol/L H_2O_2处理PC12细胞制备氧化应激损伤的初期模型和加剧期模型;与对照组比较,模型组细胞凋亡率增加,自噬程度加剧,Bax/Bcl-2比例增加,Beclin1和LC3B表达上调,LC3A表达下调(P0.05);与氧化应激损伤初期的模型1组比较,补阳还五汤类方提取物均能下调Bax/Bcl-2,抑制凋亡率,并一定程度上调Beclin1和LC3B/LC3A的表达,激活自噬(P0.05);当氧化应激损伤程度加剧时,模型细胞中出现较高水平的凋亡与自噬,此时,两方则通过抑制凋亡和降低自噬,共同发挥保护作用。结论补阳还五汤类方提取物可通过对凋亡与自噬的交互动态调控对不同程度损伤的氧化应激模型细胞挥发保护作用。     

桔梗皂苷D通过Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路抑制细胞凋亡保护急性肺损伤的机制研究＊

目的 探讨桔梗皂苷D对脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤的保护机制。方法 35只雄性SPF级SD大鼠，随机分为假手术组、桔梗皂苷D对照组、模型组、桔梗皂苷D给药组和地塞米松组，每组7只。除假手术组和桔梗皂苷D对照组外，其余各组采用脂多糖诱导大鼠急性肺损伤模型。造模24 h后，牺牲大鼠并称体重及两肺重量，计算肺指数；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）法检测肺组织细胞凋亡并计算凋亡指数（Apoptosis Index，AI）；透射电镜下观察大鼠肺组织超微结构的改变；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肺组织凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2），Bcl-2相关X蛋白（Bax），半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3），多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1（PARP1）蛋白及活化的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved Caspase-3），Cleaved PARP1的表达水平。结果 与假手术组比较，模型组大鼠肺指数显著升高（P < 0.01），肺组织细胞凋亡指数（AI）显著升高（P < 0.01），肺组织Bcl-2及Bcl-2/Bax蛋白表达显著下调（P < 0.01），Bax，Cleaved Caspase-3/Caspase-3，Cleaved PARP1/PARP1蛋白表达均显著升高（P < 0.01）；透射电镜下可见到凋亡小体，影响并改变了肺组织细胞超微结构；与模型组比较，桔梗皂苷D给药组及地塞米松组肺指数明显降低（P < 0.01），肺组织AI明显降低（P < 0.01），肺组织中Bcl-2及Bcl-2/Bax蛋白表达显著上调（P < 0.01），Bax，Cleaved Caspase-3/Caspase-3，Cleaved PARP1/PARP1蛋白表达均显著降低（P < 0.01）；透射电镜下，桔梗皂苷D给药组和地塞米松组肺组织细胞超微结构状态较好。结论 桔梗皂苷D对脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤具有保护作用，其作用机制与抑制Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路，减轻肺组织细胞凋亡密切相关。     

参麦注射液对乳鼠心肌细胞线粒体凋亡通路的影响

目的:探讨参麦注射液对心肌细胞凋亡通路的影响。方法:原代培养心肌细胞,AngⅡ诱导凋亡。MTT法检测线粒体活性,流式细胞仪检测凋亡率及线粒体膜电位,免疫组化染色检测细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达。结果:参麦注射液明显降低细胞凋亡率,增高线粒体活性和膜电位,升高Bcl-2蛋白表达,降低Bax、Caspase-3蛋白表达。结论:参麦注射液可抑制心肌细胞凋亡,其机制与线粒体凋亡通路密切相关。     

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??OBJECTIVE To investigate the apoptosis effect of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 induced by dihydroartemisinin in vitro and the possible mechanism. METHODS After treatment with 25, 50, 100, 200, and 400 ??mol??L^-1 dihydroartemisinin for 24 h. The proliferation inhibitory effect of dihydroartemisinin on SMMC-7721 cell was detected by MTT assay. Cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. The change of apoptotic morphology was detected by confocal laser scanning microscopy. Rho 123 staining method was used to detect the changes of mitochondrial membrane potential. Western blot was used to detect expression of Bcl-2, Bax, Cleaved Caspase-3, Cleaved Caspase-9 and Cyto C. RESULTS MTT results showed that 25-400 ??mol??L^-1 dihydroartemisinin can inhibit the proliferation of SMMC-7721 cells obviously. The cell cycle detection results of flow cytometry showed that dihydroartemisinin could block SMMC-7721 cell cycle in G₂/M phase. The results of Hochest 333258 staining showed that the nuclei were heterogeneous, condensed and fragmented in the DHA treatment group. The cell apoptosis detection results of flow cytometry showed that the apoptosis rate of dihydroartemisinin treated groups were increased obviously (P<0.01). The results of Rho 123 staining showed that the mitochondrial membrane potential was decreased significantly (P<0.01). Western blot results showed that the expression of Bcl-2 was down-regulated, expression of Bax was up-regulated, the ration of Bax/Bcl-2 was increased and the expression of Cleaved Caspase-3, Cleaved Caspase-9 and Cyto C were up-regulated. CONCLUSION Dihydroartemisinin can induce apoptosis of SMMC-7721 cells, on the mechanism of apoptosis may be related to mitochondrial pathway.