GST融合蛋白制备表皮生长因子受体抗体

目的：探讨制备大量表皮生长因子受体(EGFR)特异性抗体的方法。方法：将编码EGFR的N端肽段的cDNA克隆入表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达后,经亲和层析柱纯化,用该GST融合蛋白免疫BALB／C小鼠,获得免疫血清,以ELISA和Western Blot检测抗体滴度。结果：获得GST—PTB融合蛋白纯度大于95％;经免疫小鼠抗血清滴度1：38827～1：190602,得到大量高滴度的EGFR特异性抗体。结论：用原核系统表达GST融合蛋白直接免疫小鼠可以快速、大量地制备EGFR特异性抗体。     

HCMV pp65在原核细胞中的表达、纯化及其抗血清的制备

目的 采用原核表达系统获得HCMV pp65目的 蛋白,免疫家兔制备该蛋白特异性抗血清.方法构建表达GST-HCMV pp65融合蛋白的质粒,在大肠杆菌中诱导表达,经GST亲和层析纯化后的pp65蛋白免疫家兔,获得兔多克隆抗血清.采用ELISA、SDS-PAGE电泳及Western blot检测纯化后的蛋白,并以间接免疫荧光染色法检测鉴定该蛋白的抗原性.结果成功构建PGEX-5X-pp65重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,获得可溶性的融合蛋白;GST亲和层析纯化后的蛋白免疫家兔获得特异性抗血清.结论 在原核细胞中成功获得了融合蛋白pp65,免疫家兔后获得具有高度特异性抗血清.为进一步揭示该蛋白的功能及作用机制奠定了重要基础.     

人类生精相关基因TSARG6的原核表达和抗体制备

目的 构建人类生精相关基因pGEX-KG/TSARG6原核表达载体,原核表达、制备并鉴定多克隆抗体.方法 以人类睾丸cDNA文库为模板,用PCR方法扩增得到TSARG6基因开放阅读框(ORF)全长序列,插入原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入E.coli JM109细菌,IPTG 诱导表达GST/TSARG6融合蛋白,采用SDS-PAGE 和Western blot鉴定融合蛋白,免疫家兔,制备抗TSARG6 多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性.结果 经测序验证,我们成功构建了pGEX-KG/TSARG6 重组质粒;转化重组质粒的E.coli JM109细菌经 IPTG 37℃诱导3 h后高效表达GST/TSARG6融合蛋白;Western blot 实验结果显示制备的多克隆抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了TSARG6基因的原核表达和多克隆抗体制备,为TSARG6的后续功能研究提供了有力的工具.     

犬博卡病毒非结构基因NP1多克隆抗体的制备与鉴定

目的: 制备犬博卡病毒(MVC)的非结构基因NP1的兔多克隆抗体,并进行特异性鉴定。方法: 以MVC的感染性克隆pI-MVC为模板,构建NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,转化大肠杆菌BL21 后,在异巯基-1-硫代-β呋喃半乳糖(IPTG) 诱导下,表达谷胱甘肽S-转移酶(GST)-NP1蛋白。用亲和层析纯化的融合蛋白免疫大白兔,制备NP1抗血清并用ELISA法测定抗血清效价。采用Western blotting和免疫荧光法检测NP1抗血清的特性。结果: 成功构建MVC NP1基因的原核表达质粒pGEX-4T-3-NP1,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物经亲和层析纯化后得到高纯度的NP1融合蛋白,以其免疫大白兔获得NP1多抗血清,ELISA法检测效价达到1:400 000。Western blotting法及免疫荧光检测,所得抗血清具有较高的效价及特异性。 结论: 本研究利用原核表达的MVC GST-NP1 融合蛋白制备的NP1抗血清效价高、特异性高,为进一步深入研究NP1在MVC感染及致病分子机制中的作用奠定了基础。     

人巨细胞病毒US31蛋白特异性抗体的制备及鉴定

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）US31蛋白及其多克隆抗体的制备及鉴定方法。方法：HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至pET21a（+）原核表达载体,构建pET21a（+）/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经Ni-NTA亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的IgG抗体,效价为1:49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论：成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。     

Myosin-Vc特异性片段的原核表达及其抗血清的制备

目的 原核表达Myosin-Vc(Myo5c)蛋白并纯化,制备小鼠、家兔多克隆抗体,为探索MyoSc在病毒感染中的作用提供研究工具.方法 采用RT-PCR方法从人胃粘膜组织中克隆编码Myo5c特异性蛋白的基因片段,构建该片段与6×His标签的融合蛋白表达质粒pQE-31/Myo5c,原核表达与蛋白纯化后,分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,制备Myo5c抗血清.采用ELISA检测抗体效价,Western blot和间接免疫荧光染色检验抗体特异性.结果 获得Myo5c特异性片段约42×103的纯化蛋白.ELISA检测小鼠和家兔抗血清效价分别为1:12 800、1:6 400.Western blot和间接免疫荧光染色显示所制备的抗体能特异性识别Myo5c.结论 获得Myo5c特异性蛋白,并成功地制备了Myo5c特异性的小鼠和家兔抗血清.     

增强型绿色荧光蛋白原核表达纯化与多克隆抗体的制备

目的：进行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的克隆、原核表达和纯化以及多克隆抗体的制备，为以后纯化EGFP融合蛋白奠定基础。方法：构建pGEX-4T3—EGFP重组质粒，在大肠杆菌BL21中进行原核表达，用亲和层析法纯化GST—EGFP，免疫BAB／c小鼠制备EGFP多克隆抗体。结果：①目的蛋白GST—EGFP表达量为8g／L。②获得纯抗体溶液5m1。浓度为0．4g／L。③EGFP抗体在1：100000稀释度时，Western blot检测条带清晰，背景干净。结论：通过优化诱导条件，利用大肠杆菌可低成本获得大量GST—EGFP。直接使用GST—EGFP融合蛋白免疫BAB／c小鼠，可在较短时间内大量制备EGFP多克隆抗体。     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的获取H5N1亚型禽流感病毒NS1蛋白的多克隆抗血清,制备NS1蛋白的多克隆抗体。方法利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白GST-NS1,采用Glutathione-sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白。纯化的GST-NS1蛋白以不同剂量皮下注射免疫BALB/c小鼠,收集抗血清,采用Protein A-sepharose和CNBr-sepharose 4B亲和层析从抗血清中纯化抗NS1蛋白的多克隆抗体。Western blot和免疫荧光法鉴定多克隆抗体的特异性,酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗体的效价。结果 SDS-PAGE结果表明,融合蛋白GST-NS1以可溶形式表达,诱导4 h的表达量占细菌可溶性蛋白的32.6%,融合蛋白的纯度达到90%以上。Western blot分析显示,亲和层析制备的多克隆抗体对NS1蛋白具有高度特异性。ELISA结果表明,皮下注射25、50、100μg GST-NS1融合蛋白的BALB/c小鼠血清光密度D(450)值均明显增高(P<0.01),其滴度达到1∶3 200。免疫荧光观察到病毒感染的A549细胞中,有内源性NS1蛋白的表达。结论成功地从抗血清中制备出NS1蛋白的多克隆抗体,制备的抗体具有高度特异性。     

HIV-1 p15（Gag）基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的:构建HIV-1p15(Gag)原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a( )中,利用大肠杆菌表达系统表达HIV-1p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的蛋白的免疫原性。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),细胞免疫组织化学法检测抗体滴度及其特异性。结果:原核表达载体pET28a( )-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约20KD的p15(Gag)蛋白,经western blot鉴定正确。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论:得到纯化的HIV-1p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

粘附结构蛋白migfilin基因N末端的克隆和抗体制备

目的 克隆migfilin-N末端基因并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因表达产物并进行多克隆抗体制备,为研究migfilin与大肠癌的关系奠定基础.方法 根据人migfilin全长cDNA系列,设计PCR引物,以人大肠癌cDNA文库为模板克隆migfilin-N末端基凶,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中,经EcoRI/XhoI双酶切鉴定后,进行DNA序列测定.GST-migfilin-N融合蛋白在硫代半乳糖苷诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用谷胱甘肽亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-migfilin-N融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.并用纯化的抗migfilin多克隆抗体在不同的细胞株中用Western blotting检测migfilin的表达.结果 成功克隆了migfilin-N端基因片段,表达并纯化了GST-migfilin-N融合蛋白,制备了migfilin特异性抗体.Western blotting检测migfilin在不同细胞株中的表达,结果显示migfilin在肺癌及大肠癌细胞株中高表达.结论 migfilin特异性抗体制备成功,为深入探讨migfilin在大肠癌中的作用奠定了基础.     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

人肌纤生成调节因子1融合蛋白在大肠杆菌的表达和抗体制备

目的研究人肌纤生成调节因子1(MR-1)的表达,获得MR-1蛋白,制备MR-1抗体,为MR-1生物功能研究提供基础.方法利用大肠杆菌质粒pGEX-5X-1、pET30a( )及pET24a( ),分别构建MR-1及其两端与不同标签序列融合的表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中比较N端和/或C端融合标签序列对该基因表达的影响.通过凝胶蛋白电泳及电洗脱制备目的蛋白,免疫家兔.酶联免疫吸咐试验(ELISA)和Western b1ot检测所制备抗体的滴度和免疫原性.结果利用GST或T7-tag序列在其N端融合,使MR-1在大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL得到表达.利用所表达获得的MR-1-T融合蛋白,制备了针对此蛋白的多克隆抗体.ELISA检测所制备抗体滴度达到1:105,Western hlot显示所制备的多克隆抗体可用于检测天然细胞中的MR-1蛋白.结论MR-1蛋白需在N端与GST或T7-tag序列融合方可实现表达.利用在大肠杆菌表达纯化的蛋白所制备的抗体可用于MR-1生物学功能的研究.     

UROC28基因的原核表达及抗UROC28多抗制备和初步应用

目的: 在原核细胞大肠杆菌中融合表达UROC28基因产物,分离、纯化后制备其特异性多克隆抗体,并初步应用于肿瘤标本的检测,为进一步研究该分子的功能和组织分布等提供条件. 方法: 利用DNA重组技术将UROC28基因克隆入融合表达载体pRSET-c质粒,并在大肠杆菌BL-21中融合表达目的蛋白,回收后制备兔抗血清,Western blot鉴定抗体后,应用该抗体对前列腺癌石蜡切片进行免疫组化染色. 结果: His-UROC28融合蛋白的Mr约为22 000,与预期相符;融合蛋白占菌体总蛋白的20%. 目的蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体,Western blot结果显示制备的抗UROC28多克隆抗体具有较高的特异性,无明显交叉反应,并成功在前列腺癌组织标本中检测UROC28的表达. 结论: 本研究成功构建了UROC28融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达. 制备了该分子的多克隆抗体,经初步验证其效价高、特异性好,为深入研究UROC28的功能及其与疾病的关系创造了条件.     

人宫颈癌致癌基因的原核表达与多克隆抗体制备

目的构建人宫颈癌致癌基因HCCR-1167-360片段的重组质粒,在原核细胞中表达并鉴定。方法从培养的人肝癌细胞株HepG2中提取总RNA,经RT-PCR扩增出HCCR-1167-360的cDNA片段,将其克隆到pGEM-T-Easy克隆载体中,将测序正确的HCCR-1167-360基因连接到pET30a(+)表达载体中,IPTG诱导在BL21中进行表达,用SDS-PAGE检测表达产物。采用初步纯化和割胶纯化方法,获得较纯的重组蛋白,采用弗氏佐剂方法免疫兔子,收获多克隆抗体,用Wastern blot鉴定重组蛋白的免疫原性。结果经测序证明获得了HCCR-1167-360基因片段。SDS-PAGE分析,HCCR-1167-360在BL21中获得表达,其相对分子质量为26kD左右,主要以包涵体形式存在。免疫兔子获得了HCCR-1167-360多克隆抗体,经Wastern blot检测结果表明获得了特异性的多克隆抗体。结论获得具有抗原性的HCCR-1167-360原核表达蛋白。     

人宫颈癌致癌基因的原核表达与多克隆抗体制备

目的构建人宫颈癌致癌基因HCCR-1167-360片段的重组质粒,在原核细胞中表达并鉴定。方法从培养的人肝癌细胞株HepG2中提取总RNA,经RT-PCR扩增出HCCR-1167-360的cDNA片段,将其克隆到pGEM-T-Easy克隆载体中,将测序正确的HCCR-1167-360基因连接到pET30a(+)表达载体中,IPTG诱导在BL21中进行表达,用SDS-PAGE检测表达产物。采用初步纯化和割胶纯化方法,获得较纯的重组蛋白,采用弗氏佐剂方法免疫兔子,收获多克隆抗体,用Wastern blot鉴定重组蛋白的免疫原性。结果经测序证明获得了HCCR-1167-360基因片段。SDS-PAGE分析,HCCR-1167-360在BL21中获得表达,其相对分子质量为26kD左右,主要以包涵体形式存在。免疫兔子获得了HCCR-1167-360多克隆抗体,经Wastern blot检测结果表明获得了特异性的多克隆抗体。结论获得具有抗原性的HCCR-1167-360原核表达蛋白。     

分枝杆菌Ag85B多克隆抗体的研制

目的在原核系统中表达并纯化GST-Ag85B融合蛋白,制备兔抗Ag85B多克隆抗体.方法首先构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒pGEX-Ag85B,将此质粒转入大肠杆菌,诱导表达融合蛋白并加以纯化;然后将纯化的蛋白免疫家兔,提取家兔的抗血清,纯化制备多克隆抗体并进行鉴定.结果成功构建了原核表达质粒pGEX-Ag85B,转化入大肠杆菌BL21中诱导表达并成功纯化,用纯化的GST-Ag85B融合蛋白成功制备了兔抗Ag85多克隆抗体.结论制备的多克隆抗体为进一步的研究奠定了基础.     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1在大肠杆菌的表达和纯化

目的分析重组肠道病毒71型外壳蛋白VP1（EV71 VP1）在大肠杆菌的表达及其部位,纯化重组蛋白VP1,为后续制备抗VP1单克隆抗体奠定基础。方法采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导VP1在质粒转化菌BL21中的表达;用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE和Western blot分析VP1的表达形式和抗原性;优化EV71 VP1原核表达条件。结果 SDS-PAGE检测结果表明重组蛋白主要以包涵体形式存在,纯化后的VP1为一单一条带,相对分子质量约36 000,与预期大小相符;Western blot检测证实该蛋白能分别与兔抗EV71外膜蛋白和兔抗His-tag多克隆抗体发生特异性结合,其最佳表达条件为37℃,1.25 mmol/L IPTG诱导4 h。结论原核表达了EV71 VP1,经纯化复性后VP1具有良好的抗原性,为后续工作奠定了基础。     

丙型肝炎NS5A基因多克隆抗体的制备

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）NS5A蛋白原核表达载体,获得高产量的纯化目的蛋白,并制备其多克隆抗体。方法：应用聚合酶链反应技术,PCR扩增获得NS5A基因,将NS5A基因插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠埃希菌DH5α提取质粒,验证正确后,转化大肠埃希菌BL21中,以IPTG诱导,获得NS5A融合蛋白的可诱导性表达．通过SDS—PAGE电泳、Western blot免疫印迹分析证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni^＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：NS5A融合蛋白表达成功,成功获得了融合蛋白及兔抗NS5A多克隆抗体。结论：成功表达NS5A基因融合蛋白．获得高特异性、兔抗NS5A多克隆抗体,为研究NS5A基因的生物学功能提供了重要制剂。     

Epstein-Barr病毒LMP1蛋白羧基端的克隆与原核表达

目的　构建PGEX 6P 3 CCT原核表达载体 ,获得大量纯化的LMP1羧基端蛋白。方法　通过RT PCR技术从B95 8细胞中扩增EBVLMP1CCTcDNA ,克隆至PGEM Teasy载体上并测序。利用引物上的BamHI与EcoRI酶切位点将CCT基因插入PGEX 6P 3,转化大肠杆菌BL2 1 ,限制性内切酶消化鉴定。IPTG诱导重组菌株表达 ,用SDS PAGE与Westernblot对表达产物进行鉴定 ,并用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化 ,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行解离。结果　扩增的LMP1CCT长度为 5 97bp ,测序结果与已知序列吻合。重组子经酶切鉴定 ,获得PGEX 6P 3 CCT原核表达菌株 ,Westernblot表明重组蛋白能被LMP1单克隆抗体特异结合。获得约5 1kDa的PGEX 6P 3 CCT融合蛋白 ,分离纯化出约 2 1kDa的LMP1CCT蛋白。结论　成功获得EBVLM1CCT蛋白 ,为研究LMP1致瘤机制 ,研制生物抗癌药物奠定基础