携带人衰变加速因子基因转基因小鼠的建立

目的 通过建立转人衰变加速因子（ＤＡＦ）基因小鼠,为研究异种器官移植的超急性排斥反应提供有效的研究手段。方法 采用受精卵显微注射技术,将人ＤＡＦ基因导入小白鼠受精卵的原核中,Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔ杂交确定阳性围基因小鼠。以Ｎｏｒｈｅｒｎ杂交法检测人ＤＡＦ基因的表达情况。结果 基因注射后共生出小鼠２４只,４只为转基因小鼠,人ＤＡＦ基因在其中１只小鼠体内得到表达,结论 所导入ＤＡ     

异种移植血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠的建立

目的建立用于异种移植研究血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠。方法采用受精卵显微注射技术，将含有人ICAM-2启动子、人CD59基因第1个内含子、人CD59 cDNA、BGH polyA终止信号的外源基因导入小鼠受精卵的原核中。选取注射后仍健康的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。聚合酶链反应（PCR）及Southern blot确定外源基因整合阳性转基因小鼠。流式细胞术用于外源基因蛋白质水平表达检测。免疫组织化学方法观察人CD59在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏等器官表达分布情况。结果产仔130只，9只外源基因整合阳性。整合率6％（9／130）。6只获得蛋白质水平表达。蛋白质水平表达强度为人CD59在人白细胞表达强度的80％至95％，转基因效率5％（6／130）。免疫组织化学检测显示人CD59在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏组织有较强表达，且表达限于血管内皮细胞。结论成功地建立了用于异种移植研究血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠。     

转人CD46基因抑制人补体在转基因小鼠心脏组织中的沉积

目的 观察转人源性膜辅助蛋白(CD46)基因对转基因小鼠心脏中人补体沉积的抑制作用.方法 以近交系昆明小鼠为对象,采用显微注射法制备转人CD46基因小鼠,用逆转录聚合酶链法(RT-PCR法)检测外源基因的整合情况.以Fo代转基因小鼠11只为实验组,同窝非转基因小鼠10只为对照,快速切取小鼠心脏,用改良的Langendorff法经小鼠主动脉逆行灌注预先制备的含补体的B型血人血浆.观察并记录小鼠心脏搏动时间;采用免疫荧光和免疫组织化学法检测小鼠心脏组织中补体C3c及C9的沉积情况.结果 Fo代转基因小鼠外源基因的整合率为33.3%.实验组小鼠心脏搏动时间为(42.6±20.6)min(15～77 min),长于对照组的(20.2±12.5)min(7～40 min),差异有统计学意义(P＜0.01).实验组小鼠心脏组织中补体C3c及C9的沉积均少于对照组.结论 通过显微注射法制备的转人CD46基因小鼠,其外源基因可稳定表达;转人CD46基因可以抑制人补体C3c及C9在转基因小鼠心脏组织中的沉积.     

联合转移人HT和DAF基因对模拟异种移植超急性排斥反应的抑制作用

目的探讨联合转移人α1，2-岩藻糖苷转移酶（HT）和衰变加速因子（DAF）基因对模拟异种移植超急性排斥反应的抑制作用。方法通过显微注射制备转人HT及DAF基因的子代小鼠，以聚合酶链反应和流式细胞仪筛选出人HT和（或）DAF基因整合与表达阳性的子代转基因小鼠。以同时表达人HT和DAF基因的小鼠为实验组，单一表达人HT或DAF基因的小鼠为HT对照组和DAF对照组，取其心脏，采用改良的Langendorff心脏灌注装置灌注心脏，先以KH液逆向灌注，30min后再以含15％（体积分数）人AB血清的Krebs—Henseleit液（KH液）灌注。记录不同灌注时间的心率、左心室收缩压及左心室舒张末压，计算左心室获得压，以心率与左心室获得压的乘积作为心脏左心室收缩功能的指标，免疫组化法观察灌注后的心脏血管内皮细胞和组织中IgM与C3c的沉积情况。结果KH液灌注过程中，各组间心脏做功能力的差异无统计学意义；KH液中加入人血清后，HT对照组和DAF对照组的心脏做功能力明显下降，在灌注60min时心脏做功分别为最大值的27％和23％，平均做功时间分别为118min和89min，普通小鼠心脏在灌注后50min时停止搏动，而实验组的心脏做功能力下降缓慢，至60min时心脏做功维持在最大值的67％以上，平均做功时间为225min，其心脏做功能力与搏动时间高于HT对照组和DAF对照组（P〈0．05）。免疫组化染色显示，实验组小鼠心脏血管内皮细胞与组织中未见IgM和C3c沉积，HT对照组可见C3c少量沉积，DAF对照组可见IgM沉积和C3c少量沉积，普通小鼠心脏可见IgM和C3c沉积。结论小鼠联合转移人HT和DAF基因后，其心脏在人血清灌注下的免疫损伤明显减轻，这可能对抵御异种移植超急性排斥反应有一定帮助。     

小鼠血管内皮细胞表达人DAF和CD59对其心脏在人血清灌注下做功的影响

目的探讨联合转人衰变加速因子（DAF）和CD59基因对小鼠心脏在人血清灌注下做功及组织结构的影响。方法采用受精卵显微注射技术，将人DAF和CD59基因注入昆明小鼠受精卵的原核中，选取注射后仍健康的受精卵植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。提取足月产小鼠（G0代）基因组DNA，以聚合酶链反应（PCR）及Southern印迹杂交确定外源基因整合情况，应用流式细胞术检测人DAF和CD59在转基因小鼠白细胞上的表达，免疫组织化学染色检测人DAF和CD59在转基因小鼠心脏、肝脏及肾脏组织中的表达。取出转基因成功小鼠的心脏，在体外以人血清进行灌注，测定其做功能力，HE染色及免疫组化染色观察灌注后心脏的组织学变化以及补体C3c的沉积情况。以单一转DAF基因的小鼠为对照。结果共获得G0代小鼠135只，经PCR及Southern印迹杂交分析，11只（8．1%，11／135）整合有人DAF和CD59外源基因，其中6只的白细胞膜表面人DAF和CD59表达阳性，强度分别为（86±6）％和（85±8）%，单转人DAF基因者（87±7）%，差异无统计学意义。人DAF及CD59仅表达于转基因小鼠心脏、肝脏及肾脏组织中的血管内皮细胞上。在人血清灌注后60min内，普通小鼠的心脏做功急剧下降，接近40min时心脏停止搏动；转DAF基因小鼠的心脏做功也下降，但仍维持在最大值的20%以上；转DAF和CD59双基因小鼠的心脏做功维持在最大值的40％以上。在人血清灌注的10～60min，转基因小鼠心脏做功能力明显强于普通小鼠心脏（P〈0．05）；灌注20-60min时，转双基因小鼠的心脏做功能力明显强于转DAF基因小鼠心脏（P〈0．05）。普通小鼠心脏在人血清灌注后组织裂解较多见，肿胀严重，而转基因小鼠心脏组织的病理改变明显轻于普通小鼠，转双基因者的病理变化又明显轻于单一转DAF者，心肌血管中人C3c的沉积也明显少于单一转DAF者。结论血管内皮细胞特异性表达人DAF和CD59，可明显阻抑其心脏在异种血清灌注下的做功能力下降及C3c在血管中的沉积，这可能对抵御超急性排斥反应有一定帮助。     

转染转化生长因子β1基因减轻非协调性异种心脏移植急性血管性排斥反应

目的探讨移植物局部转染转化生长因子β1(TGF-β1)基因对非协调性异种心脏移植急性血管性排斥反应(AVR)的影响。方法建立豚鼠到SD大鼠的颈部心脏移植模型,移植前受鼠接受中华眼镜蛇毒因子和环孢素A预处理,供心切取后,经冠状动脉按每克心肌组织灌注5×1010PFU携带TGF-β1基因的重组腺病毒载体进行基因转染,再移植到经过预处理的SD大鼠颈部(基因转染组),另设灌注5×1010PFU腺病毒空白载体的空白载体组和对照组。术后观察各组移植物的存活情况、移植物组织学变化情况以及移植物中CD68和CD57的表达、细胞凋亡指数、TGF-β1的表达。结果基因转染组移植物的存活时间为(95±3)h,明显长于空白载体对照组的(57±2)h和对照组的(60±2)h(P<0.01);各组移植物均呈急性血管性排斥反应的病理改变,但基因转染组较轻;基因转染组移植物组织中炎症细胞浸润数、CD68和CD57的表达量及细胞凋亡指数明显低于空白载体对照组和对照组,并能检测到外源性TGF-β1的表达。结论经冠状动脉灌注重组腺病毒载体介导的TGF-β1基因转移可减轻非协调性异种心脏移植AVR,明显延长移植物的存活时间。     

供体骨髓间充质干细胞干预非协调性异种肝移植免疫排斥反应的实验研究

目的研究骨髓间充质干细胞(MSCs)对非协调性异种肝移植排斥反应的免疫干预作用。方法密度梯度离心法分离培养豚鼠MSCs,流式细胞仪检测其膜表面CD34、CD45、CD44和CD29的表达,脂肪细胞诱导液培养诱导MSCs向脂肪细胞分化。豚鼠MSCs输注大鼠后检测不同时相免疫球蛋白IgG、IgM、IgA以及补体C3、C4的浓度变化。豚鼠和大鼠各30只随机分为3组,所有大鼠受体经环磷酰胺预处理,A组为MSCs输注组;B组为生理盐水输注组;C组为地塞米松输注组。各组行豚鼠大鼠原位肝脏移植手术,观察受体的存活情况及排斥反应情况。结果MSCs膜表面CD34阴性、CD45阴性、CD44阳性、CD29阳性。脂肪细胞诱导液培养后细胞内出现脂滴沉着。MSCs细胞悬液输注受体后各个时相的免疫球蛋白IgG、IgM和补体C3较输注前有显著降低(P<0.01),而IgA和补体C4与输注前相比无明显变化(P>0.05),输注后的免疫球蛋白IgG、IgM和补体C3各个时相点之间的浓度变化无显著差异(P>0.05)。肝脏移植模型A组受体存活时间为(431±27)min,较B组和C组的存活时间[(148±16)min、(141±22)min]显著延长(P<0.01)。A组受体超急性排斥反应发生较迟,程度轻。结论MSCs的鉴定可根据细胞形态,膜表面标志物和分化能力来确定,MSCs可干预异种肝脏移植的超急性排斥反应的发生。     

水苏糖对模拟异种心脏移植超急性排斥反应的抑制作用

目的观察水苏糖对猪到人异种心脏移植超急性排斥反应的抑制作用。方法以人血液体外灌注猪游离心脏为基础，模拟猪到人异种心脏移植的超急性排斥反应模型。实验分为A、B两组：即分别用人血液灌注及人血液加水苏糖灌注猪离体心脏。观察灌注后两组心脏的跳动时间；体外灌注1h后，对两组灌注心脏进行免疫组织化学（测定IgG及IgM的沉积）及病理学分析。结果A组灌注心脏平均跳动时间为（9．5±2．5）min；B组灌注心脏平均跳动时间为（46．8±8．1）min，其中有1个心脏在灌注的1h内一直跳动；两组心脏跳动时间比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。A组心肌间质呈弥漫性出血、水肿，血管扩张，内皮细胞肿胀、坏死；免疫组织化学检查显示心肌血管内皮组织中有IgG及IgM沉积。B组心肌间质未见出、凝血和坏死，血管内皮细胞未见肿胀；免疫组织化学检测未见IgG及IgM沉积。结论水苏糖对异种心脏移植超急性排斥反应具有抑制作用。     

补体在猪到猴异种心脏移植中的作用及机理

目的 探讨补体在异种大动物猪到猴心脏移植排斥反应中的作用及机理.方法 以梅山猪为供者,中国猕猴为受者,行异种腹腔异位心脏移植.随机将受者分为3组.A组(5只):为空白对照组,受者心脏移植后不作任何处理.B组(5只):为照射预处理组,受者于心脏移植前28 d、即1.5个月龄时接受60Coγ3 Gy全身剂量照射,其余同A组.C组(8只):为照射+胸腺注射预处理组,心脏移植前21 d,将供者的脾细胞(按照5×107个/只的数量)注入受者的两侧胸腺内,其余同B组.观察心脏移植术后各组移植心的存活时间;猪对猴单向混合淋巴细胞培养的刺激效应;采用双抗体夹心法检测补体C3和CD46的血清浓度;通过流式细胞术检测受者外周血细胞表面IgM、IgG阳性细胞百分比水平.结果 A、B、C三组移植心的存活时间分别为:(36.6±5.8)h、(65.6±6.5)h和(91.1±22.8)h,C组移植心的存活时间明显延长,与A组比较,P＜0.01,与B组比较,P＜0.05.C组在猪对猴单向混合淋巴细胞反应中的刺激效应较A、B组明显下降(P＜0.01).B、C组移植前补体水平(C3)无明显变化,但随着IgM、IgG水平的上升,发生排斥反应时C3和CD46水平显著降低.C组猕猴特异性抗猪抗体IgM及IgG的上升速度均较A、B组明显延缓.结论 对受者进行异种胸腺注射联合全身照射预处理在抑制T淋巴细胞免疫及体液免疫方面有重要作用,但无法抑制异种排斥反应中补体的激活,补体通过经典途径参与了延迟性异种排斥反应的发生.     

眼镜蛇毒因子清除补体对大鼠异种心脏移植超急性排斥反应的影响

目的　探讨眼睛蛇毒因子 (CVF)对血清总补体活性及对豚鼠到大鼠异种心脏移植超急性排斥反应的影响。方法　 1 5只正常大鼠随机分成 3组 ,按组分别一次性静脉给予 2 0、50、1 0 0 μg/kg的CVF ,检测不同时间点的补体活性 ;在豚鼠到大鼠异位心脏移植前 2 4h静脉给予CVF50 μg/kg,观察CVF对异种心脏移植超急性排斥反应的影响。结果　在给予CVF后 6h ,3个剂量组的血清总补体活性均显著降低 ,3个组用药后均未见明显毒副反应。使用CVF的实验组 ,移植的异种心脏存活时间显著延长 ,平均达 56 .1 3h ,对照组仅为 0 .1 9h(P <0 .0 0 1 ) ,病理检查结果证实实验组均未发生超急性排斥反应 ,仅见延迟性异种排斥反应 (DXR)的病理特征 ,对照组均见超急性排斥反应的病理特征 ,且总补体活性较术前有明显下降。结论　眼镜蛇毒因子有良好的降低大鼠补体活性的作用 ,且副作用不明显 ;使用眼镜蛇毒因子可克服豚鼠到大鼠的异种心脏移植超急性排斥反应的发生。