987例乙型肝炎患者HBV-DNA P区多位点耐药突变分析及临床意义

目的分析乙型肝炎患者HBV-DNA P区基因突变情况、用药史及其临床意义。方法采用焦磷酸测序法,对368例经核苷(酸)类似物(NAs)治疗1年以上(用药组)及619例未用抗病毒药物治疗(未用药组)的乙型肝炎患者HBV-DNA P基因区9个NAs相关耐药突变位点进行检测,回顾性分析不同NAs耐药的突变形式,分析NAs治疗前HBV逆转录酶(RT)基因自然变异的发生率。结果 368例中94例出现基因耐药变异,变异模式以经典突变L180M、M204V/I、A181V/T、N236T突变为主,其次为V173L、S202G/S、T184L、I169T突变,M204V多以联合L180M突变的形式存在,其中235例服用单种NAs有48例发生变异,多位点(3个及以上耐药位点)突变5例(10.42%),133例服用多种NAs有46例发生变异,多位点突变19例(41.30%),多药使用者发生多位点变异率明显高于单药使用者(χ2=8.38,P0.05)。368例患者中多位点变异组(A组)与少于三个位点变异组(B组)的年龄、HBVDNA、ALT无明显差异。619例中51例出现基因耐药变异(8.24%)。结论 HBV感染者存在少量自然变异位点。长期应用NAs可筛选出HBV-DNA P基因区的相关耐药变异且耐药变异复杂,服用多种NAs(特别是序贯治疗)容易发生基因耐药变异且易发生多位点变异。长期应用NAs的乙型肝炎患者需定期检测基因耐药情况并及时干预,避免临床反跳的发生。     

DNA测序与线性反向探针杂交法检测HBV P基因耐药突变的比较

目的建立和优化扩增慢性乙型肝炎患者血清HBV P基因的PCR方法,比较DNA测序法与线性反向探针杂交法检测HBV基因突变情况,并对耐药相关基因突变及其意义进行分析。方法采用巢式PCR法扩增93例慢性乙型肝炎患者血清HBV P基因反转录酶区,对PCR产物进行DNA测序,采用Bioedit6．0．5、Seqman TMⅡ、EditSeq TM和MegAlign软件分析结果;同时随机抽取40份血清进行线性反向探针杂交,比较两者的检测结果,并对11个已知耐药相关突变位点进行分析。结果在93份标本中DNA序列测定法检测到碱基突变113个,其中与LAM相关突变50份（53．78％）,与ADV相关突变6份（6．46％）,与LdT相关突变3份（3．23％）,与ETV相关突变3份（3．23％）;在40份血清中与线性反向探针杂交检测结果一致的突变为87．5％（35140）,氨基酸位点一致为98．0％（431／440）。此外,还检测到V84I、S85C、A181S、L229W、N238T等与耐药相关的突变位点。结论应用线性反向探针杂交检测虽然比较快捷,但其价格昂贵且只能检测已知常见的变异位点;建立在巢式PCR基础上的DNA序列测定法敏感性与线性反向探针杂交法相当,两者检测结果有较高的符合率,但似可检出更多的耐药相关突变。     

鄂西北地区慢性乙型肝炎患者HBV基因型与耐药突变的研究

目的:分析鄂西北地区慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)基因分型与耐药突变的分布及其临床特点。方法:回顾性研究2011.1-2016.11太和医院感染科病房及门诊基因测序法和基因芯片法检测的324例慢性乙型肝炎患者的HBV基因型、常见核苷(酸)类似物(NAs)耐药突变位点、肝功能指标、HBV DNA定量及临床特点等,并分析其相关性。结果:基因测序法检测238例,芯片法86例,其基因分型均以B型为主,基因芯片法中可以检测到少量D型及混合基因型。共132例患者检测出NAs耐药,耐药突变位点以204位点最多见,B、C基因型耐药率及临床表现的差异无统计学意义,耐药位点整体分布存在差异,但NAs耐药分布一致,均以拉米夫定耐药为主。结论:鄂西北地区慢性乙型肝炎患者的HBV基因分型以B型为主,C型次之,B、C基因型患者耐药突变位点的分布存在一定差异,但其耐药率、临床表现及NAs耐药分布差异无统计学意义。B型患者无NAs抗病毒治疗史患者NAs耐药率高于C型患者。     

A～D基因型乙型肝炎病毒全长逆转录酶区PCR方法的建立及应用

目的 建立适用于扩增我国常见的乙型肝炎病毒(HBV)A～D基因型全长逆转录酶(RT)区(包含全长HBsAg编码区)的聚合酶链反应(PCR)法,并确定其在分析临床标本中的应用价值.方法 建立我国HBV基因序列库,设计适用于扩增A～D基因型HBV全长RT区引物,以A～D基因型HBV重组质粒为模板建立半巢式PCR(snPCR)法,并确定该法灵敏度.用所建立的snPCR对44份HBV DNA定量阳性(>5.0×102 拷贝/ml)慢性乙型肝炎患者血清标本进行扩增及PCR产物直接测序.结果 琼脂糖凝胶电泳及测序证实,snPCR可扩增A～D基因型HBV全长RT区,对A、B、C和D基因型HBV质粒扩增的灵敏度分别为1.2×103、7.0×102、6.0×102和6.0×102 拷贝/ml.snPCR检测HBV DNA >5×102 拷贝/ml血清标本的阳性率为88.64% (39/44),扩增阴性血清标本HBV DNA滴度均处于103 拷贝/ml水平.扩增目的 产物经直接测序确证无误.生物信息学分析显示,样品中B和C基因型分别占35.90%(14/39)和64.10%(25/39);其中15.38%(6/39)发生RT区变异,包括4例为已知耐药变异;7例(17.95%)存在HBsAg编码区变异,其中2例为已知免疫逃逸变异;6例(15.38%)发生RT区和HBsAg编码区"镜像改变".结论 建立了一种新的扩增全长RT区(涵盖全长HBsAg编码区)的snPCR.该法结合直接测序法,可同时分析我国HBV A～D基因型已知和潜在的耐药变异位点.     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎中变异病毒株的动态变化

目的:建立定量检测及监测乙肝病毒DNA的rtM204I/V(YMDD)及rtL180M变异的方法.方法:以克隆、测序鉴定及构建乙肝病毒DNA YMDD及变异(YIDD和YVDD)质粒作为标准,4例接受拉米夫定治疗(100 mg/d,疗程48 wk以上)的慢性乙型肝炎患者血清标本为对象,用焦磷酸测序的方法检测变异位点核苷酸的频率,并计算变异株的含量比例,通过检测不同变异株类型的标准质粒,确定测序峰图的背景信号.结果:通过检测标准质粒后,确定背景信号为5%,变异位点调整后的核苷酸频率转化为变异病毒株的比例后,4例患者治疗前均检测出变异的病毒株(4.5%-33%),并且随治疗时间延长呈增多的趋势.病毒载量及ALT分析提示基因型耐药发生后,将发生病毒学反跳及临床耐药.结论:焦磷酸测序可以定量检测及动态监测变异病毒株的含量.拉米夫定耐药突变株在拉米夫定治疗前已存在,并随治疗时间的增加而增长,出现病毒学反弹及临床耐药.     

658例乙型肝炎患者HBV多位点耐药基因检测结果分析

目的分析乙型肝炎患者HBV核苷(酸)类似物耐药相关的10个位点的突变情况及其临床意义。方法采用焦磷酸测序法对658例各型乙型肝炎患者行核苷类似物抗乙肝病毒多位点耐药基因检测并分析不同核苷(酸)类似物耐药的突变形式,对常见突变模式者ALT和HBV-DNA水平进行比较。结果 300例发生不同位点变异,变异率为45.59%,其中有明确用药史者202例。拉米夫定耐药突变中以M204V和M204I最常见,前者通常伴随L180M突变,后者常单独出现;阿德福韦酯耐药中以N236T和A181位碱基替换为主;恩替卡韦耐药均伴随拉米夫定和阿德福韦酯耐药变异,以T184位点的碱基替换最为常见;主要变异模式间ALT及HBV-DNA水平均无明显差异。90例未接受过核苷(酸)类似物治疗者亦检出耐药相关突变。结论检测HBV多位点耐药基因相关突变有助于临床及时发现和确认乙型肝炎患者HBV耐药并指导抗病毒治疗。     

急性乙型肝炎患者血清HBV基因耐药变异及相关因素分析

目的了解急性乙型肝炎(AHB)患者感染HBV基因耐药相关变异性,并对变异相关因素HBV DNA、HBeAg、ALT、AST及TBil进行分析。方法收集AHB患者123例,提取血清HBV DNA对反转录酶(RT)基因区核苷(酸)类似物变异耐药突变10个位点进行检测,同时进行HBV DNA载量、HBeAg、ALT和AST检测。采用焦磷酸测序技术(pyrosequencing)进行DNA测序,数据分析采用PSQ-96MA型焦磷酸测序仪配套的分析软件进行。结果 123例患者中9例发生变异,检出率为7.32%,病毒以变异/未变异共存形式存在。变异位点和变异形式均以204V/I和181V为主,相关耐药主要为拉米夫定、替比夫定和阿德福韦酯。发生变异者与未发生变异者比较,HBV DNA载量、ALT、AST、TBil及HBeAg阴性率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论急性HBV感染者体内存在HBV核苷(酸)类似物耐药相关突变,自然变异与HBVDNA载量、ALT、HBeAg、TBil及AST无显著相关性。     

耐核苷(酸)类药物慢性乙型肝炎和肝硬化患者血清HBV基因型和P区耐药突变位点分析

目的了解慢性乙型肝炎和肝硬化患者HBV基因型分布和P区耐药突变位点的变异模式。方法选择39例经核苷(酸)类似物(NAs)治疗后存在耐药或疑似耐药的慢性乙型肝炎和肝硬化患者为研究对象,采用实时荧光定量PCR法测定血清HBV DNA,将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,鉴定和回收纯化后,交由上海生工生物工程(北京)有限公司进行测序,与HBVseq数据库比对,观察HBV基因型分布和耐药位点变化情况。结果 34例(87.2%)患者能检出HBV基因型,其中C基因型有32例(82.1%),B基因型有2例(5.1%);27例(69.2%)患者存在RT区序列突变,其中点变异12例(30.8%),rt M204I/V/S、rt A181V/T、rt I169T突变分别占15.4%、5.1%、10.3%,组合变异15例(38.4%);23例患者存在对NAs耐药,其中8例患者对阿德福韦酯耐药(1例为B基因型,7例为C基因型),耐药位点为rt A181V/T/S、rt V214A/E和rt N236T;11例患者对拉米夫定和替比夫定同时耐药,均为C基因型,其共同耐药位点为rt M204I/V/S和rt L180M;3例患者存在对LAM、LDT和恩替卡韦同时耐药,均为C基因型;1例C基因型患者对LAM、LDT和ADV同时耐药,其变异模式为rt M204I/V/S+rt A181V/T/S+rt L180M。结论多数对NAs耐药患者可在HBV P区检出基因突变,且突变形式多样,其中以rt M204I/V/S突变为主,不同核苷(酸)类似物中存在共同耐药位点。     

焦磷酸测序技术检测HBV基本核心启动子变异的研究

目的建立HBV基本核心启动子（BCP）区变异的快速检测方法。方法采用焦磷酸测序（pyrose-quencing）技术,设计一对引物,其中一条经生物素标记,PCR扩增产物含HBVBCPA1762T／G1764A双突变的区域,借用生物素包被葡聚珠纯化单链PCR产物,设计一条测序引物,运用焦磷酸测序技术对A1762T／G1764A两个变异点进行变异分析。通过对已知变异类型的HBV分离株进行测定分析,评价所建立方法的检测敏感性和特异性。结果PCR扩增后,可在2h内得到A1762T／G1764A两个变异点的突变情况。所建立方法的检测灵敏度达到HBV．DNA血清中的含量为10^3copies／ml;在所分析的HBVBCP区均可检测出变异株、非变异株及混合株,且所检测的结果与直接测序方法结果符合率为95％。结论Pyrosequencing技术用于检测病毒基因突变有高通量、自动化程度高和结果准确等特点,适用于对HBVBCP区突变进行快速高通量检测。     

一种新的HBeAg阴性慢性乙型肝炎病毒变异机制

目的 检测HBV核心启动子区(CP)基因变异方式.方法 自HBV慢性感染患者血清中提取HBV DNA,扩增CP区域序列,克隆入pMD19 T载体,选择阳性克隆进行DNA测序,与已知HBV基因相应序列比较患者体内HBV基因变异位点以及变异形式.结果 自21例患者中共挑选74个克隆测序,54个克隆中病毒基因序列CP区发生大段缺失突变,长度达234个核苷酸,另有1个克隆发生245个核苷酸缺失突变.缺失突变区域包括CP区、HBeAg起始密码子和直接重复序列(DR)Ⅰ区,命名为CP缺失突变,发生CP缺失突变的病毒株同时存在A1585T替换突变,这两个部位的突变具有联动特征.结论 观察到一种导致HBeAg阴性慢性乙型肝炎的新方式,即CP、HBeAg起始密码子缺失突变,并提出一种简明的CP缺失检测方式.     

1例多药耐药慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因突变的5年动态分析

目的 动态检测乙型肝炎患者HBV逆转录酶基因和前C及基本核心启动子(BCP)区基因突变,分析基因突变与核苷(酸)类似物耐药、HBeAg阴转的关系.方法 收集1例在我院14次住院治疗患者血清18份,提取DNA,采用巢式PCR法扩增HBV靶基因片段,对PCR产物进行DNA双向测序,NTI软件对比分析结果,分析逆转录酶基因12个耐药位点和前C/BCP区6个位点上的突变情况,结合临床资料解析突变意义.结果 先后检测到了引起拉米夫定耐药的M204I/V共生突变、L180M+M204V突变,引起恩替卡韦耐药的S202G突变,以及引起HBeAg阴转的G1896A突变,检测结果与临床病情发展情况符合.结论 采用DNA序列测定方法可以全面了解HBV基因突变,有助于临床监测病情发展,合理进行抗病毒治疗.     

应用PCR—SSCP银染技术检测HBV基因点突变

目的：为了对乙型肝炎患者HBV基因突变进行大大面积筛检,建立简便 可靠的检测HBV基因突变的方法。方法：采用单链构象多态性（SSCP）银染技术,检测HBV Pre-C基因突变。结果：在10份HBeAg阳性标本中,有8份PCR阳性,SSCP显示有2份标本有HBV Pre-C基因突变,直接测序证实为非终止密码突变。48份抗－HBe阳性标本中,有12份为PCR阳性,有8份SSCP显示PCR产物单链泳运动状态异常,其中4份标本经直接测序证实在1898位发生了G→A变异,出现了TAG终止密码突变。结论：PCR－SSCP银染技术检测HBV Pre-C基因点突变有很高的特异性和敏感性,该方法稳定、简便、快速,能基本满足临床大面积大样本筛检的需要。     

等位基因特异扩增实时定量PCR检测HIV的V106I耐药突变位点的方法建立

目的建立等位基因特异扩增实时定量聚合酶链式反应(ASPCR)检测艾滋病病毒(HIV)V106I耐药突变位点的方法,用于快速检测低比例的V106I突变。方法针对HIV的V106I多态性位点设计引物,建立检测方法。构建野生型和突变型质粒标准品,检测野生型质粒、突变型质粒和临床样本,评价方法的准确性、灵敏度和特异性。结果 5份接受抗病毒治疗的HIV感染者本底血清标本(2份存在V106I耐药突变位点,3份不存在V106I耐药突变位点),特异性引物扩增105野生型质粒和突变型质粒的循环阈值(Ct值)之差(△Ct)为10.26,ASPCR法能正确区分野生型和突变型质粒,临界值为9.26;对100%～0.01%的突变型质粒和野生型质粒混合物的检测显示,突变比例高于1%时得到相应的ΔCt值均9.26,根据标准曲线计算出的突变比例与理论值具有较好的吻合度,ASPCR法检测V106I突变的灵敏度可达到1%突变比例。结论建立的ASPCR方法可用于检测临床样本V106I耐药突变位点。     

替比夫定治疗慢性乙型肝炎患者52周HBV耐药分析

目的研究替比夫定(LdT)治疗基因C型慢性乙型肝炎(CHB)病人52周HBV耐药情况及变异位点。方法初治的基因C型CHB 40例(治疗前应用核酸扩增荧光定量及测序法进行耐药突变检测,HBV-P区均未测到耐药变异),给予LdT 600mg qd治疗52周。病人在治疗前及治疗后每3个月均做肝功、HBV血清学指标、HBV DNA定量检测(COBAS?TaqMan?,最低检测限300copies/ml)。选择LdT治疗52周HBV DNA>1 000copies/ml者,对其36周及52周血清再次进行HBV-P区耐药突变检测。结果 21例(52.5%)病人HBV DNA<300copies/ml,16例(40.0%)HBV DNA>1 000copies/ml,3例(7.5%)HBeAg阳性病人发生HBeAg血清学转换。10例(25.0%)52周检测到HBV-P区耐药突变,其中2例rtA181T变异,7例rtM204I变异,1例rtM204I+L180M变异。结论初治CHB病人,尤其是基线HBV DNA定量较高者,对LdT治疗有较高的耐药率,HBV基因可发生1个或多个位点耐药变异,rtM204I是LdT耐药的主要突变位点。     

乙型肝炎病毒多聚酶/反转录酶区耐药突变研究进展

目前临床最常用的抗乙型肝炎病毒(HBV)药物是核苷(酸)类似物(NAs),但长期使用可导致HBV发生基因突变引起耐药,导致治疗失败。HBV多聚酶/反转录酶(RT)区是NAs药物治疗作用的靶点,公认的耐药突变也都发生在RT区内。不同NAs药物的耐药形式往往不同,但也存在交叉耐药和多重耐药突变形式。深入观察抗病毒治疗过程中耐药突变及演变规律,分析各种突变形式的表型特点及其与临床表现的关系,用灵敏方法对患者病毒RT区耐药相关突变进行动态监测,早期发现HBV耐药,合理进行挽救治疗,对慢性乙型肝炎治疗具有重要意义。     

慢性乙型肝炎患者HBV核苷（酸）类似物预存耐药基因突变的研究

目的分析慢性乙型肝炎患者HBV核苷(酸)类似物(NAs)预存耐药基因变异的情况,提高慢性乙型肝炎防控水平。方法选择2016年7月至2017年9月于清远市人民医院感染科就诊的未经NAs治疗的慢性乙型肝炎患者600例,随机分成两组,观察组治疗前进行预存耐药基因检测,根据检测结果给予相应的NAs治疗,对照组300例不进行耐药检测,依患者意愿选择药物进行治疗,疗程72周。治疗期间对两组患者的HBV DNA转阴率、耐药率等进行检测对比。结果300例观察组患者中29例发生不同位点变异,变异率9.6%;包含与拉米夫定耐药相关的20例(69.0%),与替比夫定耐药相关的19例(65.5%),与阿德福韦酯耐药相关的7例(24.1%),同时发现4例对恩替卡韦主要耐药位点部分位点基因突变;观察组HBV DNA转阴率显著高于对照组,而耐药率则显著低于对照组。结论研究地区慢性乙型肝炎患者HBV NAs预存耐药基因变异主要发生拉米夫定、替比夫定及阿德福韦酯;在抗病毒治疗前检测耐药基因,可显著提高抗病毒治疗应答,减少原发耐药的发生。     

慢性乙型肝炎阿德福韦酯治疗应答不佳者外周血单个核细胞HBV-P区基因突变分析

目的研究阿德福韦酯（ADV）治疗基因C型慢性乙型肝炎（cHB）患者外周血单个核细胞（PBMcs）乙肝病毒聚合酶区（HBV—P区）序列的基因突变。方法14例基因c型CHB患者分为初治组（ADV初始治疗）7例,经治组（拉米夫定100mg口服每日1次,治疗24～56个月出现YMDD变异后换用ADV治疗）7例,ADV用药时间2～59个月,剂量10mg口服每日1次,血清HBVDNA≥1000copies／ml（应答不佳）者应用直接测序法检测血清及PBMCs内的HBV-P区基因突变,比较两者的异同。结果所有患者的血清和PBMCs内HBV均成功测序,大部分患者血清和PBMCs内的HBV序列一致。1例经治者和3例初治者感染的HBV为野生株,分别有11691＋＋＋V＋、Q215H＋＋＋Q＋、P237T＋＋＋突变。另10例（71．4％）检测到HBV有1个或多个耐药位点变异,主要变异位点为A181V／T／I、N236T。有1例血清HBV基因突变（A181T＋＋＋、N236T＋＋＋）与PBMCs内的HBV基因突变（A181T＋＋＋、N236T＋＋＋、11691＋＋＋V＋）不完全一致。结论ADV治疗cHB应答不佳者大部分血清与PBMCs内的HBV-P区基因突变一致,耐药模式不同,可有一个或多个位点突变,主要变异位点为A181V／T／I、N236T。     

HBV PRt204+180以外位点变异与拉米夫定耐药关系探讨

目的 探讨慢性乙型肝炎患者HBV P区常见耐药位点Rt204±180以外位点变异与拉米夫定耐药关系.方法 收集27例接受拉米夫定初治患者治疗基线和获得病毒学应答后出现病毒学反弹的血清标本,采用PCR产物直接测序技术,检测治疗基线和病毒学反弹时HBV DNA的P区变异位点,对位点变异与拉米夫定耐药关系进行分析.结果 HBV P区的rtA181V、rtM171R、rtN/H238T/A和rtI187V变异不伴随有P区rtM204V/1±rtL180M耐药位点的变异.结论 HBV P区的rtA181V、rtM171R、rtN/H238T/A和rtI187V变异可能是拉米夫定耐药的新变异位点.     

乙肝病毒核苷类似物耐药位点分析

目的:建立巢式PCR结合测序检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药位点的方法,确定患者的HBV基因型和耐药突变情况。方法:采用特异性引物进行巢式PCR扩增HBV DNA,产物测序后,利用MEGA 3.1对测序结果进行分析判断有无耐药突变的产生。结果:100例乙肝病毒载量阳性患者共检出48例有耐药突变,其中概率最高的是rt204位点的YVDD 15例、YIDD 13例;拉米夫定组的耐药概率明显高于对照组;耐药组的ALT和HBV DNA水平明显高于非耐药组。结论:传统的核苷类似物如拉米夫定会产生耐药,耐药一旦发生肝功能和HBV DNA会明显升高,巢式PCR结合测序法可对患者体内的HBV耐药突变位点进行有效检测,有利于指导临床用药。