P38MAPK通路在BMP9诱导C3H10T1/2干细胞向心肌样细胞分化中的作用

目的:研究P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases,P38MAPK)通路在骨形态发生蛋白9(Bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导C3H10T1/2干细胞向心肌样细胞分化中的作用.方法:免疫印迹检测经pAdEasyBMP9诱导24 h的C3H10T1/2干细胞磷酸化P38MAPK和P38MAPK表达水平,免疫荧光定位磷酸化P38MAPK;SB203580抑制C3H10T1/2干细胞磷酸化P38MAPK活性,pAdEasyBMP9诱导21 d时免疫印迹检测心肌特异性蛋白CX43、cTnT表达,免疫荧光检     

FGF-2真核表达质粒的构建及对C3H10细胞增殖及成软骨分化的影响

目的：构建成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2,FGF-2）真核表达质粒,检测其对小鼠间充质干细胞C3H10增殖、成骨及成软骨分化作用的影响。方法：以质粒pAd-Trace-FGF-2为模板,PCR扩增目的基因FGF-2,经BglⅡ、SalⅠ双酶切后连接至pIRES2-EGFP表达载体中获得pIRES2-EGFP-FGF-2真核表达质粒,脂质体转染到C3H10细胞中,另设pIRES2-EGFP空载体转染对照组和空白细胞对照组。RT-PCR及Western blot法验证各组FGF-2的表达水平,MTT法和流式细胞术检测细胞的增殖活力及细胞周期分布,RT-PCR检测成骨及成软骨、Wnt信号通路相关基因的mRNA水平表达变化,Western blot法检测Ⅱ型胶原（collagenⅡ,ColⅡ）的表达,甲苯胺蓝染色检测软骨基质的表达。结果：重组表达质粒pIRES2-EGFP-FGF-2经双酶切及测序证实构建正确;质粒转染C3H10细胞后,其FGF-2基因的mRNA和蛋白水平表达较2个对照组明显增高,细胞增殖活力明显增高（P<0.05）,软骨相关标志物Ⅰ型胶原（collagenⅠ,ColⅠ）、ColⅡ、蛋白聚糖（aggrecan,ACAN）mRNA转录水平较2个对照组均明显增高（P<0.05）,骨钙蛋白（osteocalcin,OC）、骨保护素（osteoprotegerin,OPG）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）mRNA转录水平无明显升高（P ＞0.05）,Wnt5a及Fzd8 mRNA转录水平降低（P<0.05）,FGF-2转染组细胞甲苯胺蓝染色呈现紫红色异染。结论：成功构建FGF-2基因重组真核表达质粒,FGF-2过表达可提高C3H10细胞的增殖活力,对C3H10细胞有成软骨效应,但短期成骨效应不明显,可能与下调Wnt5a及受体Fzd8的表达有关。     

AP2α在BMP9诱导C3H10成骨分化中的作用及机制探讨

目的：研究转录蛋白2（activator protein 2,AP2）α在骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）9诱导小鼠间充质干细胞C3H10成骨分化中的作用及可能的分子机制。方法：重组腺病毒 Ad-BMP9感染小鼠C3H10细胞,显性负性突变体AP2α-△bHLH和AP2α-△TAD抑制 AP2α转录活性,通过RT-PCR、real-time PCR检测AP2α、BMP9及成骨相关基因的表达水平,Western blot检测骨桥蛋白（osteopontin,OPN）表达,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性测定、茜红素染色实验观测C3H10成骨分化。结果：BMP9具有强促成骨分化的作用,对AP2α的表达水平无影响,AP2α显性负性突变体可抑制BMP9诱导的成骨基因骨钙蛋白（osteocalcin,OC）、OPN及骨保护素（osteoprotegerin,OPG）表达的增高（OC：F=56.929,P=0.000;OPN：F=54.789,P=0.000;OPG：F=159.451,P=0.000）,ALP活性（F=69.776,P=0.000）及红色钙盐沉积减少。结论：BMP9可能通过影响AP2α的转录活性调控成骨分化进程。     

P38MAPK通路在BMP9诱导C3H10T1/2干细胞向心肌样细胞分化中的作用

目的:研究P38丝裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activated protein kinases,P38MAPK)通路在骨形态发生蛋白9(Bonemorphogenetic protein 9,BMP9)诱导C3H10T1/2干细胞向心肌样细胞分化中的作用。方法:免疫印迹检测经pAdEasyBMP9诱导24 h的C3H10T1/2干细胞磷酸化P38MAPK和P38MAPK表达水平,免疫荧光定位磷酸化P38MAPK;SB203580抑制C3H10T1/2干细胞磷酸化P38MAPK活性,pAdEasyBMP9诱导21 d时免疫印迹检测心肌特异性蛋白CX43、cTnT表达,免疫荧光检测心肌特异性蛋白cTnT、α-MHC表达,RT-qPCR检测心肌特异性基因GATA4、MEF2C表达。结果:pAdEasyBMP9促进磷酸化P38MAPK表达增高,却不影响P38MAPK表达水平;磷酸化P38MAPK有表达于胞浆和胞核、仅表达于胞核的不同状态。SB203580可显著性地抑制由pAdEasyBMP9诱导的C3H10T1/2干细胞CX43、cTnT、α-MHC、GATA4、MEF2C表达。结论:pAdEasyBMP9诱导C3H10T1/2干细胞能激活P38MAPK通路,并促进其向心肌样细胞分化。     

小鼠胚胎间充质干细胞系C3H/10T1/2的多向分化潜能研究

目的 建立小鼠胚胎间充质干细胞系C3H/10T1/2细胞成肌、成脂、成内皮、成神经元分化的细胞实验模型.方法 用化学诱导剂5-氮杂胞苷诱导C3H/10T1/2细胞成肌、成脂,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)联合诱导C3H/10T1/2细胞成内皮,bFGF、β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,β-ME)、DMSO诱导C3H/10T1/2细胞成神经元细胞分化.诱导期间应用细胞形态学观察、油红"O"染色、免疫细胞化学染色检测内皮细胞表面标志CD31和神经元特异性烯醇化酶(oeuron-specific enolase,NSE)对分化细胞进行鉴定.结果 5-氮杂胞苷诱导C3H/10T1/2 10 d后细胞变长,17 d后可见明显肌管形成,15 d少量细胞出现脂滴,25 d油红"O"染色见细胞质大量红色脂滴;VEGF和bFGF诱导5 d后细胞呈现"鹅卵石"样形态,8 d后阳性表达CD31;bFGF、β-巯基乙醇和DMSO联合诱导3 d后细胞胞体收缩,突起变长,15 d NSE染色阳性.结论 C3H/10T1/2细胞具有多向分化的潜能,可用作研究间充质干细胞生物学特性的模型.     

BMP9对C3H10T1/2干细胞向心肌样细胞分化的影响

目的:研究骨形态形成蛋白9(Bone morphogenetic proteins 9,BMP9)在C3H10T1/2干细胞向心肌细胞分化过程中的影响.方法:以高滴度(2.67 ml/L)pAdEasy-BMP9重组腺病毒质粒转染C3H10T1/2干细胞,1周后应用RT-PCR方法及激光共聚焦方法分别检测C3H10T1/2干细胞中心肌特异转录因子及特异性蛋白的表达变化.2周后应用电子显微镜观察细胞超微结构的改变.结果:C3H10T1/2干细胞经pAdEasy-BMI9重组腺病毒质粒诱导1周后,细胞体积明显变大,排布走向趋于一致,细胞间连接紧密,折光性增强;细胞中开始出现心肌特异性转录因子NKx 2.5、GATA-4、MEF2C及心肌特异性表达蛋白连接蛋白43(Connex-in43,Cx43)和心肌特异性肌钙蛋白T(Cardiac isoform ofTropnin T,cTnT)的表达;出现心肌特异性超微结构肌丝和闰盘结论:BMP9可影响体外培养的C3H10T1/2干细胞定向分化为心肌样细胞.     

LncRNA AK051397在BMP-2诱导的C2C12成骨分化中的作用

目的研究骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）诱导后表达上调的LncRNA AK051397在C2C12成骨分化过程中的作用。方法 BMP-2诱导C2C12成骨分化过程,实时定量PCR技术与碱性磷酸酶（ALP）染色检测成骨相关指标。对C2C12细胞在BMP-2诱导下,成骨分化过程中的LncRNAs表达变化进行芯片分析（ArrayStar LncRNA Array）,筛选出表达明显上调的LncRNAs,最后采用siRNA干扰的方法下调LncRNAs表达后分析其对成骨分化过程的影响。结果 BMP-2诱导C2C12成骨分化过程中,成骨指标ALP、SPT增高,成肌指标MYOG降低。芯片结果表明,LncRNA AK051397在BMP2诱导后表达明显上调,处理组与未处理组相比升高4.9倍（P〈0.05）。干扰AK051397后成骨分化指标ALP、SP7表达下降,MYOG表达上升。结论 LncRNA AK051397在C2C12细胞中具有促进成骨分化的作用,同时也具有抑制细胞成肌分化的作用。     

重组人骨形成蛋白-2在诱导C3H10T1/2干细胞成骨中对MMP-9 mRNA表达的影响

目的：测定MMP-9mRNA在C3H10T1／2 clone 8(10T1／2)中的表达,探讨rhBMP-2诱导10T1／2产生成骨细胞时对MMP-9mRNA表达的影响。方法：取10T1／2培养至细胞完全贴壁,加入rhBMP-2培养28天,同时利用Real—time PCR检测MMP-9在10T1／2中不同时间段的表达。结果：10T1／2经rhBMP-2的诱导14天出现钙化点,MMP-9mRNA也随着rhBMP-2的加入表达降低,而对照组几乎不变化。结论：rhBMP-2在诱导10T1／2产生成骨细胞的同时抑制着MMP-9mRNA的表达。     

ERK5信号通路参与BMP9诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞的分化

目的：研究细胞外信号调节激酶5（extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5）信号通路在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化中的作用。方法：用AdBMP9和AdGFP转染C3H10T1/2细胞,流式细胞术检测转染效率,Western blot检测磷酸化ERK5（phosphorylation ERK5,p-ERK5）和ERK5的表达水平,免疫荧光检测p-ERK5在细胞内的表达位置;ERK5特异性抑制剂BIX02189预处理细胞再经AdBMP9诱导,Western blot检测p-ERK5和ERK5表达水平,RT-qPCR检测心肌特异性基因肌细胞增强因子（myocyte enhancer factor,MEF）2C、GATA结合蛋白4（GATA binding protein 4,GATA4）表达,Western blot检测心肌特异性蛋白缝隙连接蛋白４３（connexin 43,CX43）、心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T,cTnT）表达。结果：AdGFP与AdBMP9的转染效率达50%左右,经AdBMP9诱导后的细胞p-ERK5表达明显增高（P＜0.01）,免疫荧光结果显示BMP9组p-ERK5表达明显增强且主要集中于胞核;15 ?滋mol/L BIX02189可完全抑制p-ERK5的表达（P＜0.01）,且明显降低了由AdBMP9诱导的C3H10T1/2细胞GATA4、MEF2C基因与CX43、cTnT蛋白表达（P=0.000）。结论：BMP9可以通过激活ERK5信号通路调控C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化。     

四甲氧基二苯乙烯抑制多潜能干细胞C3H10T1/2的脂肪分化

目的探讨不同浓度CYP1B1抑制剂TMS（2,3’,4,5’,-四甲氧基二苯乙烯）对于C3H10T1/2多潜能干细胞脂肪分化及相关
基因表达的影响。方法体外培养C3H10T1/2细胞株至完全融合后,接触抑制2 d,用激素刺激混合物（IDM）（10 μg/ml胰岛素,
2 μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 3-异丁基1-甲基黄磦呤）诱导分化,同时加入不同浓度TMS（0,1.0,2.0、4.0 μg/ml）。观察各组
细胞分化程度,脂肪分化关键转录核因子——过氧化物酶体增殖物活化受体（PPARγ）及其下游靶基因CD36、脂肪酸结合蛋白4
（FABP4）的的表达状况。结果油红和TG含量测定结果显示,CYP1B1选择性抑制剂TMS可剂量依赖地抑制IDM诱导的多潜
能干细胞C3H10T1/2向脂肪细胞分化;这一作用源于TMS抑制转录核因子PPARγ的转录和蛋白表达以及下游靶基因CD36与
FABP4表达。结论TMS抑制由IDM诱导的多潜能干细胞C3H10T1/2向脂肪细胞分化。
     

全反式维甲酸调控BMP9诱导3T3-L1前脂肪细胞成骨和成脂分化

目的 研究全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)调控骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导前脂肪细胞成骨和成脂分化的作用及相关机制.方法 首先用RTPCR检测维甲酸受体在3T3-L1前脂肪细胞中的表达;用BMP9编码序列的重组腺病毒感染3T3-L1细胞,再以1 μmol/L的ATRA干预不同时间后,利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定和染色、Western blot检测骨桥素(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OC)和脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein,aP2)表达,茜素红染色检测钙盐沉积水平,油红O染色检测脂质积聚研究BMP9和ATRA对前脂肪细胞成骨和成脂分化的作用;利用荧光素酶报告质粒和Western blot检测ATRA对BMP9介导的BMPR-Smad信号通路活性的影响.结果 前脂肪细胞中,除视黄醇受体γ外其余5种维甲酸受体均有表达;BMP9能增加前脂肪细胞ALP活性(P＜0.01),并促进OPN及OC蛋白表达和钙盐沉积,ATRA能进一步增强该作用(P＜0.01);BMP9能促进前脂肪细胞中脂质积聚,并诱导aP2表达,但该作用被ATRA抑制;ATRA还能够上调细胞中BMP9的mRNA和蛋白表达,BMP9合并ATRA组的Samd1/5/8磷酸化水平明显强于BMP9组,BMPR-Smad报告质粒荧光素酶活性也呈相同变化趋势(P＜0.01).结论 在前脂肪细胞中,ATRA能增强BMP9的成骨诱导活性,并抑制其诱导的成脂分化;ATRA的作用可能与进一步激活BMP9介导的BMPR-Smad信号有关.     

BMP13转染C3H10T1/2细胞对改善心梗大鼠心功能的影响

目的:探讨在大鼠心肌梗死微环境中骨形态生成蛋白13 (Bone morphogenetic protein,BMP13)能否促进C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化并且改善心梗大鼠的心功能.方法:56只SD(Sprague dawley)雄性大鼠随机分成4组:假手术组(SHAM,n=8只),单纯心梗组(Myocard...     

Islet-1诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化过程中对心肌特异蛋白基因上组蛋白乙酰化的促进作用

目的研究Islet-1诱导C3H10T1/2细胞定向分化为心肌样细胞过程中表达增加的心肌特异蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2c上组蛋白乙酰化水平的变化情况。方法 Islet-1基因慢病毒感染小鼠骨髓间充质干细胞C3H10,Western blot检测转染后乙酰化的组蛋白H3表达情况,逆转录及实时荧光定量PCR时序性检测出心肌特异性蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2c的mRNA表达达高峰的时间点,采用染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation,CHIP),用CHIP级乙酰化H3抗体免疫沉淀与其所结合的DNA,采用实时荧光定量PCR扩增抗体所富集的心肌特异性蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2c启动子区域的DNA量,比较感染组和未感染组与抗体所结合的上述3种心肌特异蛋白基因的表达情况。结果感染高表达Islet-1的C3H10T1/2细胞组蛋白H3的乙酰化水平较未感染组升高3.04倍(P<0.05),在心肌特异性蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2C的mRNA表达达高峰的2周时间点,乙酰化的H3抗体所结合的心肌特异性蛋白基因GATA4、NKX2.5、MEF2c与未转染Islet-1的细胞组相比较,表达增加(P<0.05)。结论高表达Is-let-1之后C3H10T1/2细胞定向分化为心肌样细胞过程中表达增加的心肌特异蛋白基因上组蛋白乙酰化水平增高。     

蜂胶黄酮对大鼠颅骨成骨细胞增殖分化及BMP2表达的影响

目的 探讨蜂胶黄酮对体外培养大鼠颅骨成骨细胞增殖分化以及骨形态发生蛋白2(BMP2)表达的影响.方法 提取新生大鼠颅骨成骨细胞制作体外培养模型,用不同浓度的蜂胶黄酮刺激分离培养的大鼠成骨细胞,然后用噻唑蓝(MTT)法测定蜂胶黄酮对体外培养成骨细胞的增殖作用,用氨基安替吡啉测酚法测成骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性,并通过免疫组织化学方法 观察成骨细胞BMP2的表达.结果 添加蜂胶黄酮体外培养24 h后,100μg/L剂量组较对照组有明显的提高;48 h后,5、10和100μg/L剂量组与对照组比,增殖率均显著提高;添加蜂胶黄酮的中剂量组和高剂量组的BMP2表达在24 h和48 h都显著高于零剂量组.培养72 h后,10、50和100μg/L剂量组与对照组比,增殖率均有明显的提高;50μg/L和100μg/L剂量组与对照组相比ALP活性均显著性提高.结论 蜂胶黄酮可以增加成骨细胞的增殖和分化,促进骨组织的形成,可用来预防骨质疏松症.     

过表达NICD通过下调基因JunB的表达抑制BMP9

目的：研究Notch信号通路在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化过程中的作用及其机制。方法：将细胞分为5组：空白组（Blank,n=3）,BMP9处理组（BMP9,n=3）,空白质粒对照组（BMP9+Control,n=3）,过表达Notch1胞内段质粒（Notch1 intracellular domain,NICD）处理组（BMP9+NICD,n=3）,DAPT处理组（BMP+DAPT,n=3）。通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和钙盐染色分别验证过表达NICD对成骨分化早晚期情况的影响。进一步采用定量逆转录PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-RCR）和Western blot检测基因NICD、Hey1及成骨相关基因Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8、OPN、Runx2、OCN、JunB的表达。结果：早期ALP活性及染色结果显示,NICD组较Control组能显著抑制C3H10T1/2细胞成骨分化过程中ALP的形成[5 d：（33 167.66±2 018.45） vs. （146 451.00±14 889.67）,P=0.000;7 d：（58 981.33±4 724.70） vs. （89 588.66±5 928.32）,P=0.000],γ-分泌酶抑制剂（N-[N-（3,5-difluorophen-acetyl）-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT）完全抑制Notch通路时得到相同的结果[5 d：（44 812.66±4 174.94） vs. （146 451.00±14 889.67）,P=0.000;7 d：（64 622.93±4 724.70） vs. （89 588.66±5 928.32）,P=0.000]。茜素红S染色结果显示,NCID抑制钙盐结节的形成,而DAPT阻断Notch通路明显促进钙盐结节形成。qRT-PCR结果表明,NCID组中NICD及靶基因Hey1的表达较Control组明显增加[（3.90±0.02） vs. （0.35±0.01）,P=0.000;（19.79±0.01） vs. （11.80±0.02）,P=0.000],Western blot得到相同结果[（1.32±0.01） vs. （0.19±0.01）,P=0.000],且NICD明显抑制成骨分化相关基因JunB、Runx2、OCN、OPN等的表达[（0.10±0.01） vs. （0.53±0.01）,P=0.000;（0.18±0.01） vs. （0.30±0.02）,P=0.000;（0.36±0.01） vs. （0.62±0.02）,P=0.000;（0.07±0.01） vs. （0.48±0.01）,P=0.000],而转录因子Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8的表达不受影响[（0.74±0.02） vs. （0.73±0.03）,P=0.000;（0.63±0.01） vs. （0.58±0.04）,P=0.000],DAPT阻断Notch通路后上述相关基因的表达明显增加。结论：本实验结果首次证明,NICD激活Notch通路对BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的抑制作用可能是通过抑制JunB基因发挥作用,而非调控BMP9/Smad（bonemorphogenetic protein 9/drosophila mothers against decapentaplegic）信号通路。