中国人HNPCC家系中hMSH2基因新突变及其功能分析

目的:报道1个在中国人遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)家系中发现的基因突变,并对其功能进行分析.方法:抽提1组符合Amsterdam标准的HNPCC家系先证者和其他家系成员的基因组DNA,PCR扩增先证者hMLH1 19个外显子和hMSH2 16个外显子,利用变性高效液相技术(dHPLC)筛查,对异常峰型利用DNA测序方法检测基因突变.发现先证者hMSH2基因存在错义突变后,对家系中其他成员和50名散发性大肠癌患者和100名正常成年人进行相同位点的检测,以判定是单核苷酸多态性位点(SNP)还是突变.利用5对微卫星标记对该家系中的2例肿瘤进行微卫星不稳定分析,免疫组化检测蛋白表达,利用同源建模方法对发现的突变位点进行功能分析,以研究突变的病理意义. 结果:在该家系的2例结肠癌患者中均发现hMSH2基因第13外显子2 108位出现C-A的错义突变,导致703位Ser变异为Tyr,即C.2 108C>A(p.Ser703Tyr),微卫星结果显示2例肿瘤均为微卫星高度不稳定(MSI-H),肿瘤免疫组化结果显示hMSH1基因表达正常而hMSH2基因不表达.同源建模发现该位点与目前报道的hMSH2基因突变不同,突变位于第Ⅳ结构域,Ser突变为Tyr后空间位阻增大,影响了蛋白的正常折叠和功能.结论:Ser703Tyr是中国人HNPCC的一个新的病理性突变.     

遗传性非息肉病性结直肠癌患者hMLH1和hMSH2基因的突变规律

目的 探讨中国人遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)患者hMLH1与hMSH2基因的突变特点.方法 对76个HNPCC家系先证者的DNA样本用PCR法扩增其hMLH1与hMSH2基因的35个外显子,再进行测序以确定突变类型.结果 (1)25个样本发现hMLH1或hMSH2基因突变,总突变率为33%(25/76);(2)检测到的22种突变中:hMLH1基因突变16个,hMSH2基因突变6个;(3)突变类型包括移码突变、无义突变、剪接区突变、错义突变,其中错义突变较多见(hMLH1基因错义突变11个、hMSH2基因5个).结论 中国人HNPCC家系hMLH1和hMSH2突变谱广泛,突变类型多样,hMLH1突变较hMSH2突变多见.     

毒蕈碱型胆碱能受体M3调控肝癌细胞侵袭转移的研究

目的 探讨毒蕈碱型胆碱能受体M3 (muscarinic cholinergic receptors 3,ChRM3)活化对人肝癌细胞侵袭、转移能力的影响及其分子机制.方法 Western blot检测两种人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721中ChRM3受体的表达;采用氯贝胆碱(Beth)及达菲那新(UK88525)处理肝癌HepG2和SMMC-7721细胞,分为空白对照组、Beth组、Beth+UK88525组、UK88525组,经处理48 h后,Transwell 实验检测两种肝癌细胞经不同分组处理后侵袭、迁移能力的变化,Western blot检测各组细胞中上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)标志蛋白的表达及下游信号通路PI3K/Akt的变化;采用shRNA干扰质粒经Lipofectamine 2000TM转染肝癌细胞HepG2以沉默ChRM3,分为空白对照组、Beth组、Beth+shChRM3组、shChRM3组,分别检测细胞的侵袭、转移能力及EMT、下游PI3 K/Akt的改变.结果 HepG2和SMMC-7721两种肝癌细胞中均有ChRM3受体的表达;Transwell实验显示:Beth单独处理组对肝癌细胞的迁移和侵袭有明显的促进作用,而UK88525能够抑制Beth对肝癌细胞迁移侵袭能力的促进作用(P＜0.05);Western blot结果显示:Beth单独处理组能够上调EMT标志蛋白N-Cadherin和Vimentin,下调E-Cadherin的表达,UK88525处理后能够明显抑制Beth促进HepG2细胞EMT的过程(解除Beth对HepG2细胞EMT的促进过程),同时也能够抑制PI3K/Akt的活化(P＜0.05);干扰质粒沉默ChRM3受体同样能够抑制Beth促肝癌细胞迁移、侵袭的作用,并且抑制Beth诱导的EMT和下游PI3K/Akt的活化(P＜0.05).结论 ChRM3活化能够通过PI3K/Akt信号通路促进肝癌细胞的侵袭和转移.     

无hMLH1/hMSH2生殖系突变的遗传性非息肉病性结直肠癌3家系报道

目的:考察遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)家系hMLH1/hMSH2生殖系突变的情况.方法:选择13个符合Amsterdam标准的HNPCC家系中的先证者,利用DNA 测序检测hMLH1/hMSH2基因突变情况.对其中不携带hMLH1/hMSH2生殖系突变的HNPCC 家系,利用免疫组化检测hMLH1/hMSH2基因表达、PCR-SSCP检测先证者肿瘤组织的微卫星不稳定性(MSI).结果:13个HNPCC家系的先证者中有3例检测不到hMLH1/hMSH2的生殖系突变.3例无hMLH1/hMSH2突变的先证者中,肿瘤组织的微卫星不稳定检测均为MSI-H,免疫组化检测hMLH1/hMSH2基因表达正常.结论:3个严格符合Amsterdam标准的HNPCC家系中未发现hMLH1/hMSH2基因系突变,提示可能存在其他基因突变导致该3个家系HNPCC肿瘤发生.     

遗传性非息肉病性结直肠癌8个家系临床及病理分析

目的分析遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）家系临床及病理特点。方法收集符合Amsterdam标准Ⅱ的8例HNPCC家系资料,绘制家系图谱。结果HNPCC发病率为1.59%,8个HNPCC家系总发病人数为31例,其中结直肠癌患者为25例,肠外相关肿瘤6例,8例先证者中6例为女性,2例为男性,4例发病年龄小于40岁,发病部位位于右半结肠为2例,左半结肠3例,直肠3例,组织学分型以中至低分化腺癌为主;均未出现淋巴结及远处转移;8例先证者错配修复（MMR）蛋白表达异常的为5例。结论HNPCC先证者发病年龄轻,组织学分型较好,家系成员发病率高,对其家族成员进行定期检查和及时治疗将能有效地预防其发生并降低死亡率;MMR基因突变检测对提高HNPCC的诊断起重要作用。     

胰岛素受体底物—1基因3′非翻译区的突变与中国人2型糖尿病的关系

目的：研究胰岛素受体底物－1（IRS－1）基因3′非翻译区的突变与中国2型糖尿病的关系。方法：采用PCR－SSCP技术扫描120例中国2型糖尿病患者和120例正常对照的IRS－1基因3′非翻译区序列，所有SSCP变异的样品进行DNA测序分析。结果：SSCP分析存在假阳性结果。测序未发现有基因突变。结论：IRS－1基因3′非翻译区的突变不是引起中国人2型糖尿病的重要遗传因素。     

遗传性非息肉病性结直肠癌患者的临床特点及hMSH2与hMLH1种系突变的筛查

目的　分析我国遗传性非息肉性结直肠癌 (HNPCC)患者的临床特点 ,报告hMSH2和hMLH1基因突变筛查结果。方法　共收集了 2 8个家系 ,其中 15个家系符合阿姆斯特丹Ⅰ标准 ,13个家系符合日本临床诊断标准。记录的数据包括患者性别 ,结直肠癌发生的部位 ,诊断年龄 ,是否具有同时和 /或异时结直肠癌及结肠外癌 ,肿瘤的组织病理特点等。通过PCR及变性高效液相色谱分析(DHPLC)筛查hMSH2和hMLH1基因的突变 ,然后对DHPLC图形异常的样本进行测序。结果　 12 6例患者共诊断 170例次恶性肿瘤 (2 3例患有多原发癌 )。 98例 (77 8% )的患者患有结直肠癌 ,且发病年龄早 (平均 4 5 9岁 ) ,右侧癌多见。共在 12个家系中发现 8种hMSH2或hMLH1基因序列改变 ,其中hMSH2基因的第 3个外显子的无义突变即G2 0 4X是发现的首例我国蒙古族家系错配修复 (MMR)基因突变。结论　HNPCC患者是恶性肿瘤 (尤其是结直肠癌 )的高发人群。DHPLC是一种非常有效的筛选hMSH2和hMLH1基因突变的方法。在我国hMLH1基因尤其是其前九个外显子的突变较hMSH2基因的突变更常见。     

遗传性非息肉病性结直肠癌患者的临床特点及hMSH2与hMLHl种系突变的筛查

目的 分析我国遗传性非息肉性结直肠癌(HNPCC)患者的临床特点，报告hMSH2和hMLHl基因突变筛查结果。方法 共收集了28个家系，其中15个家系符合阿姆斯特丹Ⅰ标准，13个家系符合日本临床诊断标准。记录的数据包括患者性别，结直肠癌发生的部位，诊断年龄，是否具有同时和／或异时结直肠癌及结肠外癌，肿瘤的组织病理特点等。通过PCR及变性高效液相色谱分析(DHPLC)筛查hMSH2和hMLHl基因的突变，然后对DHPLC图形异常的样本进行测序。结果 126例患者共诊断170例次恶性肿瘤(23例患有多原发癌)。98例(77．8％)的患者患有结直肠癌，且发病年龄早(平均45。9岁)，右侧癌多见。共在12个家系中发现8种hMSH2或hMLHl基因序列改变，其中hMSH2基因的第3个外显子的无义突变即G204X是发现的首例我国蒙古族家系错配修复(MMR)基因突变。结论 HNPCC患者是恶性肿瘤(尤其是结直肠癌)的高发人群。DHPLC是一种非常有效的筛选hMSH2和hMLHl基因突变的方法。在我国hMLHl基因尤其是其前九个外显子的突变较hMSH2基因的突变更常见。     

鼠脑M—胆碱能受体测定及环类抗抑郁剂的作用

采用放射配基受体结合分析法,测定健康大白鼠前脑M—胆碱能受体,并观察环类抗抑郁剂对M—受体亲和力的结果。结果显示,在~3H—二苯羟乙酸奎宁酯0.05～4.0nmol 浓度范围内有1个结合位点,其B_(max)=16.7pmol/mg蛋白,Kd=0.38nmol。环类抗抑郁剂竞争结合实验表明,抗抑郁剂有较强的抑制作用,按抑制常数(Ki)顺序为阿米替林>多虑平>丙咪嗪>氯丙咪嗪>麦普替林。竞争抑制的Hill 系数接近1,提示抗抑郁剂与M 受体结合是双分子无协同作用的反应。     

前列腺组织中M受体亚型的表达及意义

目的检测不同前列腺组织中M1、M2、M3受体亚型的表达,分析其在前列腺肿瘤发生发展中的作用。方法取正常前列腺、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌标本各36例。采用蛋白免疫印迹（Western blot）方法分别检测各组标本中M1、M2、M3受体,免疫组织化学染色法检测人白细胞分化抗原34（CD34）的蛋白表达;逆转录聚合酶链反应（RT PCR）检测各组标本中M3受体的基因表达。结果Western blot检测结果显示,正常前列腺组织中M2受体表达（0.334?8±0.151?5）高于M1与M3（0.18±0.08;0.27±0.11）,P＜0.001;BPH组织M2与M3受体表达（0.36±0.15;0.37±0.15）高于M1（0.18±0.07）, P＜0.001,前列腺癌组织中M3受体表达（0.48±0.16）高于M1与M2（0.20±0.05;0.41±0.12）,P＜0.001;RT PCR结果显示,前列腺癌组织M3受体的基因表达（0.84±0.19）高于BPH组织（0.67±0.16）和正常前列腺组织（0.54±0.16）,P＜0.001。免疫组化结果显示,CD34蛋白表达在前列腺癌组织微血管密度（44.89±8.43）高于BPH组织（18.44±7.10）,在正常前列腺组织表达最低（10.97±4.48）,P＜0.05。结论M1、M2、M3 3种受体在不同前列腺组织中有不同程度的表达,其中M3受体表达变化最大,与前列腺肿瘤的发生、发展关系密切。     

结直肠癌KRAS、BRAF及PIK3 CA基因突变的检测及内在关系

目的：检测结直肠癌组织KRAS、BRAF及PIK3CA基因突变情况,并分析其内在关系。方法：收集内蒙古巴彦淖尔市医院普外一科2011年3月至2011年8月结直肠癌手术切除标本41例,提取DNA经PCR扩增后,检测KRAS、BRAF和PIK3CA基因的突变情况,分析结直肠癌组织KRAS、BRAF及PIK3CA基因突变间的内在关系。结果：（1）15例患者的KRAS基因发生突变,突变率36．6％,5例患者的BRAF基因发生突变,突变率12．2％,7例患者的PIK3CA基因发生突变,突变率17．1％。（2）BRAF基因突变者共5例,全部为KRAS野生型的患者;PIK3CA基因突变者共7例,其中3例（42．9％）为KRAS野生型的患者,4例（57．1％）为KRAS突变型的患者;BRAF与PIK3CA基因不存在共突变。结论：（1）结直肠癌患者KRAS基因突变率较高,有必要进行常规检测。（2）KRAS野生型患者中部分患者的BRAF基因突变可能是促进结直肠癌发生发展的原因之一。 PIK3CA与KRAS基因的共突变可能促进了结直肠癌发生发展。     

Ⅱ型遗传性出血性毛细血管扩张症ALK1基因突变鉴定及血浆凝血酶调节蛋白表达

目的 分析和确定遗传性出血性毛细血管扩张症(HHT)的临床表型。寻找鉴定HHT家系致病基因AIK1基因突变位点,建立HHT的基因诊断方法。方法 用鼻内镜直视并动态摄影观察先证者鼻腔黏膜扩张的毛细血管,并进行遗传史的家系调查;用聚合酶链反应(PCR)扩增先证者AIK1基因3、7、8号外显子,并进行PCR产物核苷酸测序。确定突变位点后,扩增2例正常人及HHT家系成员(4例)的对应基因区域并行核苷酸序列分析。用Western印迹技术对先证者及家系成员血浆中凝血酶调节蛋白(TM)进行检测,并对Western印迹结果进行灰度扫描,以半定量TM水平。结果 该家系5名成员中,除无血缘关系的先证者弟媳外,其余4例均有不同程度的鼻出血或其他部位出血史;先证者及其父亲分别有明显的鼻黏膜或手指皮肤的毛细血管扩张;基因筛查结果显示：先证者,先证者弟弟及其父亲均在ALK1基因8号外显子第1231位核苷酸存在C—T突变(CGG-IICB),而先证者弟媳和侄儿未检测到1231位核苷酸的C—T变异,正常人不存在该位点的核苷酸变异。Western印迹技术分析血浆TM表达显示分子量在56000处,2例正常对照,与3例HHT患者灰度扫描平均值分别为218．3和174．1;在28000处,2例正常对照,与3例HHT患者灰度扫描平均值分别为222．0和145．1,HHT患者血浆中TM蛋白含量明显低于正常人。结论 在中国的Ⅱ型HHT患者存在ALK1基因突变,突变位点位于8号外显子cC231T。HHT患者血浆中TM水平有降低趋势,其意义及机制尚待进一步确定。     

Involvement of M3 cholinergic receptor signal transduction pathway in regulation of the expression of chemokine MOB-1, MCP-1 genes in pancreatic acinar cells

Summary Whether M3 cholinergic receptor signal transduction pathway is involved in regulation of the activation of NF-κB and the expression of chemokine MOB-1, MCP-1 genes in pancreatic acinar cells was investigated. Rat pancreatic acinar cells were isolated, cultured and treated with carbachol, atropine and PDTCin vitro. The MOB-1 and MCP-1 mRNA expression was detected by using RT-PCR. The activation of NF-κB was monitored by using electrophoretic mobility shift assay. The results showed that as compared with control group, M3 cholinergic receptor agonist (10⁻³ mol/L, 10⁻⁴ mol/L carbachol) could induced a concentration-dependent and time-dependent increase in the expression of MOB-1, MCP-1 mRNA in pancreatic acinar cells. After treatment with 10⁻³ mol/L carbachol for 2 h, the expression of MOB-1, MCP-1 mRNA was strongest. The activity of NF-κB in pancreatic acinar cells was significantly increased (P<0.01) after treated with M3 cholinergic receptor agonist (10⁻³ mol/L carbachol)in vitro for 30 min. Either M3 cholinergic receptor antagonist (10⁻⁵) mol/L atropine) or NF-κB inhibitor 10⁻² mol/L PDTC) could obviously inhibit the activation of NF-κB and the chemokine MOB-1, MCP-1 mRNA expression induced by carbachol (P<0.05). This inhibitory effect was significantly increased by atropine plus PDTC (P<0.01). The results of these studies indicated that M3 cholinergic receptor signal transduction pathway was likely involved in regulation of the expression of chemokine MOB-1 and MCP-1 genes in pancreatic acinar cellsin vitro through the activation of NF-κB. ZHENG Hai, male, born in 1972, M. D., Ph. D.     

GR6基因的结构特征以及在结直肠肿瘤中的表达

目的:了解GR6基因及其蛋白质产物GR6假设蛋白的结构特征,以及GR6基因在结直肠肿瘤中的表达改变.方法:采用生物信息学的软件和数据库,分析GR6基因的结构特点及其蛋白质产物GR6假设蛋白的二级结构特征和功能特点等,并采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法,检测39例结直肠癌组织和配对的远端切缘正常组织,以及19例癌旁组织和14例腺瘤组织中GR6的转录表达水平.结果:序列分析表明,GR6基因由3个外显子组成,含有4个CpG岛,编码产物为149个氨基酸组成的GR6假设蛋白.用生物信息学分析发现,GR6假设蛋白含有1个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪蛋白激酶II磷酸化位点和3个N-肉豆蔻酸化位点及核定位信号,提示GR6基因的表达产物可能是细胞核内的一种信号分子.mRNA水平上,GR6的转录表达水平从正常-癌旁-腺瘤-腺癌逐步递减,其中,正常与腺瘤(P<0.05)、正常与腺癌(P<0.01)的表达差异具有显著意义.结论:GR6基因的表达产物即GR6假设蛋白可能是细胞核内的一种信号分子.GR6基因在结直肠肿瘤中低表达,在结直肠肿瘤的发生、发展过程中可能起着重要的作用.     

精神分裂症与多巴胺D4基因和5-羟色胺2A受体基因的关联分析

目的探讨湖南地区汉族人群多巴胺D4受体（DRD4）基因和5-羟色胺2A（5-HT2A）受体基因与精神分裂症遗传易感性的关系及其相互作用对精神分裂症的影响。方法81例精神分裂症患者单一用氯氮平治疗6—8周，利用阳性与阴性症状量表（PANSS）评定氯氮平的疗效，并根据量表的减分率将患者分为有效和无效两组。采用聚合酶链式反应（PCR）及限制性片段长度多态性（RFLP）技术检测患者组和对照组DRIM基因48bp可变串联重复（VNTR）多态性及5-HT2A受体基因T102C多态性的基因型及等位基因的频率。结果有效组患者DRIM＊3／5基因型（DRIM＊3／5）频率（40．3％）明显高于对照组（23．9％）。DRIM＊3等位基因携带者中，精神分裂症5-HT2A受体基因的A2等位基因频率（50．0％）显著高于对照组（30．0％）；非DRD4＊5／5携带者中，精神分裂症5-HT2A受体基因的A2／A2基因型（22．0％）及A2等位基因频率（48．8％）显著高于对照组（5．0％；32．5％）。结论DRD4基因48bpVNTR多态性可能与精神分裂症的某些亚型（对氯氮平有效者）遗传易感性相关。DRD4基因和5-HT2A受体基因可能存在交互作用，DRD4＊非5／5基因型及携带DRIM＊3等位基因者可能影响5-HT2A受体基因A2等位基因及A2／A2基因型与精神分裂症关系。     

卵巢早衰患者FSHR C1555A和LHR C1660T基因突变的检测

①目的探讨促性腺激素受体（包括FSHR和LHR）基因突变与卵巢早衰的关系。②方法选择56例湖南籍卵巢早衰妇女为观察组,30例因子宫肌瘤、宫外孕、继发性不孕等疾病住院的月经周期正常的妇女作为对照组。每例抽取外周血5mL,先用氯仿抽提法提取白细胞基因组DNA,然后用PCR-RFLP的方法检测FSHR基因第10外因子是否存在C1555A突变,以及LHR基因第11外显子是否存在C1660T突变。③结果观察组和对照组的基因组DNA FSHR第10外显子的第1555位均为C而不是A,LHR第11外显子的1660位均为C而不是T。④结论 FSHR基因第10外显子的C1555A突变以及LHR基因第11外显子的C1660T突变中国湖南籍卵巢妇女中未检测到。     

M-CSF及其受体在肿瘤细胞系中的表达

本文使用免疫酶标技术ＡＢＣ法研究了ＨＬ６０,ＭＧＣ８０和ＭＣＦ７三个细胞系中ＭＣＳＦ及其受体的表达,结果表明,在ＨＬ６０和ＭＣＦ７细胞系中,ＭＣＳＦ和ＭＣＳＦ受体在细胞膜、细胞质和细胞核中均有表达,而ＭＧＣ８０细胞系的ＭＣＳＦ和ＭＣＳＦ受体只在细胞膜和细胞质中出现阳性表达,而细胞核未见阳性表达。ＭＣＳＦ和ＭＣＳＦ受体在上述细胞系中,其表达可能暗示上述细胞系存在自分泌现象。此外,本文还讨论了ＭＣＳＦ及其受体的核内分布的可能机制及其意义。