人TLR2胞外区基因的原核表达及其抗体的制备

目的: 在原核系统中表达人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的融合蛋白并制备多克隆抗体.方法: 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增TLR2胞外区基因, 将其克隆到表达载体pET-32a( )上构建重组原核表达质粒, 并在大肠杆菌中诱导表达, 目的融合蛋白经Ni-NTA亲和层析纯化, 用SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定.用纯化的蛋白免疫新西兰白兔, 制备多克隆抗体, 采用Western blot对抗体进行鉴定, 并用ELISA分析抗体活性.结果: 成功构建了pET-32a( )-TLR2重组表达质粒并在大肠杆菌中进行表达, 获得了纯化重组蛋白, 重组蛋白免疫白兔后能够有效地刺激抗体产生, 并具有良好的免疫活性.结论: 成功地获得人TLR2胞外区基因的融合蛋白, 制备的多克隆抗体为进一步研究TLR2胞外区的功能和生物活性奠定基础.     

重组人白细胞介素21的制备及免疫学活性分析

目的:纯化制备rhlL-21,并分析其免疫学活性.方法:在含重组质粒pGEX4T-2/IL-21的大肠杆菌DH5a中,经IPTG诱导表达出GST-融合蛋白,蛋白经过一系列的纯化,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度.用MTT法研究rhIL-21对T细胞增殖、NK细胞杀伤活性的影响.结果:表达出了可溶性融合蛋白,纯化后的rhIL-21纯度达95%.rhIL-21能促进T细胞增殖,能增强NK细胞杀伤活性.结论:成功制备了rhIL-21,其在体外具有一定的免疫学活性,为其大量制备和体内的生物学活性研究奠定了基础.     

翻译控制肿瘤蛋白TPT1的原核表达、纯化、抗体制备和初步应用

目的:原核表达并纯化翻译控制蛋白TPT1,免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法:构建原核表达质粒pRSE-TA2-TPT1,转化大肠杆菌BL21(DE3),TPT1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果:在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的TPT1融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫大白兔,获得了高特异性的抗TPT1抗血清。结论:成功构建原核表达质粒pRSETA2-TPT1,表达并纯化TPT1蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体.为进一步研究TPT1在肿瘤等疾病发生、发展过程及治疗中的作用奠定基础。     

人高迁移率族B1蛋白原核表达、纯化及抗体制备和初步应用

目的:原核表达并纯化人高迁移率族B1蛋白(HMGB1)免疫日本大耳白兔制备其抗体.方法:构建原核表达质粒pRsetA2-HMGB1, 转化大肠杆菌BL21(DE3), HMGB1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.融合蛋白通过Ni2 -NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清.以间接ELISA法检测抗体效价, Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性.结果:成功构建原核表达质粒, 表达并纯化HMGB1蛋白.ELISA检测抗体效价为1∶ 16 000以上, Western blot和免疫荧光染色确定抗体具有高度特异性.结论:HMGB1蛋白和抗体的成功制备, 为下一步研究将HMGB1作为肿瘤等疾病治疗的新靶点奠定基础.     

兔抗人Rig-I蛋白N端CARD结构域多克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备人维甲酸诱导基因I(hRig-I)N端CARD结构域(hRig-I-N)多克隆抗体.方法:从逆转录病毒载体MigRI-hRig-I中扩增hRig-I基因N端CARD结构域852 bp长度的基因片段,克隆入pGEX-4T3中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,表达GST-hRig-I-N融合蛋白,将表达的融合蛋白纯化,免疫家兔制备抗体,并以间接ELISA法测定抗体效价,以Western blot、细胞免疫荧光方法鉴定抗体的特异性.结果:在大肠杆菌中成功表达融合蛋白GST-hRig-I-N,ELISA法检测抗体的效价达到1:125 000,Western blot及细胞免疫荧光检测结果显示抗体可与原核及真核表达的hRig-I-N蛋白特异结合.结论:制备了高效价、高特异性的hRig-I-N抗体,为进一步研究hRig-I-N的功能奠定了基础.     

HIV-1病毒Nef基因克隆、表达、纯化及其抗体的制备

目的:运用基因工程方法制备HIV-1 Nef重组蛋白及其抗体.方法:用PCR技术从HIV-1 H×B2质粒中扩增HIV-1 Nef基因,将测序鉴定过的HIT-1 Nef基因克隆到原核表达载体pET28a( )上,应用酶切鉴定、测序、SDS-PAGE及Western blot等方法鉴定基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.纯化的重组蛋白免疫兔3次后,ELISA法测定兔多克隆抗体滴度.用其制备的多克隆抗体通过免疫组织化学方法测定表达Nef基因的内皮细胞.结果:成功地构建了Nef基因的原核表达质粒,测序证明HIV-1 Nef基因全长为621 bp,编码206个氨基酸.在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白为包涵体的形式.HIV-1 Nef蛋白N端融合6×His标签便于纯化及鉴定.获得的高纯度HIT-1 Nef融合蛋白,免疫动物后,可产生特异的高滴度抗体(ELISA滴度达1∶10000).将转染Nef基因的内皮细胞,应用免疫组化的方法证明其抗体有高度的特异性.结论:构建了高表达HIT-1 Nef蛋白的原核表达系统,制备的Nef重组蛋白免疫动物,获得了特异、高效价的抗体,为研究Nef基因的生物学活性提供了实验材料和依据.     

人促血液血管细胞生成素的原核表达及兔抗体的制备

目的:表达人促血液血管细胞生成素(hemangiopoi-etin,HAPO)蛋白并制备兔抗HAPO抗体。方法:利用硫氧还原蛋白TrxA融合表达载体(pET32c),表达可溶性HAPO。表达的HAPO融合蛋白经亲和层析快速纯化,并通过Westernblot进行鉴定。以纯化的人HAPO免疫新西兰大白兔,制备抗体并测定其效价。结果:获得高效表达并纯化的HAPO蛋白。制备的兔抗人HAPO抗体的免疫双扩散的效价为1∶8。结论:建立了HAPO基因的原核表达载体和快速纯化体系并制备出兔抗HAPO的抗体,为研制检测HAPO的ELISA试剂盒奠定了基础。     

新疆出血热病毒核蛋白多克隆抗体的制备及其免疫学评价

目的 原核细胞中表达、纯化新疆出血热病毒BA88166毒株核蛋白(NP)并制备及鉴定抗NP蛋白的多克隆抗体.方法 采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出BA88166毒株S基因的cDNA片段,将其构建到原核表达载体pET-32a上,形成重组原核表达质粒pET-88166S.构建好的质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,经镍柱亲和层析法纯化NP-His融合蛋白,SDS-PAGE分析蛋白相对分子质量(Mr).用该纯化蛋白免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blot法检测血清效价和特异性.结果 双酶切鉴定和DNA测序证实构建的pET-88166S重组表达载体正确,目的基因序列与GenBank中公布的序列一致,在E.coli BL21中表达的NP-His融合蛋白经SDS-PAGE分析,其Mr约为66000.ELISA检测抗体效价高于1:25600,蛋白免疫印迹实验结果表明抗体能特异性识别新疆出血热病毒YL04057毒株的NP蛋白及其截短蛋白.结论 成功获得新疆出血热病毒NP-His融合蛋白,得到了特异性兔抗NP蛋白多克隆抗体.     

人DcR3融合蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:制备DcR3融合蛋白及其多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法:将亚克隆构建的pET28a( )/DcR3重组表达质粒转化入大肠杆菌(E.coli)BL21菌株,IPTG诱导表达,镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析蛋白产物,将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果:pET28a( )/DcR3重组表达质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为33000的目的蛋白,表达量约占菌体蛋白总量的38%,纯化后的目的蛋白纯度达98%。Western blot显示纯化蛋白与抗DcR3单克隆抗体(mAb)具有良好的反应性。纯化后多克隆抗体效价达1.28×10-6。结论:DcR3蛋白在E.coli中得到高效表达,成功制备高纯度DcR3蛋白及高效价抗DcR3多克隆抗体,为研究DcR3在组织中的表达、分布,研制ELISA试剂盒以检测恶性肿瘤及自身免疫性疾病等患者血清DcR3表达水平提供实验基础。     

PPM1A蛋白的表达纯化及鼠多克隆抗体制备研究

目的 表达、纯化PPM1A-His融合蛋白及制备鼠多克隆抗体.方法 将pBEX1-PPM1A-His原核表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS内进行诱导表达,用纯化的PPM1A-His融合蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,并用ELISA、免疫组化和免疫荧光检测抗体的灵敏度和特异性.结果 成功表达并纯化了PPM1A-His融合蛋白,纯化后纯度可达90%;ELISA法测定抗体效价为1:100 000;免疫组化和免疫荧光结果显示所制备的抗体可特异性检测肝和肝癌细胞的PPM1A.结论 获得的PPM1A鼠多克隆抗体有较高的效价和特异性,为PPM1A在肝癌的相关研究打下了基础.     

丙型肝炎病毒非结构区NS3基因在大肠埃希菌中的可诱导性表达

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）NS3基因的原核细胞表达载体。实现在大肠埃希菌中的可诱导性表达。方法 应用聚合酶链反应（PCR）技术，以美国HCV-H株全长cDNA质粒为模板，扩增获得NS3基因片段，克隆到原核表达载体pET-30C( )中，构建原核表达载体pET-NS3，转化BL21（DE3）宿主菌，以IPTG诱导，获得NS3蛋白的可诱导性表达，以HCVNS3的单链可变区抗体（ScFv)证实表达的NS3蛋白的特异性，结果 以HCVNS3基因序列特异性引物，PCR扩增获得1893bp的NS3DNA征段，插入pET-30C( )表达载体，转化BL21（DE3）受体菌，经培养，IPTG诱导，获得了重组HCVNS3蛋白的表达，以HCVNS3的ScFv证实了表达的重组蛋白HCVNS3的特异性。结论 以大肠埃希菌表达了HCVNS3的重组蛋白质。     

人精胺氧化酶的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆、原核表达有酶活性的重组人精胺氧化酶(SMO)蛋白,并制备兔抗人SMO多克隆抗体.方法:采用RT-PCR法从人非小细胞肺腺癌A549细胞株总RNA中克隆人精胺氧化酶cDNA,构建SMO原核表达质粒pET-15b/SMO.将SMO原核表达质粒转化E.coli的BL21(DE3)菌并使用IPTG诱导重组SMO表达.表达的蛋白产物经Ni-NTA亲和层析纯化、透析复性后,化学荧光法测定其酶活性.使用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、纯化重组人SMO蛋白,以此蛋白作为抗原皮内接种日本大耳白兔来制备抗人SMO多克隆抗体.分别以ELISA、Western blot和免疫细胞化学法检测兔血清中抗体的滴度和抗原特异性.结果:纯化并透析复性后的重组人SMO蛋白具备快速氧化精胺的酶活性.用此重组蛋白制备的抗体具有较高抗体滴度和针对人SMO的特异性.结论:建立了人SMO原核表达、纯化系统,获得了有酶活性的高纯度人SMO蛋白并成功制备了兔抗人SMO的多克隆抗体,为以SMO为靶点的抗肿瘤基础和临床研究提供了有力的研究工具.     

抗HER2单链抗体融合凋亡蛋白对SKOV3细胞的靶向杀伤

目的：探讨分泌表达的抗HER2单链抗体与重构型人caspase—3融合蛋白对HER2抗原阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。方法：将重构型人caspase—3基因亚克隆人pCMV—eDscFv—PEII—PEIII的相应位点，构建重组真核表达载体pCMV—e23scFv—PEII—revcasP3，并转染人T淋巴瘤细胞系Jurkat，筛选并建系。用ELISA检测培养上清中融合蛋白的分泌表达。通过共培养实验观察含有该融合蛋白的培养上清对人卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用。结果：融合蛋白基因可在Jurkat细胞中，分泌表达并杀伤SKOV3细胞。结论：分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人caspase3融合蛋白能够靶向诱导SKOV3细胞死亡。     

人MBL-CLR表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）胶原样区（CLR）蛋白。方法：应用PCR技术,从含中国人野生型MBLcDNA的质粒pGEM-MBL中扩增CLR基因片段,将其克隆至pET32a原核表达载体后,转化E.coliBL21（DE3）感受态菌株诱导表达CLR蛋白。通过Ni^2＋-NTA琼脂糖柱层析纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA法进行鉴定。结果：从重组质粒pGEM-MBL中扩增到长约180bp的DNA片段。构建的重组表达载体经BamHⅠ和HindⅢ酶切后出现约5900bp和180bp的片段,测序结果同预期的结果完全一致。重组质料在大肠杆菌中诱导表达后,纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳出现Mr约为30000、60000和120000的3条带。Western blot分析表明,3条蛋白带均可与抗His抗体起反应,3条蛋白带对应于融合蛋白的单体和寡聚体。ELISA检测证实,纯化的蛋白能与鼠抗重组人MBL蛋白抗体结合。结论：获得可表达人MBL-CLR的大肠杆菌菌株和重组的人MBL-CLR-Trx融合蛋白,为MBL分子结构、功能关系的进一步研究提供了条件。     

人LC3蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其抗体的制备与鉴定

目的:制备兔抗人LC3的多克隆抗体,为细胞自噬的研究提供有用的检测工具。方法:构建pET32a(+)LC3的原核细胞表达载体并进行序列鉴定,大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达LC3蛋白,SP-Sepharose XL柱纯化;纯化的人LC3蛋白免疫兔制备抗血清,通过LC3蛋白偶联的Sepharose 4B(LC3-Sepharose 4B)亲和层析纯化兔抗人LC3的多克隆抗体,以间接ELISA和Western blot鉴定其特异性。结果:成功实现了LC3蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化,并用质谱分析证明表达蛋白相对分子质量(Mr)为15 500。制备的兔抗人LC3多克隆抗体具有很高的特异性,与大肠杆菌成分无交叉反应。Western blot能够特异检测自噬过程中LC3Ⅰ型和Ⅱ型蛋白,观察到自噬发生时LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化。结论:获得了重组人LC3蛋白,成功地制备了该分子的特异性多克隆抗体,为细胞自噬的检测提供了有用的探针。     

猪FMDV受体β3亚基配体结合域的基因克隆及其多克隆抗体制备

目的:克隆猪FMDV受体β3亚基的配体结合域(LBD)基因,利用原核细胞表达β3亚基的LBD片段,纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体.方法:利用RT-PCR方法从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆β3亚基的LBD基因,将其与pGEM T-easy载体相连构建pGEM/β3LBD,经BamH Ⅰ/Xho Ⅰ酶切后回收β3LBD片段,与同样酶切处理的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β3LBD,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达β3LBD蛋白.纯化目的蛋白后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体.通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性.结果:猪β3亚基的LBD基因含有507个核苷酸,编码169个氨基酸,猪β3 LBD基因与牛、人、黑猩猩、猕猴、马、犬、挪威大鼠、家鼠、和鸡的β3 LBD基因核苷酸序列同源性分别为90.3%、92.3%、92.1%、91.3%、90.5%、90.3%、87.8%、85.2%、79.5%.哺乳动物的β3亚基LBD基因同源性较高,与鸡的同源性较低.实现了重组猪β3 LBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)约为44 000,制备的兔多克隆抗体效价达1:12800以上.结论:实现了猪FMDV受体β3 LBD的基因克隆、原核表达和多克隆抗体的制备,为深入研究受体β3亚基在FMDV感染过程中的作用机制奠定了基础.     

小鼠IL-1α多克隆抗体的制备及应用

目的:构建小鼠白细胞介素-1α原核表达载体,表达并纯化IL-1α蛋白,制备兔抗鼠IL-1α多克隆抗体,并对抗体特性进行初步的鉴定。方法:利用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠脾脏cDNA中扩增出IL-1α的全长基因,酶切后连接至pET32a(+)原核表达载体,重组载体测序正确后转化至BL21(DE3)大肠杆菌。利用蛋白质原核表达自动诱导方案成功表达重组蛋白。重组蛋白经电洗脱纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗小鼠IL-1α的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。Western blot和流式细胞术(FCM)检测抗血清的特异性。结果:成功构建了重组表达载体pET32a(+)-IL-1α,表达的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,得到的多克隆抗体ELISA显示抗体效价可达1∶25 600。Western blot和FCM分析该抗体能特异性结合IL-1α。结论:利用重组的IL-1α蛋白成功制备了高效价、高特异性的兔抗IL-1α抗体,为进一步研究IL-1α的生物学功能奠定了基础。     

分泌型ICOS-mIg重组融合蛋白定量检测方法的建立和应用

目的:建立双抗体夹心ELISA法,定量检测重组可诱导共刺激分子(ICOS)-mIg融合蛋白的分泌型表达,并对其灵敏度、特异性及线性检测范围进行评价。方法:用分子生物学技术制备重组ICOS-mIg融合蛋白。以羊抗小鼠IgG为包被抗体,HRP标记的马抗小鼠IgG为检测抗体,通过配对试验、方阵滴定试验及绘制mIgG浓度与A450值的标准曲线,建立定量检测重组ICOS-mIg融合蛋白的双抗体夹心ELISA法。结果:建立了双抗体夹心ELISA法,检测的线性范围为7.8~500μg/L,标准曲线的回归方程为:y=-0.7864 1.1635log(x),R2=0.9911,P<0.0001。应用该方法可快速检测哺乳动物细胞表达的重组ICOS-mIg融合蛋白的分泌量。结论:建立了一种可快速定量检测重组ICOS-mIg融合蛋白分泌表达的双抗体夹心ELISA法。该法灵敏、准确、快速、实用性好,对优化ICOS-mIg融合蛋白表达细胞的筛选和大规模制备具有重要价值。     

EGFRvIII/PEP-3 cDNA与HBcAg重组基因原核表达载体的构建、表达与免疫分析

目的:构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒,进行原核表达、纯化,观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法:通过双酶切从pGEM-TEasy/PEP-3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段,插入去除了主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/c-PEP-3-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a( )中,通过IPTG诱导蛋白表达,利用Ni2 -NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化;用融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、序列测定证实融合基因已插入pET28a( )载体中,融合基因序列与设计序列完全一致。原核表达后表达量占沉淀全菌蛋白的56%,纯化产物占总蛋白的92%,浓度约8g/L。BALB/c小鼠经4次免疫后,其血清中中和抗体的滴度可达1∶16000,第6次免疫后血清中中和抗体的滴度达到1∶2.56×105,抗PEP-3抗体滴度达到1∶1.28×105,抗HBcAg抗体滴度小于1∶4×103。结论:融合基因PEP-3-HBcAg在大肠杆菌中可获得高效表达,表达的融合蛋白可以诱导小鼠产生高滴度和高特异性中和抗体,从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。